银染操作步骤
银染方法总汇及注意事项
ptotocol是这样的，请看哪里不妥：蛋白银染步骤步骤溶液时间固定甲醇100ml冰醋酸25ml加双蒸水至250ml 30min冲洗双蒸水3次敏化甲醇75ml戊二醛（25%w/）1.25ml硫代硫酸钠(5%w/) 10ml醋酸钠（17g）加双蒸水至250ml 30min冲洗双蒸水3次银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml甲醛(37%w/) 0.1ml加双蒸水至250ml 20min冲洗双蒸水2次显色碳酸钠(6.25g)甲醛(37%w/) 0.05ml加双蒸水至250ml2-5min终止EDTA-Na22H2O(3.65g)加双蒸水至250ml 10min冲洗双蒸水3次建议使用silia的方法！！简单，快！本人的银染方法：1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟；2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟；4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟；6. 水洗：同上；7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟；8. 水洗：同上；9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。
以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。
谢谢！！！5.2.2.3 银染色1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％甲醇500ml 冰醋酸120ml2 银染液2（1000ml）：甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，（含乙酸1－2ml）甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛0.02%无水碳酸钠25g，甲醛1.5ml4 硝酸银（100ml）：20%硝酸银（过滤后待用）染色步骤：1 银染液1 洗2次，每次5分钟2 银染液2 洗1次，每次30分钟3 超纯水洗2次，每次1分钟4 0.5%硝酸银洗30分钟5 超纯水洗5次，每次1分钟（关键步骤，共计5分钟）显色液显色6 看到各条带，则倾去显色液, 1％乙酸中止我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。
DNA和蛋白银染步骤(独门绝技--有图)
DNA银染一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)1、固定液：50ml乙醇2、前处理液（敏化液）：5ml HNO33、染色液：0.5g 硝酸银（避光配制）4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml5、终止液：50ml 冰醋酸二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）1、准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中在摇床上轻摇1min；2、凝胶固定：倒掉盒中的水，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动10min；3、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次30S；4、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化6min；5、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗2次每次10S；6、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；7、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗1次10S；8、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；9、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇2-3min；10、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次1min。
三、变性聚丙酰胺凝胶的配制（两块、使用1.0BioRad胶板）1.2%的凝胶可以跑微卫星，和基因组DNA1、尿素：7.2g2、30%聚丙酰胺，4.68ml3、10×TBE，1.5ml (Tris碱108g；硼酸55g；EDTA 40ml 0.5mol/L,Ph=8.0；加水至1L)4、30%AP，35ul5、TEMED,4ul四、下图：左为果蝇正常基因组DNA与损伤后基因组DNA；右为果蝇微卫星电泳12h Treatment24h TreatmentMCT 0 5 10 200 5 10 20Protein银染一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释)1、固定液：200ml甲醇，50ml冰醋酸2、前处理液（敏化液）：150ml 乙醇，34g醋酸钠，1g硫代硫酸钠（使用前加入）3、染色液：1.25g 硝酸银（避光配制）4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml5终止液：2g甘氨酸二、银染步骤（摇床设置52rpm左右）1、凝胶固定：准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动30min；2、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次1min；3、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化30min；4、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗3次每次5min；5、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min；6、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗2次每次5min；7、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止；8、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇10min；9、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次5min。
基本银染和微波快速银染步骤-中文翻译
基本的银染步骤：（90min）材料：超纯水（>18 megohm/cm全程）、塑料染色托盘、摇床、塑料搅拌棒、10mL 一次性管、干净的玻璃杯、量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸）注意事项：1.在拿胶前确定用去离子水清洗橡胶手套。
2.用干净的容器，并标明银染专用。
3.当摇动时，确保容器大小可使胶在里面自由移动，染色时溶液能完全沫过胶面。
4.在拿胶或换溶液时，避免徒手摸胶或用金属物品接触，及避免对胶施加压力。
5.用有铁氟龙图层的棒和干净的玻璃容器准备试剂。
6.避免试剂交叉污染。
7.用新鲜配置的溶液。
样品含有高浓度的DTT：如果你的样品含有高浓度的DTT （>50mM）,银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。
为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品：1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM，并在70℃加热10min.2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM，并在70℃加热10min.3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。
进行电泳，并按手册进行银染。
在开始之前：用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染：程序：下面的程序用于8*8厘米预制胶，1.0mm厚。
如果要染两块小胶或1.0mm厚的大胶（18*18），保证孵育时间，将所有溶液的体积加倍。
注意：如果你的胶的尺寸和上面提到的不一样，你可能必须通过调整孵育时间和溶液体积来选择银染策略。
所有的孵育应该在一个旋转摇床上进行，以1圈/秒的速度在室温下进行。
确保每个胶有100ml的溶液。
1. 电泳后，将胶取出至合适尺寸的银染托盘内，用超纯水简单的清洗一下。
2. 用100ml固定液在摇床上缓慢旋转，固定胶20min。
如果你用的是Tricine 胶，那么就固定1小时。
注意：如果没有足够的时间完成银染程序，胶可以在固定液中存放一夜。
长时间的固定在某些情况下可能会改善灵敏度和背景。
DGGE银染溶液配制、银染步骤及切胶回收
溶液配制固定液：乙醇90ml，冰醋酸4.5ml，定容至900ml（各组分含量：10%乙醇，0.5%冰醋酸）注：如果显影完后不进行终止显影，那么固定液可以回收使用。
染色液：AgNO31.4g，甲醛600μl，加入去离子水700ml，振荡混匀，甲醛在使用前加入。
每次使用需新鲜配制，在固定步骤快结束时配制即可。
显色液：NaOH 9g，甲醛1200μl，加去离子水600ml。
显影液的配制可以先配成NaOH溶液放入4℃冰箱贮存，待要用时取出再加入甲醛并混匀。
预冷的显影液可以让条带显影更漂亮清晰，但是显影速度会变慢一些。
银染步骤1.固定将胶放入固定液中，摇床振荡15min。
摇床速度无需很快，小档即可。
2.银染固定液中取出胶，去离子水快速清洗两次，固定液此时可回收。
将胶放入配制好的染色液中，摇床振荡20min。
尽量在通风橱中进行并避光。
有时候胶会飘在水面导致染色结果不好，可调整摇床速度使染色液没过胶。
3.显影染色液中将胶取出，去离子水快速清洗一到两次，尽量迅速！放入预冷过的显影液中显影，并马上迅速振荡容器，使胶周围的银离子扩散均匀，待溶液颜色均匀不变，摇床开小档振荡直至条带显色完全。
4.终止显影将胶取出清洗两次，放入固定液中，即可终止显影，但固定液不可回收了。
如果不需要保存胶的话，这一步可以省略。
5.拍照将胶放在白光透射仪上，轻轻抚去底下的气泡，铺平摆正胶，数码相机拍照。
注意：银染全程，手指不可碰到胶，尤其是染色~显影这一段步骤，摸一下胶就会留下手印。
切胶回收步骤在白光透射仪上用干净的手术刀片切胶，放入灭菌的0.5ml离心管中，加入灭菌水50μl后，用黄枪头捣碎，离心后60~65℃水浴3~6h，取出离心后可以进行PCR实验，如果时间不能安排马上做PCR也可放4℃过夜，第二天做PCR。
银染色原理
银染色原理
银染色是一种常用的组织学技术，可用于观察细胞和组织中的细胞核和细胞质等部分。
银染色原理是基于银离子和还原剂之间的化学反应，将银离子还原为金属银形成黑色的颗粒，从而实现对样品中目标部分的染色。
银染色的过程包括三个步骤：（1）固定样品，使其硬化；（2）将样品浸泡在银离子溶液中，使银离子与样品中的目标部分结合；（3）将样品浸入还原剂溶液中，使银离子被还原成金属银。
银染色的优点在于其染色效果明显，能够清晰地显示细胞核和细胞质等细胞部分。
但是，银染色也存在一些缺点，如染色效果依赖于操作技术和试剂质量，容易产生伪影和背景等。
- 1 -。
双向电泳凝胶银染操作流程.
2.银染液成分：
(18cm 胶)每块用 500 ml 银染液
成分
(7cm 胶)
(18cm 胶)
(克，毫升,微升) 100 mlⅹ1 500mlⅹ1 500mlⅹ2 500mlⅹ3 500mlⅹ4
AgNO3
0.25 g
1.25 g
2.5g
3.75g
5.0g
1
北京基因组研究所-阳光
纯水
定容
定容
定容
定容
北京基因组研究所-阳光
双向电泳凝胶银染操作流程
目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使
银颗粒沉淀在蛋白带上。
一、固定：过夜+10minⅹ3
1.方法：1）.固定 30min 后纯水洗 10minⅹ3。2）.固定过夜后纯水洗 10minⅹ3（推荐）。
1.24g
6.20 g
12.4g
18.6g
24.8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
K3Fe(CN)6：铁氰化钾，深红色菱形结晶，比重 1.845，在碱性介质中为强氧化剂； Na2S2O3·5H2O：易溶于水，水溶液呈弱碱性，不溶于乙醇。
Glycine
0.4 g
2g
4g
6g
8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
甘氨酸：Glycine，75.07（可以用 EDTA 代替，3.65g 的 EDTA.2H2O 相当于 1g 甘氨酸） 六、（补充）：脱色
快速银染银染步骤及相关药品配制
快速银染银染步骤及相关药品配制银染步骤及相关药品配制一．银染基本步骤1．洗板和擦板电泳槽板先用无水乙醇擦一遍，5分钟后用配制的剥离硅烷（repel）溶液涂抹均匀。
放置15－30分钟玻板（用过的玻板先用NaOH溶液浸泡，直至废胶脱落）先用抹布蘸少许洗洁精在自来水下洗净，再用无水乙醇擦一遍，5分钟后用新鲜配制的亲和硅烷（binding）溶液涂抹均匀。
放置15－30分钟2．装板玻板在下，电泳槽板在上，中间放两根压条(涂抹repel和binding的面相互靠近)，对齐后，用三对夹子将波板与电泳槽板夹紧。
3．灌胶用针筒吸取6％的聚丙烯酰胺凝胶溶液，缓慢均匀的从灌胶口将胶灌入，灌好后取下靠近灌胶口的夹子，倒插入梳子，注意不要起汽泡，插好后，再夹上夹子。
凝胶需要1－2个小时。
4．预电泳取下夹子，拔出倒插的梳子，在自来水下将灌胶口冲洗干净，放入电泳槽，卡紧，灌入缓冲液，上下槽各300ml左右，注意用夹子夹紧上槽排放缓冲液的胶管。
80W衡功率电泳半小时。
5．点样用吸管吹干净灌胶口的废胶，将梳子顺插入灌胶口，开始点样，注意不要串样，梳齿不要将胶面弄坏。
6．电泳80W衡功率电泳1小时左右。
7．银染将玻板放入配制好的银染液中，银染半小时左右10．显影从银染液中拿出玻板快速水洗3－5秒，然后放入新鲜配制的显影液中，室温显影，直至条带清晰11．用自来水轻轻冲洗板子正反面几次，洗净残余的NaOH。
二．药品配制1．6%聚丙烯酰胺凝胶（PA）：Urea: 420.42gAcr: 60g 丙烯酰胺Bis: 3.16g10×TBE: 50ml加超纯水定容至 1L8% 聚丙烯酰胺PA：尿素 420.42gAcr： 80gBis: 4.212g10*TBE: 100ml加超纯水定容至 1L2. 10×TBETris-base: 216g硼酸：110gEDTA-Na2：14.88g3. binding（亲和硅烷）无水乙醇：2mlBinding原液：8ul冰醋酸：8ul4．Repel （剥离硅烷）三氯甲烷：100mlRepel：2ml5．Loading buffer：甲酰氨：49ml10mM EDTA（PH=8.0）：1ml溴酚蓝：0.125g二甲苯青：0.125g7．银染液蒸馏水：1500ml无水乙醇：150ml硝酸银溶液（1g/ml）：1500ul 8．显影液蒸馏水：1500ml氢氧化钠：30g甲醛：6ml硫代硫酸钠（10mg/ml）：300ul。
银染
银染操作步骤1.固定：电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。
固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。
固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml 固定液，可大量配制室温存放。
2. 30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30% 乙醇。
3.水洗涤：（洗2次）弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
4.增敏：（辅染）现配现用弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。
银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。
银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。
银染增敏液(100X)的配制：即2.8%硫代硫酸钠溶液，需用黑袋包裹避光保存。
5.水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
弃水，再加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
6.银染：弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
银溶液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。
银溶液(1X)配制后需在2小时内使用，最好是现配现用。
银溶液（100 X）的配制：称取5g硝酸银，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得1%的硝酸银溶液，需用黑袋包裹避光保存。
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银染操作步骤
1. 固定：
电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为
60-70rpm。
固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。
固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml固定液，可大量配制室温存放。
2. 30%乙醇洗涤：
弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30%乙醇。
3. 水洗涤：（洗2次）
弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
4. 增敏：（辅染）现配现用
弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。
银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。
银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。
银染增敏液(100X)的配制：即2.8%硫代硫酸钠溶液，需用黑袋包裹避光保存。
5. 水洗涤(共2次)：
弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
弃水，再加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为
60-70rpm。
6. 银染：
弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
银溶液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。
银溶液(1X)配制后需在2小时内使用，最好是现配现用。
银溶液（100 X）的配制：称取5g硝酸银，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得1%的硝酸银溶液，需用黑袋包裹避光保存。
7. 水洗涤：
弃原有溶液，加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度
为60-70rpm。
注意：水洗涤的时间不能超过1.5分钟。
8. 显色：
弃水，加入100ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70rpm。
银染显色液的配制：90ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入10ml银染基本显色液(10X),再加入0.05ml银染显色加速液(2000X)，混匀后即为银染显色液。
银染显色液配制后需在20分钟内使用。
银染基本显色液(5X)的配制：称取碳酸钠60g，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得12%碳酸钠溶液。
9. 终止：加适量EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)终止
弃银染显色液，加入100ml银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。
银染终止液(1X)的配制：95ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入5ml银染终止液(20X),混匀后即为银染终止液(1X)。
银染终止液(1X)配制后宜当天使用。
10. 水洗涤：
弃银染终止液，加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5分钟，摇动速度为60-70rpm。
11. 保存：
可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存。
或采用适当的方式制备成干胶。
常见问题：
1. 背景太深：
a. 显色时间过长。
通常显色反应会在10分钟内结束，显色反应时间过长会导致背景很深。
b. 洗涤不充分。
洗涤时间过短，或洗涤液加入的量不足，或者容器过于狭小导致摇动时溶液不易充分混合，或摇动速度过慢，导致混匀不充分。
请按照说明书的建议确保各种溶液的用量和作用时间，摇床的推荐速度为60-70rpm。
c. 凝胶中原有的缓冲液等未在固定步骤中去除干净。
一方面需确保固定的时间和固定液的用量，另一方面对于不是最常用的Bis-Tris缓冲的凝胶需要更长的固定时间以充分去除凝胶中的原有缓冲成分，以降低背景。
d. 水的纯度太低。
需使用大于16 MΩ·cm的高纯度水。
2. 蛋白条带非常浅：
a. 蛋白的半胱氨酸(Cysteine)残基的含量特别低或几乎没有。
半胱氨酸残基的存在对于银染非常重要，半胱氨酸残基的含量过低会导致检测灵敏度下降。
b. 银染后水洗涤时间过长。
在银溶液染色时需严格控制水洗涤的时间，水洗涤的时间不能超过1.5分钟，否则会导致过多的银离子被洗去，导致检测灵敏度下降。
c. 上样量不足。
本试剂盒检测BSA的灵敏度可以达到0.3ng，对于不同的蛋白检测灵敏度可能不同。
对于一些蛋白可能需要大于1ng的蛋白量才能被检测到。
d. 固定步骤后的洗涤不够充分。
导致少量乙酸残留，影响后续检测。
确保30%乙醇洗涤和水洗涤的用量和时间，可以适当延长洗涤时间。
3. 凝胶上出现小点或或其它非蛋白的痕迹：
a. 凝胶没有充分被溶液浸没。
请注意选择大小合适的容器，并加入足量的各种溶液，同时需保持适当的混匀速度确保凝胶可以被溶液浸没。
b. 用于银染的容器没有充分洗涤干净。
容器需先用洗涤剂充分洗涤，随后用自来水充分冲洗，最后用高纯度水再洗涤数次。
该容器最好能专用于银染，并注意避免各种可能的蛋白污染。
为确保充分洗涤干净，对于耐硝酸的容器，例如玻璃容器，可以在上述洗涤剂及自来水洗涤后用50%硝酸洗涤，随后用高纯度水充分洗涤。
c. 指纹或其它压痕。
请注意戴手套操作，切勿直接接触皮肤。
操作时请注意尽量勿挤压、折叠或摩擦凝胶。
d. 有金属物质接触凝胶。
金属物质例如金属镊子等接触凝胶会出现非特异性痕迹。
4. 在60-70 kD处出现一片模糊的蛋白染色背景：
皮肤上脱落的角蛋白(keratin)污染了蛋白样品。
一方面需注意戴手套操作，另一方面需注意盛放蛋白样品的容器盖子尽量不要敞开，甚至在取放蛋白样品时在超净台内进行以避免可能的角蛋白污染。
5. 在凝胶的顶端处出现黄色背景：
a. 样品中DTT浓度很高。
采用其它适当的还原试剂，或者在许可范围内适当减少DTT的用量。
b. 采用Tris-Glycine-SDS电泳体系。
Tris-Glycine-SDS电泳体系中的Glycine会导致背景凝胶的顶端出现轻微的黄色背景。
换用Tris-Tricine-SDS电泳体系则可显著消除此黄色背景。
6. 银在染色器皿中出现沉淀：
染色器皿中可能含有残余的洗涤剂或上次银染时的残余试剂。
需确保把染色器皿洗涤干净。