尿液中囊泡的提取和鉴定概要
尿液蛋白质组 实验流程
尿液蛋白质组实验流程一、实验准备样本收集选择清洁无菌的尿液收集容器，避免样本被污染。
采集早晨第一次尿液样本，因其含有的蛋白质浓度较高，能更好地代表体内状态。
标记样本，记录收集时间和其他相关信息。
样本处理收集的尿液样本应立即处理，以防蛋白质降解。
样本处理步骤如下：将尿液样本离心，去除沉淀物和细胞碎片。
将上清液转移至干净的离心管中，进行冷冻保存。
保存温度通常为80℃。
处理样本时，应穿戴适当的防护装备，并在无菌条件下操作。
二、蛋白质提取样本解冻取出冷冻的尿液样本，放置于4℃冰箱中解冻。
解冻过程应缓慢进行，以避免蛋白质变性。
蛋白质沉淀通过加入适当的沉淀剂（如三氯乙酸、冰醋酸等），使尿液中的蛋白质沉淀。
常见的沉淀方法包括：加入沉淀剂后，充分混匀样本，通常在室温下静置一定时间。
通过离心分离沉淀的蛋白质，弃去上清液。
用适当的缓冲液洗涤沉淀物，以去除多余的沉淀剂。
蛋白质溶解将洗涤后的沉淀物重新溶解在适当的缓冲液中，通常使用含有去垢剂（如尿素、硫脲）的溶液，以帮助溶解蛋白质。
三、蛋白质定量与分离蛋白质定量使用比色法（如BCA法、Bradford法）测定蛋白质浓度。
定量方法的选择应根据实验需求和样本特性来决定。
蛋白质分离常用的蛋白质分离方法包括：SDSPAGE：用于初步分离蛋白质，评估样本中蛋白质的分子量范围。
液相色谱：例如反相色谱（RPHPLC）和离子交换色谱（IEC），用于进一步分离和纯化蛋白质。
四、蛋白质鉴定与分析蛋白质酶解将分离纯化后的蛋白质进行酶解，常用的酶有胰蛋白酶。
酶解过程如下：根据蛋白质的性质选择合适的酶解条件。
在适宜的温度和pH条件下进行酶解，通常在37℃的水浴中进行。
酶解完成后，将消化液进行冷冻保存，或立即进行下一步的分析。
质谱分析采用质谱（MS）技术进行蛋白质鉴定和定量。
常见的质谱方法包括：MALDITOF MS：用于蛋白质的质谱分析，适用于大分子蛋白质。
LCMS/MS：液相色谱联用质谱技术，适用于复杂样本的详细分析。
尿液exosomes RNA提取 SOP
尿液exosomes RNA提取SOP实验步骤：A.exosome 沉淀——10ML样本起始量（用ExoQuick-TC 分离exosomes）1.尿液离心（3000g,15min,4℃），取上清（沉淀为细胞或细胞碎片）2.转移上清至无菌试管，加入2ML的ExoQuick-TC , 颠倒试管混匀。
3.4℃冷藏过夜（至少12h）（冷藏期间试管需静置，勿旋转）。
4.离心（1500g, 30min,4℃或室温），离心后，exosomes为管底的米黄色/白色小球。
5.去除上清，再次离心（1500g, 5min），尽量去除所有的液体，小心别碰到沉淀。
6.在上步沉淀中加入350ul LYSIS Buffer,涡旋15sB.exosomes RNA提取1.在上步沉淀中加入350ul LYSIS Buffer,涡旋15s；2.室温放置5min(使exosomes裂解完全)；3.加入200ul 100%乙醇（RNAse-free）,涡旋10s；4.将柱子装入收集管，将600ul 上述溶液转移到柱子中；5.离心（13000rpm，1min，4℃）；6.弃废液；7.加入400ul WASH Buffer；8.离心（13000rpm，1min，4℃）；9.重复⑹-⑻，再洗一次（共洗两次）；10.弃废液，离心（13000rpm，2min，4℃）（关键，为了甩干柱子便于更好地洗脱RNA）；11.将柱子转移到新的1.5ml EP管（RNAse-free）中；12.加入30ul Elution buffer 至膜中央；13.离心（2000rpm,2min, 此步为使Elution buffer 浸透膜）；14.增加转速离心（13000rpm,1min, 此步为洗脱RNA）。
15.弃柱子，将提取的RNA立即放-80℃。
病毒学实验二病毒尿囊液的收获及血
血细胞凝集（HA）试验术式表
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
病毒稀
释度
1： 2
1：4
1：8
1： 16
1： 32
1： 64
1： 1： 128 256
1： 512
1： 1024
将冻存的鸡胚置于蛋托上用碘酊和酒精棉消毒气室端用无菌镊子击破气室部卵壳并撕开壳膜用无菌吸管经绒毛膜进入尿囊腔吸取尿囊液置无菌容器中低温保存备用
实验二 病毒尿囊液的收获及血凝实验
病毒尿囊液的收获
• 实验器材：镊子、无菌眼科镊子和剪刀、青霉素 瓶、灭菌吸头、移液器、小三角瓶、灭菌高压锅
• 已接种鸡胚收获尿囊液前置于4℃冰箱4h 或过夜。 • 将冻存的鸡胚置于蛋托上，用碘酊和酒精棉消毒
• 于左侧第1孔加25ul病毒收取液，混合均匀后，吸25ul至 第2孔，混合均匀后，吸25ul至第3孔，依次倍比稀释，至 第11孔，吸弃50ul，稀释后病毒稀释度为第1孔1：2，依 次1：4，1：8……。最后一孔为对照。
• 自左至右依次向各孔加1%鸡红细胞25ul，轻微振荡混匀， 使血球与病毒充分混合，在37℃温箱中作用15～30min后， 待对照红细胞已沉淀可观察结果。
饮水或气雾免疫。
肉仔鸡
• 一免： 一日龄半头份油苗+弱毒苗滴鼻、点眼 • 二免：10-20日龄饮水
血清学诊断
• HA+HI
• 鸡群血清学测定： • 临界值/阈值（保护性抗体） • 免疫前后无变化 • 不同疫苗的免疫结果 • 免疫监测
血凝实验
• 实验目的：掌握血细胞凝集试验的原理，熟悉血 凝试验的方法和结果分析。
一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法[发明专利]
![一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/e347eccae2bd960591c67796.png)
专利名称：一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法专利类型：发明专利
发明人：陈彦涌,方学敏
申请号：CN201811236669.5
申请日：20181023
公开号：CN111087443A
公开日：
20200501
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法，所述方法利用特定吸附剂对尿液中多种蛋白质的同时亲和捕获与从吸附剂上的分阶段特定洗脱，包括以下步骤：1)收集尿液，进行透析、离心和过滤；2)制备Cibacron Blue F3‑GA‑琼脂糖凝胶亲和吸附剂，装柱并平衡；3)将尿液上样，静置；4)分阶段洗脱，收集各个阶段的洗脱级分。
本发明的方法能够从同一批尿液中平行地一次提取出不少于八种高价值的尿蛋白，显著提高了尿蛋白的分离提取效率，使尿液作为特定生物资源得到充分利用。
申请人：北京聚德方辉科技有限公司
地址：100096 北京市昌平区西三旗建材城西路87号院新华大厦A-1018
国籍：CN
代理机构：北京瑞恒信达知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：张伟
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囊泡提取和纯化
囊泡的提取和纯化10使用液氮研磨5 g稻瘟病菌菌丝至粉末状，加入15 ml 0.1 M醋酸钠（含有0.07% 巯基乙醇），4℃匀速搅拌2小时。
6500 rpm，4℃，离心30 min，收取上清至新的离心管中待用。
沉淀再次加入15 ml 0.1 M醋酸钠（含有0.07% 巯基乙醇），搅拌均匀后，6500 rpm，4℃，离心30 min，收取上清，并与上一步上清合并。
合并后的上清，7500 rpm，4℃，离心30 min，进一步除去没有沉淀干净的菌丝碎片。
上清转入Beckman超速离心机专用离心管中，选择70Ti转头，50000 rpm离心90 min。
倒去上清，沉淀使用1 ml TMD缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，10 mM MgCl2，5 mM DTT）溶解30 min。
8000 rpm，4℃，离心3 min，取上清加入终浓度为15%的甘油，-80℃保存待用（建议6个月内使用）。
囊泡裂解和蛋白质纯化取400 µl保存的囊泡样品，加入200 µl膜蛋白裂解液（5 M尿素, 2 M 硫脲, 2% CHAPS, 2% SB3-10, 40 mM Tris, 5 mM巯基乙醇, 0.17%蛋白酶抑制剂），充分混匀后，加入2-3倍体积的预冷丙酮（含10% 三氯醋酸，0.07% 巯基乙醇），-20℃沉淀至少30 min。
13000 rpm，4℃，离心30 min，沉淀使用预冷丙酮（含0.07% 巯基乙醇）清洗3次后，自然晾干，加入200 µl膜蛋白质裂解液，充分溶解后，4℃最大转速离心，除去不溶杂质，使用GE公司的2D-Clean up 试剂盒进一步纯化。
About 5 g mycelia were ground in liquid nitrogen with a mortar and pestle and the mycelia powder was suspended in 25 ml of 0.1 M sodium acetate containing 0.07% β-mercaptoethanol, then stirred at 4℃ for 2 h. The mixture was centrifuged at 6500 rpm for 30min and moved the supernatant to a new centrifuge tube. The precipitation was resuspended in 25 ml 0.1 M sodium acetate containing 0.07% β-mercaptoethanol, after well-distributed, the mixture was centrifuged at 6500 rpm for 30min, the supernatant was mixed with the last one. In order to remove the debris of mycelia , the mixed supernatant was centrifuged at 7500rpm for 30 min at 4℃. The supernatant was ultracentrifuged at 50000 rpm for 90 min using ?. After ultracentrifuged, removed the supernatant and dissolved the precipitation with 1 ml of TMD buffer (50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT) for 30 min. The mixture was centrifuged at 8000 rpm for 3 min at 4℃ and then added glycerol to final concentration was 15% to the supernatant, and stored at -80℃ for standby. For protein extraction, 400 ul vesicle sample were dissolved with 200 ul of lysis buffer (5 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 2% SB 3– 10, 40 mM Tris, 0.07% β-mercaptoethanol, 1 mM PMSF) and mixed uniform. The proteins were precipitated by addition of two volumes of pre-cold acetone containing 10% TCA and 0.07% β-mercaptoe thanol and kept at − 20℃ for 30 min at least and centrifuged at 13000 rpm, 4℃ for 3o min. The pellet was washed with pre-cold acetone for 3 times and dry naturally,. The protein was re-dissolved in 200 ul of lysis buffer and centrifuged at 13000rpm to get rid of the insoluble impurity. For further purity using the 2D Clean-Up kit (GE Healthcare).。
外泌体提取和鉴定介绍
外泌体提取和鉴定介绍
外泌体是细胞分泌的一种小囊泡，直径在30-150 纳米之间，含有多种生物分子，如蛋白质、核酸、脂质等。
它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。
外泌体的提取通常需要使用特殊的方法，以确保其纯度和完整性。
常见的提取方法包括超速离心、超滤、免疫亲和层析等。
这些方法可以根据外泌体的大小、表面标志物或其他特性进行分离和纯化。
鉴定外泌体的方法也有很多种。
其中一些常见的方法包括：
- 电子显微镜：观察外泌体的形态和大小。
- Western blot：检测外泌体表面标志物或内含物的蛋白质。
- 纳米颗粒跟踪分析：测量外泌体的粒径分布和浓度。
- 流式细胞术：根据外泌体的表面标志物进行分选和定量。
此外，还可以通过检测外泌体中的RNA 或DNA 来进一步分析其内容和功能。
这些鉴定方法可以帮助确定所提取的物质是否为真正的外泌体，并提供有关其特性和功能的信息。
需要注意的是，外泌体的研究仍然是一个相对较新的领域，不同的实验方法和技术可能会有所差异。
在进行外泌体提取和鉴定时，最好根
据具体的研究目的和实验条件选择合适的方法，并结合多种技术进行综合分析。
尿粗品提取工艺流程及注意事项
尿粗品提取工艺流程及注意事项
嘿呀！今天咱们就来好好聊聊尿粗品提取工艺流程及注意事项！
首先呢，咱们说说这尿粗品提取的工艺流程。
哇，这可是个精细的活儿！第一步呀，得收集尿液，哎呀呀，这可得保证尿液的来源干净卫生呢！第二步，进行初步的过滤，把那些大颗粒的杂质给去掉呀！第三步，就是加入特定的化学试剂，让有用的成分沉淀出来。
第四步，再通过离心或者过滤的方式，把沉淀的东西分离出来。
接下来，咱们讲讲注意事项！这可太重要啦！第一，收集尿液的时候，一定要注意卫生，不然可就麻烦啦！第二，化学试剂的添加量得严格控制，多了少了都不行呢！第三，操作过程中的温度、酸碱度都得时刻留意，稍有偏差可能就前功尽弃啦！第四，设备得经常清洗和维护，不然会影响提取效果的呀！第五，操作人员要做好防护措施，保护自己的安全哟！第六，提取出来的尿粗品要妥善保存，不能受潮或者被污染呀！第七，整个流程都要严格遵守相关的安全规定，这可不能马虎！第八，要对提取的尿粗品进行质量检测，确保符合标准哇！第九，实验数据要认真记录，方便后续分析和改进呢！第十，遇到问题及时请教专业人士，可别自己瞎琢磨呀！
哎呀呀，这尿粗品提取可真是个复杂又需要小心谨慎的工作呢！大家一定要牢记这些工艺流程和注意事项呀！。
从尿液中提取专利方法
从尿液中提取专利方法
从尿液中提取的方法，涉及一种通过分阶段洗脱获得尿液中的多种蛋白质的方法。
以下是具体步骤：
1. 取冻存尿液样本，37℃水浴解冻，4℃、3000g，离心10分钟，取上清，分装于4个离心管中，各20ml，编号依次为1、2、3、4。
2. 配置浓度为400mg/ml的聚乙二醇4000的氯化钠溶液以及浓度为
50mg/ml的TCEP的氯化钠溶液。
3. 在1号管和2号管中只加入5ml聚乙二醇4000的氯化钠溶液，混匀；
在3号管和4号管中加入已配置聚乙二醇4000以及TCEP的体积比为5:1
的混合试剂5ml，混匀。
将上述混匀液，4℃静置12h。
然后4℃、5000g、离心60分钟，弃上清，所得沉淀用100ul PBS重悬。
4. 各取20ul重悬液加入等体积RIA裂解液进行裂解，并进行外泌体标志物TSG101、CD63以及杂蛋白THP的检测。
另外，在步骤中提到使用包含不同浓度和类型的磷酸钾缓冲溶液、磷酸钠缓冲溶液或tris-hcl缓冲溶液进行分阶段洗脱，包括第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱。
以上信息仅供参考，具体的操作过程需要根据实际情况调整，并建议咨询专业人士获取准确信息。
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尿液中exosome的提取和鉴定一、exosome的提取（一）实验准备1.试剂：Sigma P2714，三乙醇胺，NaOH，蔗糖，去离子水耗材：超速离心管50mL，15mL（二）实验步骤(Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010)1. 将－80℃冻存的尿液取出解冻，涡旋，分装在50mL离心管中。
2.从-20℃中取出Sigma P2714 蛋白酶抑制剂，加入5mL二次水混匀。
3.每50mL尿液中加入625 μL溶解后的蛋白酶抑制剂（12.5 μL/mL Urine）。
4.于4℃，17000 × g 离心15 min。
（新鲜尿液25℃离心）（超速离心机型号Hitachi CP 80MX）5.取上清液置于超速离心管中，装3管，每管分装8mL， 4℃ 200 000 × g离心1 h。
（同上新鲜尿液25℃）6.离心后弃上清，再取17000 × g上清各8mL分置3管中，同上述条件离心。
7.弃上清，3管中各加50μL isolation solution，涡旋混匀30 s，转移到一个1.5 mL Eppendrof 离心管中。
8.加1 mL 200 mg/mL DTT 95℃孵育2 min。
9. 将上述溶液转移至高速离心管中，并加入8 mL isolation solution 17000 × g超高速离心10min。
10.弃上清，加50 μL isolation solution溶解沉淀物，在17 000 × g 离心15 min。
取上清做1D SDS/PAGE.11.Bradford 法测蛋白总浓度。
12.按1:4体积比加入5×SDS-Laemmli 缓冲液（含60 mg/mL DTT），涡旋混匀。
13.60℃加热10 min，-80℃保存。
（for western blot）朱墨桃师姐提取exosome方法(Zhu, Li et al. 2012)1.2,000 g for 10 min at 4 °C ，除去死细胞；2.取上清，4 °C 10,000 g 离心30 min，除去细胞碎片；3.取上清，4 °C 110,000 g离心70 min，弃上清；4.PBS清洗并重新分散，-80 °C保存。
5.microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)测定蛋白含量。
二、负染电镜分析（一）实验准备4% paraformaldehyde 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4），1 % Uranyl acetate乙酸双氧铀in dd-H2O，石蜡膜，200 目镍网（二）实验步骤1.将20μL exosomes 小体悬样与4% 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4）1：1混匀。
2.取10μL混合物滴于石蜡膜上，将200目镍网置于液滴中悬浮10min。
3.用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。
4.在20μL PBS液滴中悬浮5min，重复。
5.在20μL 去离子水液滴中悬浮5min，重复。
6.1% 乙酸双氧铀负染液负染1 min，用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。
7.将镍网正面朝上置于滤纸上，在有盖的玻璃皿中干燥15min。
8.样品准备完毕，进行EM分析。
三、1D SDS-PAGE（一）实验准备储存液配制：（1）2 M Tris-HCl（2）100 g/L SDS 溶液（3）75%（v/v）甘油（4）10 g/L 溴酚蓝溶液电泳工作液配制：（1）Acr-Bis液（2）4×分离胶缓冲液（3）100 g/L 过硫酸铵溶液（4）TEMED 成品液（5）5×样品缓冲液（6）10×电泳缓冲液12% 电泳胶的配制考马斯亮蓝染色液和脱色液（二）实验步骤1.制胶装好灌胶器，在分别在两个洁净小烧杯（离心管也可）内配制分离胶和浓缩胶混合液（注意灌胶时再加AP和TEMED），配方见《SDS-PAGE溶液配制及具体流程》。
以枪头搅拌约10-20 sec，灌胶分离胶。
在胶面上小心地铺上几毫米厚的水层，然后常温凝固30 min （胶面与水层间界面清晰说明胶已凝好）。
此时倒出水层，浓缩胶混合液加入AP和TEMED，枪头搅拌均匀，加入灌胶器，上覆水层，然后插入梳子，凝固2h。
2.上样跑胶打开固定玻璃板的塑料夹，取出梳子，取下胶板装入电泳槽，在电泳槽中加入电泳缓冲液，上槽灌满，下槽电泳缓冲液的量根据电泳胶数目参照电泳槽上的刻度线确定。
根据蛋白定量结果，每条泳道上样量在15 μg左右。
2×样品缓冲液与样品1：1混合，上样体积一般为15-20μL，插入上样梳上样。
电泳条件：step 1: 80V 5min,step 2: 150V 2h,注意观察溴酚蓝的位置，一般半小时左右完成。
3.染色及脱色关闭电源，取出电泳后的胶板，用刮胶板小心撬开玻璃板将胶取下（不可用蛮力，用二次水润湿比较容易取下来），置于带盖的玻璃皿中，加入染色液（以刚没过凝胶即可），于微波炉加热约40-70 sec至染色液微沸（注意盖子不要盖的太紧以防染色液爆沸喷溅），然后于脱色摇床上继续染色约10 min。
染色液请倒入专用的回收容器内。
淋洗凝胶冲去剩余染料，然后倒入适量的脱色液，微波加热至微沸后于摇床上脱色约10 min，重新换上脱色液室温摇床脱色至完全去除背景色。
4.扫描及后处理脱色后的凝胶置于扫描仪上扫描凝胶图像并保存，不立即酶解的凝胶在二次水中4℃冰箱保存。
（尽快处理，防止蛋白扩散和变质）四、1D SDS-PAGE蛋白质条带胶内酶解（一）实验准备（二）实验步骤1.将胶条用手术刀片或保险刀片按顺序切下，每条带约1.5 mm3大小，7 cm 胶条约切12 ~ 15条；2.将胶条切成1-2 mm2的小块，置于1.5 mL EP管中，记录条带号及相应的位置；3.用200 μL MilliQ超纯水振荡清洗5 min，重复一次；4.脱色（1）加入100 μL 25 mM NH4HCO3/50 % ACN，涡旋并孵育10 min,吸干上清；（2）重复（1）至蓝色褪去，胶粒萎缩变白；（3）真空干燥胶粒至全干（~20min）。
5.还原烷基化（1）向干胶粒中加入50 μL 10 mM DTT/25 mM NH4HCO3，涡旋。
56℃还原反应1 h，冷至室温；（2）弃掉上清，立即加入50 μL 55 mM碘乙酰胺，涡旋后避光室温反应45 min；（3）弃掉上清，加入100 μL 25 mM NH4HCO3涡旋并孵育10 min清洗胶粒；（4）弃掉上清，100 μL 25 mM NH4HCO3/50 % ACN涡旋并孵育10 min以脱去胶粒中的水分，重复1 次；（5）真空干燥胶粒至全干（~20min）。
6.胶内酶解（1）加入3倍于胶粒的酶解液冰浴30 min(或放4℃冰箱)，使胶粒复水；（2）除去过量的Trypsin溶液后，用50 μL 25 mM NH4HCO3清洗胶粒几次，最后用50 μL 25 mM NH4HCO3覆盖胶粒；（3）涡旋，37℃反应过夜。
7.提取肽段（1）将酶解后上清液转移至1.5 mL离心管中；（2）向胶粒中加入30 μL 50 % 乙腈/0.1 %甲酸，涡旋孵育30min，并超声5 min；（3）吸取上清与第一次的上清合并；（4）重复步骤（2）（3）；（5）涡旋后冷冻浓缩至5-10 μL（~30min）。
加入0.1 %甲酸 15 μL，涡旋。
五、质谱鉴定1.ZipTip Protocol ？？（1）将50 μL样品加入到96孔板，每个样品一个孔；（2）将20 μL elution solution加入到干净的离心管中，每个样品一个；（3）Wetting ZipTip：吸10 μL wetting solution入针尖，打出，重复操作；（4）Equilibrate ZipTip：吸10 μL 平衡液，打出，重复操作；（5）Binding：来回吸、打样品10次；（6）Washing：吸washing solution，打掉；重复2次；2.Elution：将离心管中20 μL elution solution吸打10次，不要引入空气；3.将样品浓缩至5 μL加入15 μL 0.1 % 甲酸，混匀后进样；4.根据质谱结果搜库。
六、IEF/SDS-PAGE双向电泳（一）第一向等电聚焦（7cm胶条，pH 3-10）1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1mL/管），置室温溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4/6、5/7各2.5μL，充分混匀。
3. 从小管中取出200μL水化上样缓冲液，加入50μL样品，充分混匀。
4. 从冰箱取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 3-10），于室温放置10分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品(7cm胶条一般加125-250μL，10-100μg)。
在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。
确保胶条与电极紧密接触。
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖1.5 mL矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
9. 对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
7cm胶条水化12小时（18℃）主动水化（50V）或被动水化S0 50V rapid 12h 水化（若被动水化，此步省却） S1 250V linear 30min 除盐S2 500V rapid 30min 除盐S3 4000V linear 3h 升压S4 4000V rapid 20,000Vhr 聚焦S5 500V rapid 99h 保持10.聚焦结束的胶条应立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
（二）第二向SDS-PAGE电泳1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。
配12mL凝胶溶液，每块凝胶6mL，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。