银染考染胶内酶解
双向电泳中4种常用染色方法的比较
取、 等电聚焦、 白质转移、Ｄ Ｐ Ｇ 蛋 Ｓ Ｓ— Ａ Ｅ电泳以及染色等
环节 ， 个环节 又包括 若 干步骤 。由此可 见 ２一 Ｅ技 每一 Ｄ
术是一个受多种因素控制的技术 ， 中任何一种因素没 其
有理 想地控 制好都 有 可能 引起 整 个 实验 的失 败 ， 且 这 而 种失 败往往 要等 到 ２一 Ｅ图谱染 色 显影 之后才 能 看 到。 Ｄ 因此 ， ２一 Ｅ中 ， 得到 一张理 想 的 图谱 果 进 行 了对 比 ， 筛 选 出适 合 以期 本 实验室 条件 的染色方 法 。
１ 材 料 与方 法
１１ 试 验材料 ． 本 实验 所用 的研 究 材料 为 杂交 水 稻威 优 ９６ １。本实 验染色 所涉及 的试 剂 ： 硝酸 银 （ 上海 试 剂一
的质谱分析提供有益的帮助， 除了控制好每一个步骤外 ，
摘
要： 采用 Ｓ Ｓ— Ａ Ｅ电泳技术 ， Ｄ ＰＧ 比较分析 了双向 电泳 中常 用４种染 色方 法的优、 点。结果表 明： 缺 常规银 染法灵敏
度低 ； 的双胺硝酸银银 柒法与质谱 分析不兼容 ； 染方法 一银 染复合染 色法的灵敏度稍低 于双胺硝酸银银 染法， 它的 改进 考 但 质谱 兼容性最高； 改进后的银 染方法灵敏度 高、 背景 清晰、 与质谱 兼容。因此后两种 方法较广泛适用于蛋 白质组学研究。
技术具 有高分 辨率 、 重 复 性 、 量分 析 和制 备 等性 能 ， 高 微
它与质谱分析是 当今蛋 白质组学研究 中必不可少的工
具 。２ Ｄ 一 Ｅ技术所 涉及 的环节 较 多 ， 一般 包 括 蛋 白质 提
及实验条件的差异， 同一染色方法往往在不同的实验室
蛋白质银染原理与方法
原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是 2～5.0ng／蛋白条带。
① SDS-PAGE电泳。
注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。
否则难以得到清晰的电泳分辨率。
②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。
加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在固定液中。
③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在保育液中。
④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。
⑤准备：取2.5ml 10XSilvering Solution, 加入22.5mL水，混匀后使用。
⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。
室温振荡保温20min。
⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。
注意观察目的条带。
如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。
显色时间不要过长，否则本底较深。
⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。
⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。
弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。
银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。
今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。
能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，2.0.1% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。
胶内酶解
一、试剂准备1．30mmol/L K3Fe(CN)6铁氰化钾9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水2．100mmol/L Na2S2O3硫代硫酸钠24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水3．200mmol/L NH4HCO3碳酸氢铵0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水4. 覆盖液（酶解缓冲液）40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水5. 萃取液50％ACN，0.1% TFA6. 胰蛋白酶贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。
工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL7. 脱色液银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合考染脱色液：50％ACN, 40mmol/L NH4HCO3以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。
二、实验步骤1. 切胶用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。
2. 脱色银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。
（3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O）考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。
SDS-PAGE蛋白质胶内酶切
蛋白质胶内酶切步骤一、溶液准备考染脱色液：50mM NH4HCO3/ACN（1：1，vol/vol）；银染脱色液：30mM K3Fe(CN)6/Na2S2O3(1:1,vol/vol);铁氰化钾/硫代硫酸钠覆盖液：25mM碳酸氢铵溶液；酶液：2ug分装后的promega质谱级胰酶，用160ul 覆盖液充分混和溶解；萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2，vol/vol）；二、操作步骤1.水洗胶块2次，吸走液体；2.胶块脱色。
1）考然胶块：加考然脱色液100ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色1h 左右，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；水洗胶块2次，将脱色后的染料洗去，吸走液体；2）银染胶块：加银染脱色液50ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色5min，至胶块颜色完全褪去；迅速将脱色液吸走，并加水终止；水洗胶块3次，至胶块变得完全无色透明；3.胶块脱水。
加50%ACN溶液，让胶块脱水；再加100%CAN，让胶块变白完全脱水；分别吸走液体；4.还原烷基化（SDS一维电泳条带，请做此步；2D电泳点不需要此步）1)加入50ul 10mMDTT溶液（溶于25mM NH4HCO3），56℃水浴50min；离心，吸走液体；2)加入50ul 55mM IAA溶液（溶于25mM NH4HCO3），避光反应15min；吸走液体；3)加入100ul水洗胶块，将反应剩余液体吸走；4)胶块脱水，重复步骤4；6．加入胰酶5-20ul（具体视胶块大小而定），让胶块充分吸胀，变透明20min，再剩余1-3ul的酶液；7. 37℃水浴过夜16h；8. 若做MALDI-MS分析，则直接取酶解液上清点样做质谱即可；若做ESI-LCMS分析则需要萃取胶内的多肽，分别加100ul萃取液，超声10min萃取两次，冷冻干燥待做LCMS；。
银染
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银染
检测聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法
01 应用
03 注意事项
目录
02 实验操作流程
银染是一种检测聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其原理是银离子在碱性 pH环境下被还原成金属银，沉淀 在蛋白质的表面上显色。银染的方法种类很多，有文献报道的就有 100多种。但是其准确的染色机制还不是特别 地清楚。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于 1ng的蛋白质点，故广泛地用在 2D凝胶分析上，及极低蛋白 含量测定的垂直丰度蛋白的检测，如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研 究。
实验操作流程
实验原理
实验目的
实验操作程序
检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的 程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还 不是非常清楚。
试剂：乙醇、冰醋酸（纯乙酸）、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或 EDTA. Na2.2H2O、 甲醛
固定：30min或者更长时间 100ml乙醇 40%乙醇 25ml冰醋酸 10%冰醋酸 加水到250ml 致敏：30min 75ml乙醇 30%乙醇 17g乙酸钠 28.2g三水乙酸钠 0.5g硫代硫酸钠（大苏打） 加水到终体积250ml 水洗：3 x 10min 银染：20min 0.625g AgNO3 100ul 37%甲醛（在使用前加入） 加水到终体积250ml
注意事项
1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。 2．甲醛在使用前加入。 3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。 4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。 5．银染液和显色液需要预冷。 6．所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！ 7．清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色。
蛋白胶内酶解方法
三、制备方法（一） 胶内酶解方法[9]1.操作步骤1)用手术刀片切下电泳胶上目标条带(或用自制切点器切下感兴趣的点)，置于EP管中(胶块切成约1mm3大小)，同时切下空白胶块作对照2)加入200～400ul 100mM NH4HCO3/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干(注：脱色液体积过量为好，脱色至透明，不必担心蛋白的损失，因为完整蛋白在此条件下很难被洗脱)(若为银染)[10]取30～50ul 30mM K3Fe(CN)6:100mM Na2S2O3=1:1(体积比)加入胶块内，清洗至蛋白点棕色消失，去除上清，立刻加200ul水终止反应，10分钟后，去除上清，再加入100ul 100mM NH4HCO3,静置20分钟，去除上清3)(若是2-D gel，则跳至第8步) 每管加入90ul 100mM NH4HCO3，10ul 100mM DTT，56℃孵化30分钟，还原蛋白质(注：溶液体积过量，若温度为室温，反应时间相应延长至1～2小时)4)去上清，每管加100ul 100%ACN，5分钟后吸去5)每管加入70ul 100mM NH4HCO3，30ul 200mM IAA(现配，避光保存)，暗处20分钟6)去上清，每管加入100ul 100mM NH4HCO3，室温15分钟7)去上清，加入100ul 100%ACN，5分钟后吸去，冻干8)冻干后，各加入5ul 2.5～10ng/ulTrypsin溶液，置于4℃冰箱30～60分钟，使胶块充分吸胀(若仍有剩余液，吸出打掉)注：50ng酶量是基于考染一块胶1mg的上样量，12.5ng是基于银染一块胶100ug的上样量。
上样量增加，酶量同比增加，酶与被分析蛋白质量比一般为1：20～1：100[11,12]9)再加入20~30ul左右50mM NH4HCO3缓冲液(无Trypsin)，PH 7.8～8.0(Promega)注：缓冲液体积视胶块体积而定，一般没过胶块20ul左右10)37℃反应过夜，20小时左右11)吸出蛋白酶解液，转移至新EP管中，原管加入100ul 60% ACN/0.1%TFA,超声15分钟，吸出溶液，并入前次溶液，反复抽提3次，合并，冻干12)样品制备完成，可以复溶，点样，进行质谱分析2.注意事项1)若样品种类较多，切记编号离心管，样品对号入管2)考染方案各注释均适用于银染方案3)整个操作过程应注意角蛋白等的污染4)佩带一次性乳胶手套，使用洁净的离心管及Millipore H2O5)不同公司的酶，最适PH范围不同，调节PH值3.试剂配制1)100mM NH4HCO3：称取1.581g NH4HCO3(MW 79.06)溶于200ml Milli Q水中2)50 mM NH4HCO3：称取0.791g NH4HCO3溶于200ml Milli Q水中3)100mM DTT：称取DTT(MW 154.3)0.0154g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中4)200mM IAA：称取IAA(MW 185.0)0.0370g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中5)TPCK-Trypsin无需配制，Promega公司已提供成品，浓度为0.5ug/ul，用时可按需稀6)30mM K3Fe(CN)6：称取K3Fe(CN)6(MW 329.25)0.0099g溶于1ml Milli Q水中7)100mM Na2S2O3·5H2O：称取Na2S2O3(MW 248.11)0.0248g溶于1ml Milli Q水中8)银染脱色液：将6)和7)以1:1体积混合，现配。
蛋白质胶内酶切步骤
蛋白质胶内酶切步骤一、溶液准备考染脱色液：50mM NH4HCO3/ACN（1：1，vol/vol）；银染脱色液：30mM K3Fe(CN)6/Na2S2O3(1:1,vol/vol);铁氰化钾/硫代硫酸钠覆盖液：25mM碳酸氢铵溶液；酶液：2ug分装后的promega质谱级胰酶，用160ul 覆盖液充分混和溶解；萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2，vol/vol）；二、操作步骤1. 水洗胶块2次，吸走液体；2. 胶块脱色。
1）考然胶块：加考然脱色液100ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色1h 左右，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；水洗胶块2次，将脱色后的染料洗去，吸走液体；2）银染胶块：加银染脱色液50ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色5min，至胶块颜色完全褪去；迅速将脱色液吸走，并加水终止；水洗胶块3次，至胶块变得完全无色透明；3. 胶块脱水。
加50%ACN溶液，让胶块脱水；再加100%CAN，让胶块变白完全脱水；分别吸走液体；4. 还原烷基化（SDS一维电泳条带，请做此步；2D电泳点不需要此步）1) 加入50ul 10mMDTT溶液（溶于25mM NH4HCO3），56℃水浴50min；离心，吸走液体；2) 加入50ul 55mM IAA溶液（溶于25mM NH4HCO3），避光反应15min；吸走液体；3) 加入100ul水洗胶块，将反应剩余液体吸走；4) 胶块脱水，重复步骤4；6．加入胰酶5-20ul（具体视胶块大小而定），让胶块充分吸胀，变透明20min，再剩余1-3ul 的酶液；7. 37℃水浴过夜16h；8. 若做MALDI-MS分析，则直接取酶解液上清点样做质谱即可；若做ESI-LCMS分析则需要萃取胶内的多肽，分别加100ul萃取液，超声10min萃取两次，冷冻干燥待做LCMS；。
双向电泳技术手册之四胶蛋白质点的检测(考染和银染)
双向电泳技术手册之四:胶蛋白质点的检测(考染和银染)第四章2-DE 胶蛋白质点的检测2-DE 胶蛋白质点的检测方法大致有：1）考马斯亮兰染色法；2)银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5 ）放射性同位素标记法等。
这几种检测方法的灵敏度各不相同。
目前最常用的是银染法和考染法。
由于银染的灵敏度是考染的50 倍，故一般用银染法进行分析处理，再用考染法来进行样品微量制备。
4.1考马斯亮兰染色:4.1.1经典的考马斯亮兰染色程序：1 固定20 % TCA 1h2 染色0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h3 脱色40% EtOH&10% acetic acid 2x 30 min4 强化1% acetic acid overnight5 清洗deionized H2O 30 min局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot）4.1.2 Neuhoff 胶体考染法：1 固定：12％（w/v）三氯醋酸（TCA）2h2 染色：200ml 染色液混合50ml 甲醇16-24h染色液：在490ml 含2％（w/v）的H3PO4中加50g (NH4)2SO4 直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250（已溶于10mlH2O中），搅拌混合。
无需过滤，使用前摇匀。
3 漂洗：1）0.1mol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟；2）25％（v/v）甲醇漂洗不超过1min4 稳定：在20％的(NH4)2SO4中稳定蛋白质－染料复合物。
优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot.4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法：1 染色（0.025%(w/v) 考马斯亮兰R350）：将1 片Phast Gel Blue 药片溶入1.6L 10%醋酸，将染色液加热到90℃倒入凝胶染色盘，振荡10min；2 脱色：10%醋酸室温振荡脱色2h ，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收；脱色液和染色液可重复使用。
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胶内酶解
试剂及材料准备：
EP管清洗液：100ml
终浓度0.1％的三氟乙酸（TFA）和50％的乙腈涮洗
TFA 0.1% 0.1ml
乙腈50% 50ml
水定容至100ml
脱色液：100ml 现配
A液：30 mM储液――室温下
铁氰化钾（k3Fe(CN)6）0.99 g
去离子水100ml
B液：100 mM储液――室温下
硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）2.48 g
去离子水100 ml
脱色工作液：A与B等体积混合，
100 mM NH4HCO3：250ml 室温保存
NH4HCO3 1.975 g
去离子水250ml，
100 mM DTT还原缓冲液：1ml 现配(二维凝胶银染不用)
DTT 15.4 mg
100 mM NH4HCO3 1 ml
55 mM碘乙酰胺（iodoacetamide）烷化缓冲液：1ml 现配（二维凝胶银染不用）
碘乙酰胺10.2 mg
100mM的NH4HCO3 1 ml
酶解缓冲液：1ml
（含9％乙腈（acetonitrile），40 mM NH4HCO3）
100 mM NH4HCO3 0.4 ml
乙腈0.09 ml
加水至 1 ml
胰酶储液：1ml -20 ℃保存，可用4周
冻干的胰酶（trypsin）粉剂20 ug/管（sigma）。
溶于100ul 1 mM的HCl，再加入900 ul含9％的乙腈（acetonitrile）、40 mM NH4HCO3的酶解缓冲液中。
终浓度为20 ug/ml，分装成20ul/管。
胰酶20 ug
1 mM HCl 100 ul
酶解缓冲液900 ul
萃取液：10ml
1. 90％乙腈与10％三氟乙酸10ml
乙腈90％9ul
三氟乙酸10％1ul
水定容至10ml
2. 50％乙腈与5％三氟乙酸10ml
乙腈50% 5ul
三氟乙酸5% 0.5ul
水定容至10ml
胶内酶解：
一、脱色（银染）
1．去离子水冲洗凝胶，每次10 min，2～3次（摇床）
2．用刀片割下的蛋白点置于eppendorf管中，注意尽可能接近蛋白点以减小背景胶，同时用非蛋白区域胶做空白
3．用去离子水冲洗两次后，把胶切成小块（可省）。
加入新鲜制备的脱色工作液50 ul，约1～2 min可见胶的棕色消失，吸去溶液。
用水冲洗至无淡黄色溶液产生，加入50 ul 100 mM的NH4HCO3冲洗一遍
4．吸掉所有液体，加入50ul无水乙腈脱水两遍，直至胶缩小变白为止
5．置于真空干燥离心机中抽干
脱色（考染）
1.同上
2.同上
3.加入100ul含30%乙腈的100 mM的NH4HCO3溶液脱色，可振摇，直到蓝色脱去为止
4.同上
5.同上
二、还原和烷化（二维凝胶银染不需要）
1．加入50 ul 还原缓冲液（100 mM DTT），57 ℃保温1 h还原蛋白
2．室温冷却，去掉过量液体，迅速加入同体积烷化缓冲液，室温暗处放置30 min，使之碘乙酰化
3．反应完成后用100 mM NH4HCO3冲洗两次，用乙腈脱水，冻干
三、酶解
1．每管抽干的胶块中加入约20ul酶液，置冰上30 min，使其充分吸胀
2．吸胀后将多余的酶液吸去，再加入20 ul不含胰酶的酶解缓冲液覆盖，37 ℃消化过夜（10～12 h），注意酶解过程中保持胶块湿润
四、萃取
1．酶解后的上清液移至另一eppendorf管中（可直接用于质谱分析），剩下的胶用50 ul萃取液萃取两次：
90％乙腈：10％TFA 15 min spin（votax一下，静置）
50％乙腈：5％TFA 15 min spin
2．合并萃取液抽干后进行质谱分析。