纳豆激酶集成化分离技术
中科院力学所科技成果——低成本高纯度纳豆激酶的生产技术
中科院力学所科技成果——低成本高纯度纳豆激酶
的生产技术
技术介绍及特点
以由黄豆或鹰嘴豆等发酵得到的粗品纳豆激酶作为原料，通过批量结晶纯化的方法获得高纯度纳豆激酶，具有的技术特点如下：（1）工艺简单
在粗品纳豆激酶溶液中通过加入多种环境友好的试剂，在室温条件下经搅拌、静置生长一段时间（2-5天）后，粗品纳豆激酶中的杂质留在溶液中，溶液中的固体为纳豆激酶晶体。
简单固/液分离后即可得到高纯度纳豆激酶。
高纯度纳豆激酶生产工艺适宜于工业化生产。
（2）产品纯度高
纳豆激酶晶体纯度不低于80%。
实验室制备的10ml级纳豆激酶晶体溶液（左图）
纳豆激酶晶体照片（右图）
（3）产品成本低
公司单价（元/g）
大和公司（日本）：84
和光纯药公司（日本）：130
燕京啤酒（中国）：124
我们制备的高纯纳豆激酶：40
备注：其他公司的产品非高纯纳豆激酶。
应用领域及前景分析
应用领域：特膳食品、功能性食品、保健品等。
前景分析：国内预制食品产业达到1万亿。
特膳食品属于功能性预制食品，目前正处于市场的起步阶段，纳豆激酶特膳食品在预制食品应用市场上是个空白，因此将有巨大的市场空间。
知识产权情况
结晶纯化工艺目前作为商业秘密，未申请专利。
检索国内外文献，未能检索到相关的纯化工艺报道，也未能检索到高纯纳豆激酶的工业化生产的报道。
纳豆激酶分离纯化技术的研究
山 东 轻 工 业 学 院 学 报 JOURNAL OF SHANDONG INSTITUTE OF LIGHT INDUSTRY
文章编号 :1004 - 4280 (2008) 03 - 0024 - 04
纳豆激酶分离纯化技术的研究
0 引言
纳豆激酶 (Nattokinase ,NK) 是日本学者须见洋 行从日本食品纳豆中纯化分离出的一种具有溶血栓 功能的丝氨酸蛋白酶 ,它是由枯草杆菌 ———纳豆菌 ( Bacillus natto) 发酵大豆后所产的酶[1] 。由于 NK 作 用迅速 ,维持时间长 ; 源于食品 ,安全性好 ; 分子量 小 ,是一个单链蛋白质 ,更易被人体消化道吸收 ;对 纤维蛋白的作用机制不同于尿激酶等现用于临床的 药物 ,它同其他纤溶酶一样直接作用于纤维蛋白 ,同
Phenyl Sepharose 疏水柱层析 Sephadex G2150 凝胶过滤层析 Sephadex G2100 凝胶过滤层板
第 22 卷
SDS - PAGE 测得 分子量ΠkDa
—
28 28 28 和 38
纯化倍数酶率活Π回%收
①4. 75 ②1. 32
—
①74. 3 ②77. 0
—
50
40
产品的生产主要是发酵液经过一系列的分离纯化方
具有操作简便 、可规模化生产及选择性强等特点 ,广 泛应用于规模化工业生产中 。基本工艺流程是离心 除菌 →盐析 (或有机溶剂沉淀) →超滤浓缩 →凝胶过 滤层析脱盐 →离子交换层析或疏水层析 。一般是将 凝胶层析 、疏水层析 、亲和层析和离子交换层析中两 种以上的层析方法配合使用来进行酶的分离 。
膨胀床吸附分离作为一种新型的蛋白质分离纯 化方法 ,其主要原理是根据静电吸附作用 ,将带有相 反电荷的蛋白酶吸附在离子交换柱上 。该分离方法 避免了柱层析分离过程中 ,因复杂的纯化步骤而导致 纳豆激酶失活的缺点 ,具有快速分离纯化的优点。胡 洪波等[17] 对膨胀床分离纳豆激酶过程的各个阶段进 行了考察 ,发酵液中经离心得上清液 ,将粗酶溶液的 pH 值调节至低于其等电点 ,采用 Streamline SP 强离子 交换吸附剂 ,Streamline 25 膨胀床柱 ,XK16 层析柱 ,吸 附时最佳的 pH 为 6. 0 ,电导率应低于 6. 2 msΠcm。然 后进行清洗解吸 ,得到比较纯的纳豆激酶 ,整个分离 过程缩短为 8～10 h ,回收率提高了约 50 %。
纳豆激酶分离纯化的工艺研究 韩超
• 2、把纯化液稀释20 倍点样于纤维蛋白平板，与80 U/mL 尿激酶标准品作对照，具有明显的溶纤效果。具体结果见 图1
出现明显的透明圈， 说明具有明显的溶纤 效果
• 3、按上述方法得到的纳豆激酶纯化液，经SDS-PAGE电 泳，得到一条单一色带（见图2），说明发酵液中的杂蛋 白已基本除掉；与标准蛋白比较，此单一带的分子量在 27~28 kD之间，这与有关文献报道的根据氨基酸序列结 算出的纳豆激酶精确分子量27.782 kD基本相符。
•
4、中试扩大试验按上述的试验方法作适当调
整后进行的中试扩大试验，收集OD280>0.05的 洗脱液。由此获得的纳豆激酶纯化液经广州药物 研究中心检测，纯度大于90% 。
•
5、冷冻干燥 用甘露醇和葡萄糖处理的纳豆激 酶纯化液冷冻干燥后，酶活力都比原来下降了 20~40%，使用甘氨酸处理，则冷冻干燥后的酶 活力仍能保持95% 以上，说明甘氨酸是纳豆激酶 冷冻干燥时很好的保护剂。故最终选取1%甘露醇 和2%甘氨酸作为纳豆激酶冷冻干燥的赋型剂，由 此制作出的纳豆激酶冻干制剂既有漂亮的饼形， 又基本能保持原来的酶活力。
希望大家批评指正！ 谢谢！
结论
• 1、 之前大部分文献报道的纳豆激酶分离纯化方法基本 都要经过硫酸铵沉淀、透析、阴阳离子交换层析或疏水层 析等多步层析（见表3），步骤繁复，时间长，操作工艺 复杂，且多为间歇操作，生产效率难以提高，选择性低， 从而造成纳豆激酶分离纯化的成本很高，也不适宜连续化 的大规模生产。本纯化工艺方法简单，发酵液经离心过滤 后，只需经过一步阳离子交换层析，就能获得纯度较高的 纳豆激酶纯化液。得到的纳豆激酶纯化液加入适当的赋型 剂真空冷冻干燥后，基本上就能出成品，适合在企业的大 规模连续生产中推广应用，从而真正实现科研成果向市场 产品的转化。
纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究
纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究董志奎,杨 超,尹宗宁,李 萌(四川大学华西药学院,四川成都610041) 摘 要:目的研究纳豆激酶分离纯化工艺及酶学性质。
方法纳豆激酶发酵液的粗提物经Superdex 75凝胶色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE )分离纯化,采用T AME 法测定酶的活性,通过S DS 2PAGE 对纯化结果进行了检验。
结果S DS 2PAGE 中显示单一色带,相对分子质量28000,以T AME 为底物时纳豆激酶的米氏常数(K m )为35.47mm ol/L ,最适宜的温度37℃,最适宜pH 为8.6。
结论该分离纯化方法可以得到较纯的纳豆激酶。
关键词:纳豆激酶;分离纯化;酶学性质;米氏常数(K m ) 中图分类号:Q55;T Q464.8 文献标识码:A 文章编号:100521678(2009)0520298204Study on puri fication and enzyme kinetics of nattokinaseDONG Zhi 2kui ,Y ANG Chao ,YI N Z ong 2ning ,LI Meng(West China School o f Pharmacy ,Sichuan Univer sity ,Chengdu 610041,China ) Abstract :Purpose T o study the techniques of the separation and purification of the nattokinase and itscharacterization.Methods The natuokinase extract was purified by gel 2chromatography (Superdex75)and poly 2acrylamide gel electrophoresis (PAGE ).The purified nattokinase was tested by S DS 2PAGE ,and the T AME method was used to determine the activity of the enzyme.R esults There was only one strip in the S DS 2PAGE atlas ,and the m olecular weight of nattokinase was 28kDa.The Michaelis constant (K m )of nattokinase was 35.47mm ol/L when T AME was the substrate ,and the best reaction tem perature was 37℃and the best reac 2tion pH was 8.0.Conclusion Purified nattokinase can be obtained by the the techniques of the separation and purification.K ey w ords :nattokinase ;separation and purification ;characterization ;michaelis constant (K m )收稿日期:2009203225基金项目:国家自然科学基金项目(30371696)作者简介:董志奎(19842),男,药剂专业在读硕士研究生;尹宗宁(19642),女,通信作者,副教授,T el :028*********,E 2mail :yzn @scu. 。
纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究
纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究纳豆是日本的传统大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵而成，在日本已食用近千年。
1987年，须见洋行等经过对上百种食物的筛选，首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。
研究表明，NK 是纳豆发酵过程中纳豆芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白酶[1]。
进一步的研究表明，NKc具有很强的体内外溶栓作用，与传统的容栓剂相比，NKc具有易提取、成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而可能成为新一代的溶栓药物[2-4]。
为了对NKc的开发提供理论依据，本实验室在研究NKc纤溶活性之后，进一步对其体外溶栓和溶血作用进行研究。
1 材料与方法1.1 材料菌株：为本实验室自日本纳豆分离纯化菌种，保存于养琼脂斜面，营养琼脂配方为：细菌培养用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，1%；细菌培养用酵母抽提物(b acto-yeast extract)，0.5%；NaCl,0.5%；细菌培养用琼脂粉(bacto-agar powd er)，1.5%PH7.2。
纳豆、纳豆提取液：按文献[5]介绍方法制备。
血平板：用生理盐水配制1%琼脂，加入新鲜脱纤兔血，混匀倾注平板，冷却凝固即成。
主要试剂：凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶（中国药品生物制品检定所）；蚓激酶(30×104 U•粒-1，北京百奥药业有限责任公司)；牛血清白蛋白(上海生化试剂公司)；低相对分子质量标准蛋白质(兔磷酸化酶：Mr97.4×103,牛血清白蛋白：Mr66.2×103,兔肌动蛋白：Mr43.0×103,牛碳酸酐酶：Mr31.0×103,胰蛋白酶抑制剂：Mr20.1×103,鸡蛋清溶菌酶：Mr14.4×103)（上海生化试剂公司）；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 NKc分离纯化纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分段盐析，离心收集沉淀，用50mmol•L-1磷酸缓冲液（PH 7.4）溶解，充分透析后获得纳豆激酶粗酶（NKc），再经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱（1.0cm×60cm）层析，分管收集纤溶活性较高部分，脱盐，冷冻干燥后获得层析纯纳豆激酶（NKc），SDS-PAGE电泳检测纯度。
纳豆激酶分离纯化研究进展
摘 要 纳 豆 激 酶 是 枯 草 芽 孢 杆 菌 发 酵 过 程 中产 生 的 一种 碱 性 蛋 白酶 ， 具 有 较 强 的溶 栓 作 用 。 与其 他 溶 栓 剂 相
比， 纳 豆 激 酶 易被 吸 收 ， 作用迅速 ， 安全 性好 ， 可 做 为 新 型 溶 栓 剂 。 文 中概 述 了纳 豆 激 酶 的理 化 性 质 和 作 用 机 制 ， 着 重 介 绍 了纳 豆 激 酶 的几 种 常 见 的 分 离 纯 化 方 法 ， 包 括柱层析 法、 超 滤法、 萃取 法和 亲和颗粒 法 ， 以 及 集 成 化 分
进纤 维蛋 白的溶 解 。虽 然 纳 豆 激 酶 对 纤维 蛋 白原 不
敏感 ， 但是 对交 联纤 维 蛋 白裂解 起 有 效 促 进 作 用 ， 并
且 能使 纤溶 酶原 激 活物 抑 制 剂 （ Ｐ Ａ Ｉ ． １ ） 失活 ， 通 过 阻 止 血栓 素形 成来 抑制 血小 板 的聚集 … 。 在 血液 中 纳 豆 激 酶 的纤 溶 活 性 能 保 持 ３ ｈ以
的活 性 。
１ 纳 豆 激 酶 的性 质 及 溶 栓 机 制
１ ． １ 纳 豆激 酶的性 质特 点 纳 豆激酶 是纳 豆 在 发 酵 过程 中产 生 的一 种碱 性 丝氨 酸 蛋 白酶 ， 由２ ７ ５个 氨 基 酸 残基 组 成 ， 分 子 质量 为２ ７ ． ７ ｋ ｕ ， 等电点 ｐ Ｉ 值为８ ． ６ 。虽然 纳 豆 激 酶与 丝氨 酸蛋 白家 族 的许 多 枯草 杆菌 蛋 白酶 的序列相 似 ， 并 且 具有 高度 的 同源性 ， 但是 对底 物表 现 出 了明显 的
胶 囊 的涂层 材 料 后 可 提 高 纳 豆 激 酶对 温度 和 ｐ Ｈ 的 稳定 性 。经 过 ５次反 复冻 融 ， 纳豆激 酶 的活性 仍 可 以保 持 在 ９ ５ ％ 以上 ， 表 明冻 融 对 纳 豆 激 酶 的活 性 影
纳豆激酶_聂光军
文章编号： １０００－１３３６（２００９）01－0134-04纳豆激酶聂光军 岳文瑾（安徽工程科技学院生物化学工程系，芜湖２４１０００）摘要：纳豆激酶是一种枯草杆菌酶，具有较强的纤溶活性和溶栓功能，是一种治疗心脑血管疾病的理想候选药物。
目前，纳豆激酶分离方法、纳豆激酶功能、结构及其应用、纳豆激酶工程菌构建已成为纳豆激酶的研究热点，也成为未来纳豆激酶研究的导向。
关键词：纳豆激酶；基因工程菌中图分类号：Ｑ５５收稿日期： ２００８－０９－２４安徽省高校自然科学基金项目（ＫＪ２００７Ｂ１１４）；芜湖市科技计划重点项目（２００７－１２６）资助作者简介：聂光军（１９７６－），男，硕士，讲师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｏｉｎ－ｕｓ＠１６３．ｃｏｍ；岳文瑾（１９７９－），女，硕士，讲师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｅｗｅｎｊｉｎ＿７９＠１６３．ｃｏｍ目前，全球每年因血栓病致死人数达１２００万人，接近世界总死亡人数的四分之一。
抗血栓药物需求量很大，但临床使用的抗血栓药物普遍存在着稳定性差和药效短等缺点，迫切需要一种低价高效、易吸收、体内半寿期长以及使用方便的治疗心脑血管疾病的药物或保健品。
纳豆激酶（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ， ＮＫ）是一种高效血栓溶解酶，具有较好的纤溶活性和溶栓功能，它源于传统发酵食品，生产工艺简单，安全性高［１］。
因此，世界上很多国家都在研究ＮＫ，其中日本的研究较为广泛深入。
我国很多高校和研究院所也在进行ＮＫ的研究。
近期研究主要包括ＮＫ的酶学性质、结构、功能及其应用研究，以及ＮＫ的提取工艺、工程菌构建等。
１． ＮＫ的稳定性影响ＮＫ稳定性的主要因素有温度、ｐＨ值和金属离子等。
ＮＫ低于４５ ºC 时活性相对稳定，高于６０ºC 逐渐失活，反复冻融５次后，该酶仍能保持９５％以上的活性。
室温下，在ｐＨ ７￣１２范围内较为稳定，ｐＨ ７￣９范围内酶活性最为稳定，但ｐＨ＜５性质则不稳定。
王萍等报道［２］ＮＫ纤溶活性最适ｐＨ为８．０，ｐＨ ６￣１０溶液中４０ ºC 以下基本稳定，ｐＨ＜５失去纤溶活性。
纳豆激酶论文：纳豆激酶地优化、提取分离纯化及基因克隆
纳豆激酶论文：纳豆激酶的优化、提取分离纯化及基因克隆【中文摘要】心脑血管性疾病,具有“发病率高、致残率高、死亡率高、并发症多”等特性。
2005年,世界卫生组织(WHO)调查表明,全世界每年约有1700万人死于心脑血管疾病。
并且随着人类生活水平的提高以及生活压力的增加,而呈现年轻化的趋势,而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病。
所以,血栓的防治已是当务之急。
虽然传统药物在心脑血管及血栓栓塞性疾病防治上疗效显著,但毒副作用严重;而传统大豆发酵食品不仅效果显著且安全无毒,可作为一种具有开发和利用价值的功能性预防保健食品。
据文献记载,纳豆源于中国的豆豉,通过佛教由中国传入日本,日本人均寿命长的原因除了与较为优良的自然环境有关外,更重要的是其膳食结构中,发酵食品特别是消费量最大的纳豆,是日本人长寿的秘方,视为国宝级食品。
寺院喜食大豆是因为其蛋白质含量高达35.3%,而由纳豆菌产出的酶,能使50%的蛋白质变为水溶性,消化率可达80%。
还含氨基酸、维生素、植物性脂肪等。
据科学研究表明,纳豆食品不仅调整胃肠功能明显,还具有治疗感冒、痢疾、胀气、胃肠炎、消化不良、残便、便秘等功效,还有防治糖尿病,抑制血栓的生成和溶解血栓的作用,是一种延年益寿、健康的美容食品。
可以说纳豆是一种自然食品,是人类生活智慧的产物。
1987年日本的Sumi博士首次从日本传统食品纳豆中分离出一种具有强烈纤溶作用的碱性蛋白酶并命名纳豆激酶(nattokinase,NK)。
它不但能直接作用交联纤维蛋白,而且还可激活体内的纤溶酶原,从而表现出很强的溶血栓作用。
据报道其制品具有水解淀粉样蛋白,降低血浆纤维蛋白原的第七因子和第八因子,降低血液粘度、降血脂、降胆固醇,降血压,改善血液循环状态,维持血细胞的正常形态和功能,有利于神经损伤的再生,抑制骨质疏松症、抑制动脉粥样硬化等多种功能。
由于NK具有安全性好、成本低、经口服后可迅速入血,作用时间长,胃肠道稳定性好,可由细菌发酵生产、也可由基因工程菌生产等优点,有望被开发为新一代的口服抗血栓药物用于血栓性疾病的预防和治疗。
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［ １ ］
盐等步骤， 主要差别在于采用的层析的种类、 搭配以及 操作条件的不同。
４ ］ １ ９ ９ ３年 Ｆ ｕ ｊ ｉ ｔ ａ 等［ 首次从固体发酵纳豆中分离纯
从纳豆
中分离 出 了 一 种 丝 氨 酸 蛋 白 酶， 并命名为纳豆激酶 （ ｎ ａ ｔ ｔ ｏ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ， Ｎ Ｋ ） ， 它是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草 Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ ｎ ａ ｔ ｔ ｏ ） 产生的。研究发现， 纳豆激 杆菌（ 酶具有纤溶活性和溶栓能力， 可治疗和预防血栓病， 还 可刺激内皮细胞产生纤溶酶原激活剂（ ｔ Ｐ Ａ ） ， 增强溶
豆激酶的常规分离纯化技术进行了分析， 并对集成化 分离技术进行了系统评述， 以体现集成化分离技术在 生物分离过程中的优势及潜力。
１ 常规分离纯化技术
生物反应的产物一般是由细胞及细胞碎片、 游离 的胞外代谢产物、 胞内代谢产物、 残存底物及惰性组分 等组成的混合液， “ 难度大， 成本高” 是生物分离过程的 显著特点。目前对于纳豆激酶的分离纯化研究很多， 工艺已较成熟。纳豆激酶是胞外酶， 发酵结束时主要 存在于发酵液中， 所以传统的分离路径为： 发酵液离心 除菌， 硫酸铵盐析或有机溶剂沉淀、 离心、 层析纯化、 脱
图 １中的流程经过了 ４次盐析， ３次层析操作。可 见， 常规纳豆激酶分离工艺的显著特点是操作步骤多， 时间长。“ 多步骤” 导致的首要问题是产品收率偏低 （ １ ８ ％～ ５ ０ ％） ， 其次是能耗、 设备投资以及劳力急剧上 升， 导致“ 成本高” 。第三个问题是操作时间长， 这对保 持生物物质的活性十分不利。这些问题使得生产效率
１ １ ］ 为了实现成相聚 合 物 的 有 效 循 环 利 用， Ｌ ｕ等 ［ 采用
图３ 温度诱导双水相金属螯合亲和分离
１ １ ］ 纳豆激酶过程示意图 ［
Ｆ ｉ ｇ ． ３ Ｓ ｃ ｈ ｅ ｍｅｏ ｆ ｂ ｉ ｏ ｓ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｗ ｉ ｔ ｈ
［ １ １ ］ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄｐ ｈ ａ ｓ ｅｓ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ １ ）
ห้องสมุดไป่ตู้
苟金霞 等： 纳豆激酶集成化分离技术
１ ２ １
分离效率和产品的收率。图 ４给出了生物工程产品下 游分离过程的一般处理流程， 以及 Ｅ Ｂ Ａ的分离流程， 图 Ｂ Ａ在下游分离过程中的集成化作用。 中明显体现了 Ｅ
１ ４ ］ 以需要添加适当的盐， 以提高离子强度， 促进吸附 ［ ，
酵液中的纳豆激酶进行了分离纯化， 并与传统分离工 艺进行了比较。结果表明， 对传统分离方法来说， 从发 酵液的预处理到离子 交 换 层 析 一 共 需 要 离 心 去 除 菌 体、 有机溶剂沉淀、 离心收集沉淀、 溶解沉淀、 离心收集 上清液和离子交换层析 ６步操作， 而且处理过程中涉 及到高速冷冻离心设备的使用和大量乙醇的使用， 设 备占用多， 药品的消耗也大。若利用扩张床吸附技术， 则只需要 ２步操作。与传统方法相比， 用扩张床分离 纯化纳豆激酶， 操作步骤从 ６步减少为 ２步， 操作时间 缩短了 ８～ １ ０ ｈ ， 回收率提高了约 ５ ０ ％， 这充分体现了分 离过程集成化的优势。 ２ ． ３ 耐盐性混合模式扩张床吸附技术 扩张床吸附技术的分离对象是含有固体颗粒的发 酵液、 细胞培养液或匀浆液等复杂的粗料液， 其离子强 ０～ ３ ０ ｍ Ｓ ／ ｃ ｍ 。此时， 若采用离子交换型扩 度一般为 １ 张床吸附技术， 由于离子强度过高， 所以必须对粗料液 进行一定比例的稀释， 这样一来， 既增加了过程处理量
Ｆ ｉ ｇ ． ２ Ｓ ｃ ｈ ｅ ｍｅｏ ｆ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎｏ ｆ ｉ ｍｍｏ ｂ ｉ ｌ ｉ ｚ ｅ ｄ ｍｅ ｔ ａ ｌ ｉ ｏ ｎ ｓ ａ ｆ ｆ ｉ ｎ ｉ ｔ ｙｐ ａ ｒ ｔ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎｉ ｎａ ｑ ｕ ｅ ｏ ｕ ｓ ｔ ｗ ｏ ｐ ｈ ａ ｓ ｅ
［ １ ０ ］ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍｓ （ Ａ Ｔ Ｐ Ｓ ）
２ 集成化分离纯化技术
从发展趋势来看， 生物分离技术研究的目的是要 缩短整个下游过程的流程和提高单元操作的效率。分 离技术的高效集成化则使生物分离过程出现一个质的 转变
［ ９ ］
虽然双水相亲和分配技术的纯化倍数较低， 但回 收率相对较高， 关键的是该技术可以实现常规分离流 程中发酵液离心、 硫酸铵或乙醇沉淀以及层析等步骤 的高效集成， 从而缩短了分离时间、 步骤， 提高了分离
２＋ 效率。该法的缺点是 Ｃ ｕ 容易脱落， 对人体形成危害， ２ ＋ ａ 等离子或其他亲和配基（ 如对氨基苯甲 如若采用 Ｃ
， 其含义在于利用已有的和新近开发的生物分
离技术， 将下游过程中的有关单元进行有效组 合 （ 集 成） ， 或者把两种以上的分离技术合成为一种更有效的 分离技术， 达到提高产品收率、 降低过程能耗和增加生 产效益的目标。集成化分离技术在纳豆激酶的分离纯 化方面已有应用， 并高度体现了过程集成化的优势。 ２ ． １ 双水相亲和分配技术 亲和层析法的优点是选择性高、 分离步骤少， 但发 酵液必须经过一系列的前处理才可以上样， 而双水相 分配技术则可以直接处理液固混合物， 所以若将二者 结合起来， 就可形成处理量大、 效率高、 选择性强的双
Ｅ Ｏ Ｐ Ｏ ４ ０ ０ ０ （ 环氧乙烷与环氧丙烷共聚物， 一种温敏型 聚合物） 替代 Ｐ Ｅ Ｇ作为成相组分， 如图 ３所示， 一次分 相后， 分出富含 Ｅ Ｏ Ｐ Ｏ的上相进行温度诱导可实现二 Ｏ Ｐ Ｏ相便 次相分离， 目标物转移进入水相， 回收富含 Ｅ 可循环使用。通过从发酵液中分离纳豆激酶的实验表 明， 总纯化因 子 为 ２ ． ５ ， 收率为 ８ ３ ％， Ｅ Ｏ Ｐ Ｏ和 Ｅ Ｏ Ｐ Ｏ Ｉ Ｄ Ａ的最终收率达到 ７ ５ ％。 ２ ． ２ 扩张床吸附技术 扩张床吸附技术（ Ｅ Ｂ Ａ ） 是一项在产物捕获阶段实 现了过程集成的生物分离技术， 集固液分离、 浓缩和初 期纯化于一个单元操作之中， 能直接从含有固体颗粒 的发酵液、 细胞培养液或匀浆液中捕获目标产物， 从而 减少了操作步骤， 降低了分离过程的复杂程度， 提高了
摘要 综述了纳豆激酶分离纯化技术的研究现状和发展趋势。通过对常规分离技术的分析， 重 点讨论了集成化分离技术的应用及其优势， 包括集成化双水相分配技术、 扩张床吸附技术以及耐 盐性混合模式吸附技术等分离方法， 并指出集成化分离技术在生产纳豆激酶以及其他活性蛋白 方面， 具有广阔的应用前景。 关键词 纳豆激酶 分离纯化 集成化 耐盐吸附 中图分类号 Ｑ ８ １ ９
这样既增加了原料盐的消耗， 增加成本， 又增重了后处 耐盐性混合模式 理的负担， 如图 ４所示。对于此现象， 扩张床吸附技术则体现出了明显的优势。耐盐性混合
１ ５ ］ 模式扩张床吸附技术首次由 Ｂ ｕ ｒ ｔ ｏ ｎ 于１ ９ ９ ７年提出 ［ ，
该技术的吸附剂同时 结 合 有 离 子 交 换 配 基 和 疏 水 配 基， 在低盐浓度下， 配基上的带电基团通过静电作用吸 附目标蛋白， 盐浓度提高后， 疏水基团则提供疏水作用 来吸附蛋 白 质， 从而表现出了明显的耐盐吸附（ ｓ ａ ｌ ｔ ｉ ｎ ｄ ｅ ｐ ｅ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ ａ ｄ ｓ ｏ ｒ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ） 的特性。
收稿日期： ２ ０ ０ ７ ０ ７ ２ ３ 修回日期： ２ ０ ０ ７ １ １ ０ ７ 电子信箱： ｇ ａ ｏ ｄ ＠ｎ ｗ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ 通讯作者，
４ ］ 图１ Ｆ ｕ ｊ ｉ ｔ ａ 分离纯化纳豆激酶的工艺流程 ［ ［ ４ ］ Ｆ ｉ ｇ ． １ Ｓ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｏ ｆ ｎ ａ ｔ ｔ ｏ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅｂ ｙＦ ｕ ｊ ｉ ｔ ａ
２ ］ 。因此纳豆激酶是一种很有潜力的新型口服 栓能力 ［
化了纳豆激酶， 本文以 Ｆ ｕ ｊ ｉ ｔ ａ 的分离工艺为例来说明纳 豆激酶的常规分离方法， 分离流程见图 １所示。
溶栓药物。 近年来， 纳豆激酶的研究和开发越来越受到众多 学者的重视， 相应的分离纯化技术也取得了许多进展，
３ ］ 。本文就目前纳 对此， 国内学者已做了很好的综述 ［
发酵与泡载分离耦合的方法， 使纳豆激酶得到初步纯 化， 再经 超 滤 脱 盐， 脱盐液依次经 Ｃ Ｍ ５ ２柱 层 析 和 Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘＧ ７ ５柱层析， 分离得到了比活为 ９ ８ ０ ０ Ｉ Ｕ／ ｍ ｇ
７ ， ８ ］ 蛋白的纳豆激酶， 回收率为 ８ ５ ． ５ ％。刘俊果等 ［ 则采
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ １ ） ： １ １ ９～ １ ２ ３
纳豆激酶集成化分离技术
苟金霞１ 高 栋２ （ １北方民族大学生命科学与工程学院 银川 ７ ５ ０ ０ ２ １ ２西北大学现代分离科学研究所陕西省重点实验室 西安 ７ １ ０ ０ ６ ９ ）
图４ 扩张床吸附技术在下游分离过程中 集成化示意图 Ｆ ｉ ｇ ． ４ Ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｔ ｅ ｇ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆ ｅ ｘ ｐ ａ ｎ ｄ ｅ ｄｂ ｅ ｄ ａ ｄ ｓ ｏ ｒ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎｉ ｎｄ ｏ ｗ ｎ ｓ ｔ ｒ ｅ ａ ｍｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｇ
１ ２ ］ 胡洪波等 ［ 采用了离子交换型扩张床吸附剂对发
相同的负电荷， 通过静电排斥力就可以实现洗脱， 最终 的纯化因子达到 １ ２ ． ３ 。另外由于细胞也带有负电荷， ｕ 的例子更充分 所以并不影响床层扩张时的稳定性。Ｌ 地说明了耐盐性混合模式扩张床吸附技术在生物分离 纯化过程中的集成化作用。