[工学]第九章细胞重组与动物克隆
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《细胞工程克隆动物》课件
中国：禁止克隆人类，但 允许克隆动物用于科学研 究和医疗目的
日本：允许克隆动物用于 科学研究和医疗目的，但 禁止克隆人类
克隆动物的安全性和可靠性
克隆动物的基因稳定性：克隆动 物的基因是否与原动物完全一致
克隆动物的寿命问题：克隆动物 的寿命是否与原动物相同
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克隆动物的健康问题：克隆动物 是否存在健康隐患
生态旅游：克隆技术可以创造更多的生态旅游项目，提高公众对濒危物种保护的认识和 参与度。
克隆动物对人类社会的意义和影响
医学研究：克隆动物可以用于医学研究，如疾病模型、药物试验等 生物技术：克隆动物可以用于生物技术研究，如基因编辑、细胞治疗等 环境保护：克隆动物可以用于环境保护，如濒危物种保护、生态修复等 农业发展：克隆动物可以用于农业发展，如优质品种培育、畜牧业发展等
善品质等
克隆技术在 环境保护领 域的应用： 如濒危物种 保护、生态
修复等
克隆技术在 生物技术领 域的应用： 如基因编辑、 生物制药等
克隆技术的 伦理和法律 问题：如克 隆人的伦理 问题、知识 产权保护等
克隆技术的 未来发展趋 势：如技术 进步、应用 领域拓展等
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汇报人：PPT
克隆动物的社会接受度：公众对 克隆动物的接受程度如何
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克隆动物的应用前景和价值
克隆动物在医学上的应用前景
器官移植：克隆动物可以提供与人类相匹配的器官，解决器官移植的 供体短缺问题
疾病研究：克隆动物可以用于研究人类疾病的发病机制和治疗方法
药物研发：克隆动物可以用于药物的筛选和测试，提高药物研发的效 率和安全性
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细胞工程克隆动物
细胞重组与克隆技术
8.14细胞重建
细胞重建的概念是我国贝时璋院士提出的。 定义：体内已经存在的某种物质，可以由细胞质，甚
至细胞外的某种基质为基地，通过自组织、自装配过 程，一步步地形成完整的细胞。 早在20世纪30年代，贝教授在一种甲壳类动物—南京 丰年虫的二倍体雌虫卵母细胞中首次发现了细胞重建 的现象。 细胞重建的发现，证明细胞分裂不是细胞繁殖的唯一 途径，它可能是现代生物体内对地球细胞起源的反映， 是简单的生命形态进化为细胞的漫长过程的一个缩影， 有助于对生命进化过程的阐述
8.13细胞核移植
核移植起始于用微吸管对阿米巴等原生动物进 行的核操作。
在1952年，美国人罗伯特·布里格斯和T·J·金， 首先利用两栖类卵细胞建立细胞核移植技术。 由于两栖类的蛙卵数量较多，体积较大，容易 获得，操作方便。
1958—1962年，英国剑桥大学的约翰·格登教 授和麦金尼尔利用瓜蟾原肠内胚层细胞核移植， 培育出可育的非洲瓜蟾。
首先是核移植过程中要分离得到供体细胞和作 为受体细胞的卵细胞 。
其次要取处在适当发育阶段及细胞周期的受体 和供体细胞，受体细胞和供体细胞处于细胞周 期中的同一时期 ，核移植成功的几率最大。
受体细胞在细胞周期中所处的时间对转核实验 成功与否的影响要大于供体细胞所处的时间的 影响，一般取G2期进行核移植的效果都较好。
重于泰山，轻于鸿毛。01:21:4501:21:4501:21Thursday, November 05, 2020
安全在于心细，事故出在麻痹。20.11.520.11.501:21:4501:21:45November 5, 2020
加强自身建设，增强个人的休养。2020年11月5日上 午1时21分20.11.520.11.5
另外，细胞诱导分裂成熟的因子（MPF）的活 性有关。
细胞重组技术及克隆
Ⅲ.细胞核移植：常用的核移植方法有两 种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质 内注射是用一个外径5～8μm 的注核针吸 取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的 方法。透明带下注射则是把供体细胞核注 射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中， 核移植后用电刺激进行细胞融合。
直接注射法制作重组胚过程
Ⅳ.激活：卵母细胞的激活涉及的因素 很多，无论是受精引起的卵母细胞激活 还是人工的激活，都会引起卵母细胞发 生一系列的反应，这些反应是胚胎发育 所必需的。其激活原理是通过电刺激、 钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII 期中解放出来，并转到“受精”的状态
近年来我国核移植技术的发展
克隆的层次
A.分子水平上的-----基因克隆 重组载体通过宿主细胞的无性繁殖使目的基因扩增， 再用某探针选取、钓取目的基因。 B.细胞水平上的------细胞系的培养（制备单克隆 抗体） 单克隆抗体：利用动物细胞融合技术将骨髓瘤细胞和 能产生抗体的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，再去 培养，筛选到杂交瘤细胞系。 C.在个体水平上------繁殖出生物个体 不通过两性细胞的结合，从一个单一的细胞繁殖出生 物个体。即细胞 ------- 个体
Ⅰ.促进生物学基础问题的研究 Ⅱ.加速良种繁育，保护濒危动物 Ⅲ.培育转基因克隆动物，生产生物 药品 Ⅳ.与基因和干细胞技术结合，开展 治疗性克隆
14.3 动物克隆技术的意义及展 望
治疗性克隆
长期以来，围绕克隆的争论主要在两种 目的不同的克隆研究之间展开，也就是 生殖性克隆和治疗性克隆。生殖性克隆 是指克隆出一个完整的人，大多数国家 和地区都旗帜鲜明地予以反对。然而对 于治疗性克隆这种以治病救人为目的的 研究，虽然有着比较高的支持率，但也 存在着不同的声音。
9细胞拆分重组与克隆技术2
聚核糖体的分离
• 核糖体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核 酸蛋白颗粒， 酸蛋白颗粒，附着在粗面内质网的称固着 核糖体，分散在细胞内的称游离核糖体， 核糖体，分散在细胞内的称游离核糖体， 数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核 糖体， 糖体，一般用差速离心法可分离出聚核糖 体。
微粒体分离
• 微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡，含核 微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡， 糖核酸，蛋白质和脂类， 糖核酸，蛋白质和脂类，分离微粒体的方 法是利用分级离心法， 法是利用分级离心法，去掉细胞核和线粒 体后，经超速离心而制备。 体后，经超速离心而制备。
• (6)沉淀物悬浮于240ml溶液B中，以2000g离心10 (6)沉淀物悬浮于240ml溶液B 2000g离心 离心10 沉淀物悬浮于240ml溶液 分钟。 分钟。 • •(7)弃上清，沉淀物悬浮于190ml溶液C中，取6支 (7)弃上清 190ml溶液 (7)弃上清，沉淀物悬浮于190ml溶液C 超速离心管，每管加5mL溶液C 5mL溶液 超速离心管，每管加5mL溶液C，然后把细胞核悬 液铺在溶液C上层， 25000r/min离心60分钟 离心60分钟。 液铺在溶液C上层，以25000r/min离心60分钟。 • •(8)弃去上清，用溶液A轻轻荡洗管壁及沉淀物表 (8)弃去上清 (8)弃去上清，用溶液A 面两次，将离心管倒置，用滤纸擦干管口。 面两次，将离心管倒置，用滤纸擦干管口。 • •(9)向离心管底部滴加几滴溶液A，用玻璃棒轻轻 (9)向离心管底部滴加几滴溶液 (9)向离心管底部滴加几滴溶液A 搅匀，然后补加30mL溶液A 30mL溶液 搅匀，然后补加30mL溶液A。 • •(10)以2000g离心20分钟，弃上清液，沉淀物为 (10)以 离心20分钟， (10) 2000g离心20分钟 弃上清液， 纯化的肝细胞核。 纯化的肝细胞核。
《动物克隆》PPT课件
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2.2 受体胞质的选择和处理
2.2.1 卵母细胞在动物克隆中的作用
在克隆中，供核细胞的全能性是基础，但这种全能性 只有在特定的条件下才能实现。这一特定条件就是卵 母细胞。研究发现：早期胚胎的发育首先是由母型信 息调控（maternal regulation）的，直到合子型基因 被 激 活 ， 才 能 过 渡 到 合 子 型 调 控 （ zogotic regulation）。也就是要经过由母源控制向合子型控 制胚胎发育的转变（maternal-zygotic transition, MZT）。
目前一般以排出第一极体作为卵母细胞成熟 的标志。
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2.2.5 卵母细胞的激活
成熟后的卵母细胞停滞于MⅡ期，自然条件下， 当精子穿入（受精）后会激活卵母细胞，启动一 系列生化事件和形态变化。
面对问题：核移植胚是怎样被激活的？
解决途径：
途径一：电激活。电脉冲剌激是最经典、应用最 为广泛的卵母细胞激活方式。细胞膜在瞬间高压 电流脉冲的作用下，激发穿孔，从而使细胞内外 的离子和大分子物质发生短暂流动，其中钙离子 的内流会导致卵母细胞活化。
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途径二：化学物质激活。包括乙醇、钙离子载 体A23187（Calcium ionophore A23187, CaA）、 离 子 霉 素 （ Ionomycin）、Sr2+、 Thimerosal(THI) 、Dithiothreitol(DTT)、三 磷 酸 肌 醇 、 精 子 因 子 （ sperm factor, SF） （精子的提取物）。
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1938年，Hans Spermann提出了克隆动物的设想：从一 个分化细胞中提取细胞核，然后注入另一个去核的受 精卵中构建新胚胎，他同时提出用体细胞进行动物克 隆的思想，但一直未能付诸实施。
Ch6-细胞重组与克隆动物.ppt
指无性繁殖的操作过程。如，把××克隆；外延作形 容词形容无性繁殖的产物。如，克隆羊。
☉现在习惯上把DNA分子、基因片段、单克隆抗体 的复制也认为是克隆。
☉1977年，世界卫生组织将克隆定义为遗传上同一 的机体或细胞系（株）的无性生殖。
2 哺乳动物的克隆方法
（1）胚胎分割法 将未着床的早期胚胎采用显微手术分为若干等
一、细胞重组
1.细胞拆合
☉细胞拆合即细胞组分的分离与融合，是指将细
胞分为核和质两部分，还包括微细胞的诱导和中期 染色体的分离。
☉诱导核质分离和产生微细胞需用特殊的试剂— —松胞素B。
松胞素B又称细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)。 是一种真菌的代谢产物。1967年发现CB可以诱导离 体培养的小鼠L细胞去核。
2.细胞组分的分离
☉ 胞质体（cytoplast）指去核后的细胞。能保
持细胞的原形，具有除核以外的细胞器，不能合成
DNA和RNA，但能合成蛋白质。 ☉ 核体（karyoplast）或称小细胞
（minicells），指细胞分离出来的核。外包有质膜 和少量细胞质，在一段时间内能合成DNA和RNA。
☉ 微细胞（micocells）秋水仙素将细胞分裂阻
图6-2 微细胞的形成（一）
图6-3 微细胞的形成（二）
☉ 重组细胞(reconstituted cell)——用一种细胞的胞 质体与另一种细胞的核体融合而产生。
重组细胞的鉴定方法： ¤ 放射性同位素标记法 用3H-TdR标记细胞核供体，用3H-Leu标记细
胞质供体。 融合细胞作放射自显影，如果胞质和胞核都有
（4）关键技术——饥饿法 正当伊尔门泽进行的哺乳动物核移植试验在困难
的停滞时期，马萨诸塞大学年仅29岁的基恩•坎贝尔博
☉现在习惯上把DNA分子、基因片段、单克隆抗体 的复制也认为是克隆。
☉1977年，世界卫生组织将克隆定义为遗传上同一 的机体或细胞系（株）的无性生殖。
2 哺乳动物的克隆方法
（1）胚胎分割法 将未着床的早期胚胎采用显微手术分为若干等
一、细胞重组
1.细胞拆合
☉细胞拆合即细胞组分的分离与融合，是指将细
胞分为核和质两部分，还包括微细胞的诱导和中期 染色体的分离。
☉诱导核质分离和产生微细胞需用特殊的试剂— —松胞素B。
松胞素B又称细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)。 是一种真菌的代谢产物。1967年发现CB可以诱导离 体培养的小鼠L细胞去核。
2.细胞组分的分离
☉ 胞质体（cytoplast）指去核后的细胞。能保
持细胞的原形，具有除核以外的细胞器，不能合成
DNA和RNA，但能合成蛋白质。 ☉ 核体（karyoplast）或称小细胞
（minicells），指细胞分离出来的核。外包有质膜 和少量细胞质，在一段时间内能合成DNA和RNA。
☉ 微细胞（micocells）秋水仙素将细胞分裂阻
图6-2 微细胞的形成（一）
图6-3 微细胞的形成（二）
☉ 重组细胞(reconstituted cell)——用一种细胞的胞 质体与另一种细胞的核体融合而产生。
重组细胞的鉴定方法： ¤ 放射性同位素标记法 用3H-TdR标记细胞核供体，用3H-Leu标记细
胞质供体。 融合细胞作放射自显影，如果胞质和胞核都有
（4）关键技术——饥饿法 正当伊尔门泽进行的哺乳动物核移植试验在困难
的停滞时期，马萨诸塞大学年仅29岁的基恩•坎贝尔博
2.2.3 动物体细胞核移植技术和克隆动物(课件)高二生物(人教版2019选择性必修3)
一、动物体细胞核移植技术—过程
早期胚胎
（5）动物体细胞核移植技术证明了？ （原理）
该技术证明了：已分化的动物体细胞的 细胞核具有全能性。
受体(代孕)母牛体内
生出与供体奶牛遗传 物质基本相同的犊牛
克隆动物
（6）从遗传物质的角度来分析，克隆动物 是对体细胞供体动物进行了100%的 复制吗？
克隆动物细胞核的遗传物质来自供体动 物，但细胞质中的遗传物质同时来自供 体细胞和受体卵母细胞；此外生物性状 还受环境因素的影响。
生出与供体奶牛遗传 物质基本相同的犊牛
将胚胎移入受体 （代孕）母牛体内
二、体细胞核移植技术的应用前景
（1） 在畜牧生产中 加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。
二、体细胞核移植技术的应用前景
（2） 在医药卫生领域
①通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转 基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；
①通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核 移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物 反应器，生产许多珍贵的医用蛋白； ②在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、 组织或器官可以作为异种移植的供体； ③以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞， 经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官， 将它们移植给患者时可以避免免疫排斥反应。
5 非人灵长类动物体细胞核移植困难的原因 ①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复 其 分化 前的功能状态，这导致了胚胎发育率低； ②对非人灵长类动物 胚胎 进行操作的技术尚不完善。
一、动物体细胞核移植技术—过程
（1）材料：
采集卵母细胞，在 体外培养到MⅡ期
去核：显微操作
高产奶牛(供体)
取体细胞
细胞重组与克隆
4
二、细胞重组技术： （一）几个定义： 胞质体：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 微质体：植物去核原生质。 核体：在细胞去核过程中，分离出的核带有少量胞
质并围有质膜称为核体。 微细胞（微核体）：指含有一条或几条染色体（即
只含一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个 完整质膜的核质体。
5
（二）细胞重组的几种形式： （1）胞质杂种 （2）微细胞异核体 （3）重组细胞（核移植技术）：将一个
10
（3）细胞电泳
在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷， 能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为 细胞电泳（cell electrophoresis）。各种细胞或 处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同， 故在一定的电场中的泳动速度不同。不同类型的 细胞在电场中的泳动速度不同，可用来分离不同 种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分 开。
这种微细胞仅含有一个或数个染色体的dna也是细胞拆合工程的一种有用材2829六动物细胞的重组及细胞质杂交用上述方法从活细胞中拆散出来的胞质体核体微细胞为材料通过显微操纵术在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合加人病毒或化学物质如聚乙二醇peg等融合因子经过一段时间的作用可以把它们重新装配成新的活细胞
26
3、微细胞 秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有
丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配， 而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体 外培养，在单个染色体或染色体周缘就 会重现核膜而形成含有一个微核、一薄 层细胞质和一个完整质膜的微细胞。这 种微细胞仅含有一个或数个染色体的 DNA，也是细胞拆合工程的一种有用材 料。
24
2、核体制备
防止夹杂完整细胞和胞质体。 1. 预离心，可去除贴壁不牢的完整细胞。 2.可在去核处理后，收集样品，接种于培养皿 内，温育l-2h，重复l-2次，可从上清液中收 集得到较纯净的核体。 3.采用梯度密度离心法，去除胞质体。 可使核体的纯度高达99％。
二、细胞重组技术： （一）几个定义： 胞质体：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 微质体：植物去核原生质。 核体：在细胞去核过程中，分离出的核带有少量胞
质并围有质膜称为核体。 微细胞（微核体）：指含有一条或几条染色体（即
只含一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个 完整质膜的核质体。
5
（二）细胞重组的几种形式： （1）胞质杂种 （2）微细胞异核体 （3）重组细胞（核移植技术）：将一个
10
（3）细胞电泳
在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷， 能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为 细胞电泳（cell electrophoresis）。各种细胞或 处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同， 故在一定的电场中的泳动速度不同。不同类型的 细胞在电场中的泳动速度不同，可用来分离不同 种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分 开。
这种微细胞仅含有一个或数个染色体的dna也是细胞拆合工程的一种有用材2829六动物细胞的重组及细胞质杂交用上述方法从活细胞中拆散出来的胞质体核体微细胞为材料通过显微操纵术在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合加人病毒或化学物质如聚乙二醇peg等融合因子经过一段时间的作用可以把它们重新装配成新的活细胞
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3、微细胞 秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有
丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配， 而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体 外培养，在单个染色体或染色体周缘就 会重现核膜而形成含有一个微核、一薄 层细胞质和一个完整质膜的微细胞。这 种微细胞仅含有一个或数个染色体的 DNA，也是细胞拆合工程的一种有用材 料。
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2、核体制备
防止夹杂完整细胞和胞质体。 1. 预离心，可去除贴壁不牢的完整细胞。 2.可在去核处理后，收集样品，接种于培养皿 内，温育l-2h，重复l-2次，可从上清液中收 集得到较纯净的核体。 3.采用梯度密度离心法，去除胞质体。 可使核体的纯度高达99％。
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2020/11/29
9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
• （1934年成功进行了单细胞动物核移植操作。） • 1938年（Hans Spemam）：提出“8细胞期以前的
细胞核具发育的全能性”，构想实验：将胚胎细胞 核移入去核的卵内。但因技术原因未完成。 • 1952年（Robert Brrigs 和T.J.King）：豹蛙囊胚细 胞核移入去核卵内，获得可摄食的幼体。1955年， 移入卵母细胞，获得蝌蚪，甚至成体蛙。
• （1）受精卵核融合前，去掉精核，细胞松弛素B处 理；（B：细胞排出细胞核形成胞质体和核质体 ）
• （2）经处理后，卵染色体复制后出现两个核，在 进行培养；
• （3）卵中双核自动融合，并进行分裂； • （4）胚胎移植； • （5）生产出7只单亲小鼠。（只有母本的染色体）
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9.3 哺乳类的细胞核移植
2020/11/29
9.3 哺乳类的细胞核移植 • 其技术的发展和成功，经历的是一个艰难
曲折的过程。 • 哺乳动物卵：体积小，鼠——80μm左右，
兔125，牛140，人100。必须在很精密仪 器——显微操作仪下才能进行核移植。
2020/11/29
9.3 哺乳类的细胞核移植
• 1977年（美国）：“亚无性繁殖”培育出单亲小鼠 ：
• 哺乳动物细胞核移植实验（1981年，瑞士和美国 ）的成功：小鼠囊胚内细胞团细胞核移入去核受 精卵中，培养，胚胎移植，产下2雌1雄仔鼠，并 发育成可育个体。
细胞松弛素B：体外培养细胞能诱发其排核。借助 细胞松弛素B的作用，结合高速离心得到胞质体 。 2.核体 与胞质分离的得到的细胞பைடு நூலகம்，带有少量胞质并围 有质膜，成为核体。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
3.微细胞 秋水仙素处理。 经体外培养，在单个染色体或染色体周缘会重现 核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个 完整质膜的微细胞。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
3.化学裂解法 在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸纳 等使细胞膜裂解。常辅以机械方法。
4.高速组织捣碎法 借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破碎。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 细胞重组常用的材料： 1.胞质体
鲤鱼去核未受精卵，实现核质杂交，培育出“鲤鲫 核鱼”（有鲫鱼的鲜美味道和鲤鱼的快速生长）。
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
• 鱼类、两栖类核移植技术的建立，为今天的哺乳动 物体细胞克隆打下良好的基础。
• 但当时许多科学家认为：两栖类本身的某些特殊条 件使其成功，而哺乳类的核移植几乎是不可能的。
第九章 细胞重组与动物克隆
2020/11/29
9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 细胞重组（cell reconstruction）：体外不同来源的 细胞器及细胞组分重组成具有生物活性的细胞或细 胞器的技术。
• 细胞拆合：分离细胞核与细胞质（或移去核、射线 使核失活）将同种或异种细胞核和细胞质重新组成 新细胞，从而培养新细胞或新生物个体。
• 细胞重组的三种基本方式： • 胞质杂种（cybrid）：胞质体与完整细胞重组； • 微细胞异核体（herterokaryon）：微细胞与完整细
胞重组成微细胞异核体； • 核质杂种细胞：胞质体与核体重组成核质杂种细胞
。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 胞质体（cytoplast）：去核后的无核细胞。通过核 移植技术制备。
• 我国童第周等（1961年开始）：鱼类（金鱼等 ）不 同亚科间细胞核移植，研究核的发育功能、核质关 系。1978年将黑斑蛙成体红细胞核移入未受精卵内 ，发育成正常蝌蚪。（说明高度分化的细胞仍保留 着物种的全部基因）
• 1979年水生所：鲫鱼，获得幼鱼，发育正常。 • 1989年（童第周、牛满江）：鲫鱼胚胎细胞核移入
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
在显微解剖镜下，将细胞置于消毒的培养液中，同 时在器皿的周围围以冰块或置于冷却系统中以减 慢细胞发育。借助显微操作仪，用细微玻璃针或 微吸管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中，可 以挑去细胞核，人工造就去核细胞。
这种仪器能进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物 质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位 的变化等等。
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
• 1958——1962年（英国剑桥大学）：爪蟾原肠内胚
层细胞核移植，培育出可育的成体。1970年（约翰· 格登）用蛙，获得了蝌蚪。
• 蛙和蟾蜍实验证明：分化细胞的核具全能性；细胞 分化不需遗传物质的不可逆修饰。
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
3.流式细胞仪分离法 以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然 后用超声波处理使其分散成单个细胞。将细胞悬浮液 通过直径为50μm的喷嘴变成极小微粒，每个微粒含有 一个细胞，以10m/s的速度喷出。激光照射，荧光被 激发而转换成脉冲。依脉冲分离细胞。或施加电场使 细胞移行偏斜的程度不同而收集不同的细胞。
优点：分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能； 缺点：需要专门的设备。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 细胞破碎方法： 1.超声波破碎法
超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传 送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击产生的 剪切刀使细胞破碎。（缺点：热产生） 2.反复冻存法 细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内 冷冻后，在37℃复融化，重复此操作3~4次使细 胞壁破碎。
• 微质体或亚原生质体（miniprotoplast or subprotoplast） ：植物去核的原生质体。
• 微细胞（microcell）：具有一或几条染色体、一薄 层细胞质和完整细胞质膜的核质体。制备：秋水仙 素——产生多个有核膜的微核；细胞松弛素B—— 微核突出到细胞膜外；离心——微细胞（一个微核 和一薄层细胞质以及完整细胞质膜）。
9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
• （1934年成功进行了单细胞动物核移植操作。） • 1938年（Hans Spemam）：提出“8细胞期以前的
细胞核具发育的全能性”，构想实验：将胚胎细胞 核移入去核的卵内。但因技术原因未完成。 • 1952年（Robert Brrigs 和T.J.King）：豹蛙囊胚细 胞核移入去核卵内，获得可摄食的幼体。1955年， 移入卵母细胞，获得蝌蚪，甚至成体蛙。
• （1）受精卵核融合前，去掉精核，细胞松弛素B处 理；（B：细胞排出细胞核形成胞质体和核质体 ）
• （2）经处理后，卵染色体复制后出现两个核，在 进行培养；
• （3）卵中双核自动融合，并进行分裂； • （4）胚胎移植； • （5）生产出7只单亲小鼠。（只有母本的染色体）
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9.3 哺乳类的细胞核移植
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9.3 哺乳类的细胞核移植 • 其技术的发展和成功，经历的是一个艰难
曲折的过程。 • 哺乳动物卵：体积小，鼠——80μm左右，
兔125，牛140，人100。必须在很精密仪 器——显微操作仪下才能进行核移植。
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9.3 哺乳类的细胞核移植
• 1977年（美国）：“亚无性繁殖”培育出单亲小鼠 ：
• 哺乳动物细胞核移植实验（1981年，瑞士和美国 ）的成功：小鼠囊胚内细胞团细胞核移入去核受 精卵中，培养，胚胎移植，产下2雌1雄仔鼠，并 发育成可育个体。
细胞松弛素B：体外培养细胞能诱发其排核。借助 细胞松弛素B的作用，结合高速离心得到胞质体 。 2.核体 与胞质分离的得到的细胞பைடு நூலகம்，带有少量胞质并围 有质膜，成为核体。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
3.微细胞 秋水仙素处理。 经体外培养，在单个染色体或染色体周缘会重现 核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个 完整质膜的微细胞。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
3.化学裂解法 在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸纳 等使细胞膜裂解。常辅以机械方法。
4.高速组织捣碎法 借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破碎。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 细胞重组常用的材料： 1.胞质体
鲤鱼去核未受精卵，实现核质杂交，培育出“鲤鲫 核鱼”（有鲫鱼的鲜美味道和鲤鱼的快速生长）。
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
• 鱼类、两栖类核移植技术的建立，为今天的哺乳动 物体细胞克隆打下良好的基础。
• 但当时许多科学家认为：两栖类本身的某些特殊条 件使其成功，而哺乳类的核移植几乎是不可能的。
第九章 细胞重组与动物克隆
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 细胞重组（cell reconstruction）：体外不同来源的 细胞器及细胞组分重组成具有生物活性的细胞或细 胞器的技术。
• 细胞拆合：分离细胞核与细胞质（或移去核、射线 使核失活）将同种或异种细胞核和细胞质重新组成 新细胞，从而培养新细胞或新生物个体。
• 细胞重组的三种基本方式： • 胞质杂种（cybrid）：胞质体与完整细胞重组； • 微细胞异核体（herterokaryon）：微细胞与完整细
胞重组成微细胞异核体； • 核质杂种细胞：胞质体与核体重组成核质杂种细胞
。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 胞质体（cytoplast）：去核后的无核细胞。通过核 移植技术制备。
• 我国童第周等（1961年开始）：鱼类（金鱼等 ）不 同亚科间细胞核移植，研究核的发育功能、核质关 系。1978年将黑斑蛙成体红细胞核移入未受精卵内 ，发育成正常蝌蚪。（说明高度分化的细胞仍保留 着物种的全部基因）
• 1979年水生所：鲫鱼，获得幼鱼，发育正常。 • 1989年（童第周、牛满江）：鲫鱼胚胎细胞核移入
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
在显微解剖镜下，将细胞置于消毒的培养液中，同 时在器皿的周围围以冰块或置于冷却系统中以减 慢细胞发育。借助显微操作仪，用细微玻璃针或 微吸管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中，可 以挑去细胞核，人工造就去核细胞。
这种仪器能进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物 质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位 的变化等等。
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
• 1958——1962年（英国剑桥大学）：爪蟾原肠内胚
层细胞核移植，培育出可育的成体。1970年（约翰· 格登）用蛙，获得了蝌蚪。
• 蛙和蟾蜍实验证明：分化细胞的核具全能性；细胞 分化不需遗传物质的不可逆修饰。
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
3.流式细胞仪分离法 以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然 后用超声波处理使其分散成单个细胞。将细胞悬浮液 通过直径为50μm的喷嘴变成极小微粒，每个微粒含有 一个细胞，以10m/s的速度喷出。激光照射，荧光被 激发而转换成脉冲。依脉冲分离细胞。或施加电场使 细胞移行偏斜的程度不同而收集不同的细胞。
优点：分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能； 缺点：需要专门的设备。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 细胞破碎方法： 1.超声波破碎法
超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传 送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击产生的 剪切刀使细胞破碎。（缺点：热产生） 2.反复冻存法 细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内 冷冻后，在37℃复融化，重复此操作3~4次使细 胞壁破碎。
• 微质体或亚原生质体（miniprotoplast or subprotoplast） ：植物去核的原生质体。
• 微细胞（microcell）：具有一或几条染色体、一薄 层细胞质和完整细胞质膜的核质体。制备：秋水仙 素——产生多个有核膜的微核；细胞松弛素B—— 微核突出到细胞膜外；离心——微细胞（一个微核 和一薄层细胞质以及完整细胞质膜）。