蛋白胶内酶解方法
第二节实际蛋白样品的提取、酶解及前处理
第二节 实际蛋白样品的提取、酶解及前处理
蛋白的提取、 酶解在整个样品的分离鉴定中占有很重要的位置。目前蛋白分
步提取的方法［ ６ ６ １ 主要是针对二维凝胶电 泳， 它的 提取液中 含有高 浓度的 解聚剂、
表面活性剂，它们的存在会降低溶液酶解的效率，有些物质对后续的色谱分离、 质谱鉴定还有影响， 因此， 本文结合第一节溶液酶解的实验结果与现有的分步提 取方法，希望能找出一条适合溶液酶解的提取步骤。 样品的前处理也相当重要。 它对样品的分离结果能有所改善， 本文主要是针 对两种比较常用的方法 （ 固相萃取除盐和微量过滤膜除大分子）进行了些讨论。
１ ３ ７ ８ ５ ９
４ １ ７ １ ０
１ ９ ５
１ ８ ９
第三章 蛋白的酶解条件及实际蛋白 样品的处理
（ Ｑ ０ ４ ８ ５ ７ ） Ｃ ｏ ｌ ｌ ａ ｇ ｅ ｎ ａ ｌ ｐ ｈ ａ １ （ Ｖ Ｉ ） ｃ ｈ ａ ｉ ｎ ｐ ｒ ｅ ｃ ｕ ｒ ｓ ｏ ｒ （ Ｑ ６ １ １ ７ ６ ） Ａ ｒ ｇ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ １ （ Ｅ Ｃ ３ ． ５ ． ３ ． １ ） （ Ｌ ｉ ｖ ｅ ｒ － ｔ ｙ ｐ ｅ
３ ． 除盐
４ ． 洗脱
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图１ ，固相萃取的步骤示意图。
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第二章 蛋白的酶解条件及实际蛋白样品的处理
ｚ ． 结果与讨论
２ ． １蛋白的提取
目 前， 在蛋白 分步提取方法［ ６ ７ １ 中， 第一 步 通 常 是 用含４ ０ ｍ Ｍ Ｔ ｒ ｉ ｓ 的 水 溶 液
表１ ， ２ Ｄ － Ｌ Ｃ － Ｍ Ｓ 在第三步提取溶液中 鉴定出的可信的蛋白。
胶内酶解
一、试剂准备1．30mmol/L K3Fe(CN)6铁氰化钾9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水2．100mmol/L Na2S2O3硫代硫酸钠24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水3．200mmol/L NH4HCO3碳酸氢铵0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水4. 覆盖液（酶解缓冲液）40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水5. 萃取液50％ACN，0.1% TFA6. 胰蛋白酶贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。
工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL7. 脱色液银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合考染脱色液：50％ACN, 40mmol/L NH4HCO3以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。
二、实验步骤1. 切胶用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。
2. 脱色银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。
（3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O）考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。
胶内酶解
1.2.2 蛋白质谱鉴定（1）胶内酶解斑点切取：用剪刀将200 μL枪头尖端剪掉约1-2cm，孔的直径约为2-3 mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中（离心管灭菌后浸泡于75%乙醇，用时取出自然干燥）。
操作时注意减少污染，戴帽子手套操作，尽量减少所切取蛋白质点周围的凝胶体积，勿使样品干燥。
脱色、脱水：每管加入100 μL脱色液（50% 乙腈，25 mM 碳酸氢铵），室温放置30 分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。
加入60 μL 乙腈使凝胶脱水10 min，丢弃上清液。
酶解：每块凝胶加入约8 μL（浓度为12.5 ng/μL）溶于100 mmol/L 碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃ 吸胀1 h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12 h。
加入10 μL 5% 三氟乙酸，1 h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。
加入10 μL 2.5% 三氟乙酸，1 h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。
将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。
用0.2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。
保存？？？（2）质谱鉴定①点靶：将冻干肽混合物中加入2μL 0.2% 三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。
取每个样品0.6 μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
再取0.6 μL饱和基质α-手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800 Proteomies Analyzer)。
②质谱鉴定：样品用4800串联飞行时间质谱仪4800 Proteomies Analyzer 进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。
肽指纹图谱（PMF）质量扫描范围为800-4000Da，且一级质谱强度最大的 5 个峰进行串级质谱分析。
谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。
蛋白质胶条质谱鉴定
百泰派克生物科技
蛋白质胶条质谱鉴定
蛋白质胶条鉴定
蛋白质胶条是蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后所得到的相互分离的蛋白条带。
在电场作用下，蛋白质在聚丙烯凝胶中按照分子量大小进行迁移，形成不同的蛋白条带，每一条蛋白条带中的蛋白质可能是相同的也可能是分子量相同或相似的不同蛋白质，可能是已知的也可能是未知的，这些蛋白胶条可以切割下来，对所含的蛋白质做进一步的鉴定，即蛋白质胶条鉴定。
蛋白质胶条质谱鉴定
蛋白质胶条质谱鉴定是利用质谱手段对蛋白胶条进行鉴定，常用的质谱手段包括基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）和高效液相串联质谱（LC-MS/MS）。
在进行质谱分析之前，需要将包埋在凝胶中的蛋白质回收提取出来，并酶解消化成肽段。
MALDI-TOF/TOF将样品均匀包埋在固体基质晶体中，基质能吸收激光的能量并将一部分能量传递给样品分子使其离子化，在电场作用下，离子加速飞过飞行管道，离子的飞行时间与质荷比（M/Z）成正比，通过检测不同离子的飞行时间可以计算其质荷比，进行多肽和蛋白鉴定。
LC-MS/MS将肽段通过高效液相色谱(HPLC)进行分离，分离后的肽段直接进入质谱仪进行分析，根据一级质谱获得的质荷比可以计算各肽段的分子质量；为了鉴定肽段的确切序列，进而拼接出各蛋白的完整序列，得到的肽段进行二级质谱分析，二级质谱数据结合相应数据库和检索软件可以推演多肽甚至蛋白的完整序列。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合nanoLC-MS/MS纳升色谱提供，能够对SDS-PAGE蛋白条带、2D蛋白胶点等样品中的蛋白质进行高效精准鉴定，欢迎免费咨询152-****7680。
SDS-PAGE蛋白质胶内酶切
蛋白质胶内酶切步骤一、溶液准备考染脱色液：50mM NH4HCO3/ACN（1：1，vol/vol）；银染脱色液：30mM K3Fe(CN)6/Na2S2O3(1:1,vol/vol);铁氰化钾/硫代硫酸钠覆盖液：25mM碳酸氢铵溶液；酶液：2ug分装后的promega质谱级胰酶，用160ul 覆盖液充分混和溶解；萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2，vol/vol）；二、操作步骤1.水洗胶块2次，吸走液体；2.胶块脱色。
1）考然胶块：加考然脱色液100ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色1h 左右，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；水洗胶块2次，将脱色后的染料洗去，吸走液体；2）银染胶块：加银染脱色液50ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色5min，至胶块颜色完全褪去；迅速将脱色液吸走，并加水终止；水洗胶块3次，至胶块变得完全无色透明；3.胶块脱水。
加50%ACN溶液，让胶块脱水；再加100%CAN，让胶块变白完全脱水；分别吸走液体；4.还原烷基化（SDS一维电泳条带，请做此步；2D电泳点不需要此步）1)加入50ul 10mMDTT溶液（溶于25mM NH4HCO3），56℃水浴50min；离心，吸走液体；2)加入50ul 55mM IAA溶液（溶于25mM NH4HCO3），避光反应15min；吸走液体；3)加入100ul水洗胶块，将反应剩余液体吸走；4)胶块脱水，重复步骤4；6．加入胰酶5-20ul（具体视胶块大小而定），让胶块充分吸胀，变透明20min，再剩余1-3ul的酶液；7. 37℃水浴过夜16h；8. 若做MALDI-MS分析，则直接取酶解液上清点样做质谱即可；若做ESI-LCMS分析则需要萃取胶内的多肽，分别加100ul萃取液，超声10min萃取两次，冷冻干燥待做LCMS；。
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缺点：
•可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。 • 肽段分子量精确度往往不够理想，影响鉴定结果。肽段分子质量在 2000以上时，在MALDI-TOF-MS中的分辨率会有所下降 。 •无法进行混合蛋白质鉴定 •翻译后修饰鉴定能力稍低
LTQ（ESI-MS/MS）
由于该质谱具有高效液相分离与MS/MS结构分析功能，可以获得检测到 的每一肽段的序列。根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱 (MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。 优点：
总离子可信度
肽段序列
实际分子量 理论分子量
起始氨基酸位置 结束氨基酸位置
肽段离子得分
肽段固定修饰
分子量误差
肽段可信度
MS-MS (SeQuest)
BuildSummary
LTQ质谱（BuildSummary软件）结果说明
唯一肽段数 鉴定的肽段数 搜索到的蛋白 蛋白鉴定覆盖率 蛋白理论分子量 蛋白理论等电点 搜索到的蛋白可能有多个gi号，取最典型的gi号，选取次序为：sp > ref > first gi_number
• MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激 光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子 或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软 电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。
• TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器 的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行 时间成正比 ，检测离子。
压力差推动质子化样品进入质 量分析器进行检测 。
实验原理
适用样品
• 一般建议样品为溶液或考染胶。若为银染胶，需要采取快 速银染（即同质谱鉴定兼容）的方法染色。 • 溶液中一般不要有SDS、CHAPS、Triton X-100、NP40及 吐温 20、40等系列的去污剂。盐浓度小于50mM • 溶液样品蛋白浓度一般不小于1mg/ml，蛋白总量不小于 10ug。
凝胶内或溶液中蛋白质消化简介
凝胶内或溶液中蛋白质消化简介在用于蛋白质消化的内切酶中，丝氨酸蛋白酶-胰蛋白酶是最常见的一种，因为它生成的肽非常适合MS（/MS）分析。
根据前面的工作流程，蛋白质的酶解消化是在凝胶中或在溶液中进行的。
用于双向电泳的蛋白质通常采用凝胶内消化，而用于LC-MS/MS分析的蛋白通常采用溶液内消化。
在消化过程中，蛋白质被酶切成有限数量的较短片段或多肽，以便根据蛋白质的特征质量和模式来识别蛋白质。
凝胶内消化通过1-D或2-D凝胶电泳分离样品后，使用 MS 兼容染色剂（通常是考马斯蓝或采用无戊二醛方案的银）对蛋白质进行固定和可视化。
从凝胶中切下可视化的蛋白质，并在胰蛋白酶消化之前洗涤相应的凝胶条带或斑点以进行脱色和脱水。
据信，通过用乙腈对凝胶进行脱水，随后在含有蛋白酶的消化缓冲液中溶胀，有助于蛋白酶向凝胶的渗透。
不同的研究表明，蛋白酶渗透凝胶的过程几乎完全是由扩散驱动的。
通过将凝胶切成尽可能小的碎片，可以提高凝胶内消化的效率。
表面活性剂（去污剂）有利于凝胶中蛋白质的溶解和变性，从而缩短消化时间，增加蛋白质的裂解和提取多肽的数量，特别是对于膜蛋白等亲脂蛋白质。
通常在酸性条件下，可裂解去污剂会在消化后裂解。
这使得洗涤剂的添加需与质谱法兼容。
为了确保凝胶基质中的蛋白质有效水解，通常使用相对较高浓度的酶。
随后可以使用提取缓冲液（例如50%乙腈/5%甲酸）结合超声波，从凝胶基质中释放所生成的蛋白水解肽。
为了满足具有不同物理和化学性质的肽的要求，可以使用碱性或酸性溶液进行迭代提取。
凝胶内消化和提取多肽的效率取决于各种因素，包括(i)：蛋白质及其产物的物理化学性质（如疏水性程度、大小、氨基酸序列）；(ii)凝胶的成分、大小和厚度；(iii)提取缓冲液的成分（例如乙腈浓度）；(iv)酶的类型及其比活性；(v)一般反应条件（如温度、时间、酶与底物的比例）；(vi)蛋白质染色的类型（如考马斯或银染）。
进行凝胶内蛋白质消化的一个显著优点是，任何污染物（例如洗涤剂、盐）在电泳过程中都已被去除，因此所产生的多肽样品可以容易地进行（LC/）ESI-MS分析。
凝胶胶内酶解技术路线
凝胶胶内酶解技术路线用到的试剂如下：1．100mMNH4HCO3：称取1.975g NH4HCO3溶于250mL的双蒸水中2．脱色液：乙腈:50mM NH4HCO3=1:13．10mmol/LDTT还原液：称取0.0154g溶于10mL 100mM NH4HCO3中4．55mmol/L烷基化溶液：称取0.102g碘乙酰胺溶于10mL100mM NH4HCO35．酶解贮液：Trypsin(Promega，V5111)制备为0.5μg/μL水溶液，分装1-3μg－20℃保存6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.125μg于25mMNH4HCO3溶液7．肽提取液Ⅰ：5%TFA（v/v）水溶液8．肽提取液Ⅱ：乙腈:5%TFA=1:19、考染脱色液（100ML）：乙醇25 ml、乙酸8 ml、水67ml混合一、Hela细胞线粒体、细胞核、胞浆的提取。
（详见各试剂盒的操作说明书）二、蛋白质SDS-PAGE分离和酶切肽提取蛋白质SDS-PAGE分离,每个泳道上样量为50μg,共10个泳道，恒压100伏。
考马斯亮蓝染色，加脱色液至无色。
电泳后样品的酶切肽提取过程如下：1．考马斯亮蓝染色凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片。
2．加入脱色液(乙腈:50mM NH4CO3=1︰1)100μL浸泡，振荡20min，弃去溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽。
3.加入50μL DTT（10mmol/L）还原液，30min，56℃；弃废液，加100μL乙腈脱水5-10min。
4．加入50μL碘乙酰胺(55mmol/L)烷基化，于暗处30min。
5．加入100μL脱色液，洗5-10min,弃废液，冰冻干燥20min。
6．加入15-20μL酶液（12.5ng/μL），置于4℃放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液15-20μL，使胶完全浸没。
37℃保温15小时或过夜。
7．加提取液Ⅰ（5%TFA）100μL，40℃加热水浴1小时，30min时，超声3min左右. 8．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取液Ⅱ(50%乙腈，2.5%TFA)100μL，30℃保温1小时，30min时，超声3min左右9．将提取液合并，氮气吹干乙腈后，真空离心干燥。
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三、制备方法
（一） 胶内酶解方法[9]
1.操作步骤
1)用手术刀片切下电泳胶上目标条带(或用自制切点器切下感兴趣的点)，置于EP管中(胶块切成约
1mm3大小)，同时切下空白胶块作对照
2)加入200～400ul 100mM NH4HCO3/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干(注：脱色液体积过
量为好，脱色至透明，不必担心蛋白的损失，因为完整蛋白在此条件下很难被洗脱)
(若为银染)[10]取30～50ul 30mM K3Fe(CN)6:100mM Na2S2O3=1:1(体积比)加入胶块内，清洗至蛋白点棕色消失，去除上清，立刻加200ul水终止反应，10分钟后，去除上清，再加入100ul 100mM NH4HCO3,静置20分钟，去除上清
3)(若是2-D gel，则跳至第8步) 每管加入90ul 100mM NH4HCO3，10ul 100mM DTT，56℃孵化30分
钟，还原蛋白质(注：溶液体积过量，若温度为室温，反应时间相应延长至1～2小时)
4)去上清，每管加100ul 100%ACN，5分钟后吸去
5)每管加入70ul 100mM NH4HCO3，30ul 200mM IAA(现配，避光保存)，暗处20分钟
6)去上清，每管加入100ul 100mM NH4HCO3，室温15分钟
7)去上清，加入100ul 100%ACN，5分钟后吸去，冻干
8)冻干后，各加入5ul 2.5～10ng/ulTrypsin溶液，置于4℃冰箱30～60分钟，使胶块充分吸胀(若仍有剩
余液，吸出打掉)注：50ng酶量是基于考染一块胶1mg的上样量，12.5ng是基于银染一块胶100ug的上样量。
上样量增加，酶量同比增加，酶与被分析蛋白质量比一般为1：20～1：100[11,12]
9)再加入20~30ul左右50mM NH4HCO3缓冲液(无Trypsin)，PH 7.8～8.0(Promega)注：缓冲液体积视胶
块体积而定，一般没过胶块20ul左右
10)37℃反应过夜，20小时左右
11)吸出蛋白酶解液，转移至新EP管中，原管加入100ul 60% ACN/0.1%TFA,超声15分钟，吸出溶液，
并入前次溶液，反复抽提3次，合并，冻干
12)样品制备完成，可以复溶，点样，进行质谱分析
2.注意事项
1)若样品种类较多，切记编号离心管，样品对号入管
2)考染方案各注释均适用于银染方案
3)整个操作过程应注意角蛋白等的污染
4)佩带一次性乳胶手套，使用洁净的离心管及Millipore H2O
5)不同公司的酶，最适PH范围不同，调节PH值
3.试剂配制
1)100mM NH4HCO3：称取1.581g NH4HCO3(MW 79.06)溶于200ml Milli Q水中
2)50 mM NH4HCO3：称取0.791g NH4HCO3溶于200ml Milli Q水中
3)100mM DTT：称取DTT(MW 154.3)0.0154g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中
4)200mM IAA：称取IAA(MW 185.0)0.0370g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中
5)TPCK-Trypsin无需配制，Promega公司已提供成品，浓度为0.5ug/ul，用时可按需稀
6)30mM K3Fe(CN)6：称取K3Fe(CN)6(MW 329.25)0.0099g溶于1ml Milli Q水中
7)100mM Na2S2O3·5H2O：称取Na2S2O3(MW 248.11)0.0248g溶于1ml Milli Q水中
8)银染脱色液：将6)和7)以1:1体积混合，现配。