凝胶胶内酶解技术路线
4.12第四章酶的分离纯化
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
胶内酶切及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定操作步骤
蛋白质肽谱制备1．凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。
★凝胶染色分为：A:硝酸银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色★胶粒分为：A:一维SDS-Page胶粒 B:二维双向电泳胶粒2．凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。
★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。
★如果为一维SDS-Page胶粒，需要加两个步骤：①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机）3．凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min.4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。
★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。
补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。
（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。
）5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。
6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。
7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。
（冻干的肽段放-20度冰箱保存）8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。
（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。
）9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。
待干，再点0.5ul基质，上质谱。
溶液配制1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中2．脱色液配方乙腈：50mMNH4HCO3=1:13. 10mmol/LDTT还原液：称取1.54mg溶于1ml100mMNH4HCO3中4．55mmol/L烷基化溶液：称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug-20度保存(粉末+40ul水——>2~6ul分装。
胶内酶解
一、试剂准备1．30mmol/L K3Fe(CN)6铁氰化钾9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水2．100mmol/L Na2S2O3硫代硫酸钠24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水3．200mmol/L NH4HCO3碳酸氢铵0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水4. 覆盖液（酶解缓冲液）40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水5. 萃取液50％ACN，0.1% TFA6. 胰蛋白酶贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。
工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL7. 脱色液银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合考染脱色液：50％ACN, 40mmol/L NH4HCO3以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。
二、实验步骤1. 切胶用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。
2. 脱色银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。
（3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O）考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。
作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。
供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。
以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
胶内酶解
1.2.2 蛋白质谱鉴定（1）胶内酶解斑点切取：用剪刀将200 μL枪头尖端剪掉约1-2cm，孔的直径约为2-3 mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中（离心管灭菌后浸泡于75%乙醇，用时取出自然干燥）。
操作时注意减少污染，戴帽子手套操作，尽量减少所切取蛋白质点周围的凝胶体积，勿使样品干燥。
脱色、脱水：每管加入100 μL脱色液（50% 乙腈，25 mM 碳酸氢铵），室温放置30 分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。
加入60 μL 乙腈使凝胶脱水10 min，丢弃上清液。
酶解：每块凝胶加入约8 μL（浓度为12.5 ng/μL）溶于100 mmol/L 碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃ 吸胀1 h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12 h。
加入10 μL 5% 三氟乙酸，1 h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。
加入10 μL 2.5% 三氟乙酸，1 h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。
将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。
用0.2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。
保存？？？（2）质谱鉴定①点靶：将冻干肽混合物中加入2μL 0.2% 三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。
取每个样品0.6 μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
再取0.6 μL饱和基质α-手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800 Proteomies Analyzer)。
②质谱鉴定：样品用4800串联飞行时间质谱仪4800 Proteomies Analyzer 进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。
肽指纹图谱（PMF）质量扫描范围为800-4000Da，且一级质谱强度最大的 5 个峰进行串级质谱分析。
谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。
酶的提取和分离纯化
酶的提取与分离纯化
补充：发酵液的预处理 ——固液分离
（1）菌种 （2）培养基 （3）无机离子的去除 （4）杂蛋白质的去除 （5）色素及其他物质的去除
主要方法是离心分离和过滤
3.4.2 离心分离
定义
是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不 同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
依据
要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密 度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法 和离心条件。
1、离心机
常速离心机（低速离心机）
最大转速8000 r/min，相对离心力（RCF）1×104 g 以下 用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，酶的 结晶等较大颗粒的分离。
目标
将目的酶最大限度地溶解出来 保持生物活性
原则
根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
3.3 酶的提取
方法
提取方法 盐溶液提取 酸溶液提取
使用的溶剂或溶液
提取对象
0.02～0.5mol/L 提取在低浓度盐溶液中溶 盐溶液 解度较大的酶 pH2～6 水溶液
提取在稀酸溶液中溶解度 大，且稳定性较好的酶 碱溶液提取 pH8～12 提取在稀碱溶液中溶解度 水溶液 大且稳定性较好的酶 有机溶剂提取 与水混溶的有机 提取与脂质结合牢固或含 溶剂 有较多非极性基团的酶
电场膜分离
扩散膜分离
补充1：四种常用膜分离技术的基本特征
补充2：四种常用膜分离过程的截留特性
3.4.4 层析分离（色谱技术）
定义
是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分 的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在 两个相中。 其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相 则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度 移动，从而达到分离。
基因工程生产人胰岛素的技术路线
基因工程生产人胰岛素的技术路线人胰岛素是一种重要的药物，用于治疗糖尿病等疾病。
传统的人胰岛素生产方法是从猪胰腺中提取，但存在感染风险和胰岛素结构与人体有差异等问题。
为了解决这些问题，科学家们利用基因工程将人胰岛素基因克隆到大肠杆菌等微生物中，通过基因表达、突变、筛选、纯化等步骤，生产出高质量的人胰岛素。
技术路线如下：1. 克隆人胰岛素基因：从人胰岛细胞中分离出mRNA，利用反转录酶将其转录成cDNA。
通过PCR扩增，将人胰岛素A、B链合成成一个完整的人胰岛素基因。
在该过程中，要注意选择合适的启动子、终止子、信使RNA起始和终止密码子等。
将该基因插入到载体中，如大肠杆菌质粒pBR322中的限制性内切酶位点，使其能够在大肠杆菌中表达。
2. 基因表达：将含有人胰岛素基因的重组质粒经过转化技术，导入到大肠杆菌中，利用细胞自身的代谢活性，让其经过转录、翻译等步骤，表达出人胰岛素前体蛋白(Proinsulin)。
Proinsulin蛋白由A、B两个多肽链组成。
其中A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。
A链和B链由两个酯键连接在一起，形成Proinsulin。
Proinsulin在细胞内被剪切成人胰岛素A、B链和C肽。
其中C肽并无生理作用，被细胞内酶降解分解。
3. 突变筛选：由于大肠杆菌系统中表达的人胰岛素前体蛋白形成的Proinsulin无法自行成熟转化为人胰岛素，因此必须人为帮助B链成熟多肽链的脱落。
突变技术可以改变Proinsulin分子内酶解的敏感性和特异性，使B链多肽链和C肽之间的酯键能够被限制酶特异性水解，得到纯度较高的人胰岛素。
4. 纯化：通过离心、层析、过滤等技术，将发酵液中的人胰岛素纯化提取。
常用的纯化方法包括离心、酸性沉淀、离子交换层析、有机溶剂沉淀、逆流层析、凝胶过滤等。
整个生产过程包括基因克隆、表达、突变、筛选、纯化，一般需要经过6-7天的培养过程。
通过基因工程生产人胰岛素，不仅能够解决传统人胰岛素来源的问题，而且能够生产高质量、高效率的人胰岛素。
卡拉胶降解酶的分离纯化
卡拉胶降解酶的分离纯化1.前言卡拉胶是一种具有商业价值的亲水凝胶（属天然麒麟糖植物胶），主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。
卡拉胶是由，1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。
与琼胶相比，卡拉胶所有的β-连接和α（1-4）连接的残基都是D构型，但琼胶在α（1-4）连接半乳糖基上在中是L-构型。
对卡拉胶来说，它的结构在α（1-4）连接的半乳糖基上还形成了3，6-内醚，见图[1]卡拉胶可分为八种类型。
κ-卡拉胶，τ-卡拉胶，λ-卡拉胶，γ-卡拉胶，υ-卡拉胶，φ-卡拉胶，ξ-卡拉胶，ω-卡拉胶。
另一种分类方法是根据己确定的各种类型的理想的卡拉胶重复二糖的结构特征，以及1，3-连接的D-半乳糖上的硫酸基位置，可将各类型的卡拉胶分类为β-族卡拉胶、κ-族卡拉胶、λ-族卡拉胶。
卡拉胶是从红藻如角叉菜、杉藻、麒麟菜等中提取的一种水溶性多糖。
我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶，后统一为卡拉胶。
有许多种红藻类都可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶有近一半是用麒麟菜作原料，此外还有角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶[2]。
而卡拉胶酶主要有κ-卡拉胶酶，τ-卡拉胶酶，λ-卡拉胶酶等，其主要是依据所降卡拉胶降解酶的分离纯化解的底物命名的。
许多海洋微生物如Pseudoalteromonas carrageenovora,Pseudomonas carrageenovora[3,4]等都能产出卡拉胶酶，其他来源例如在海洋软体动物（Marine mollusks）体内也有[5]。
根据作用机制的不同卡拉胶降解酶可分为保持型和转换型两种。
1995年，Philippe Potin等人报道了交替单胞菌A.carrageenovora的cgkA基因所编码的κ-卡拉胶降解酶，预测其相对分子质量为44,212 Da，远远大于经SDS-PAGE测定的从发酵液纯化出的酶蛋白的相对分子质量35 kDa。
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凝胶胶内酶解技术路线
用到的试剂如下：
1．100mMNH4HCO3：称取1.975g NH4HCO3溶于250mL的双蒸水中
2．脱色液：乙腈:50mM NH4HCO3=1:1
3．10mmol/LDTT还原液：称取0.0154g溶于10mL 100mM NH4HCO3中
4．55mmol/L烷基化溶液：称取0.102g碘乙酰胺溶于10mL100mM NH4HCO3
5．酶解贮液：Trypsin(Promega，V5111)制备为0.5μg/μL水溶液，分装1-3μg－20℃保存6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.125μg于25mMNH4HCO3溶液
7．肽提取液Ⅰ：5%TFA（v/v）水溶液
8．肽提取液Ⅱ：乙腈:5%TFA=1:1
9、考染脱色液（100ML）：乙醇25 ml、乙酸8 ml、水67ml混合
一、Hela细胞线粒体、细胞核、胞浆的提取。
（详见各试剂盒的操作说明书）
二、蛋白质SDS-PAGE分离和酶切肽提取
蛋白质SDS-PAGE分离,每个泳道上样量为50μg,共10个泳道，恒压100伏。
考马斯
亮蓝染色，加脱色液至无色。
电泳后样品的酶切肽提取过程如下：
1．考马斯亮蓝染色凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片。
2．加入脱色液(乙腈:50mM NH4CO3=1︰1)100μL浸泡，振荡20min，弃去溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽。
3.加入50μL DTT（10mmol/L）还原液，30min，56℃；弃废液，加100μL乙腈脱水5-10min。
4．加入50μL碘乙酰胺(55mmol/L)烷基化，于暗处30min。
5．加入100μL脱色液，洗5-10min,弃废液，冰冻干燥20min。
6．加入15-20μL酶液（12.5ng/μL），置于4℃放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液15-20μL，使胶完全浸没。
37℃保温15小时或过夜。
7．加提取液Ⅰ（5%TFA）100μL，40℃加热水浴1小时，30min时，超声3min左右. 8．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取液Ⅱ(50%乙腈，2.5%TFA)100μL，30℃保温1小时，30min时，超声3min左右
9．将提取液合并，氮气吹干乙腈后，真空离心干燥。
将相差10KD左右的蛋白条带提取液进行混合，如30KD-40KD,减少样本量，节约成本。
10.加入5-10μL的5%TFA溶液混匀，质谱分析。
三、液相色谱分离和质谱鉴定
1液相色谱条件
酶切后冻干的肤段用色谱A液(5%乙睛，0.1%三氟乙酸水溶液)溶解，离心后取上清，色谱柱进样19川。
毛细管反相柱的色谱条件为:缓冲液有流动相A液组成，洗脱液由不同比例的流动相A(0.1%甲酸水溶液)及流动相B(0.1%甲酸溶于99.9%乙睛中)组成，总时间是120分钟，0一60分钟，流动相中B比例由5%上升至40%;60一75分钟，B液比例由40一95%;维持巧分钟后，以A液平衡色谱柱30分钟，控制两个泵的流速使分流后流至色谱柱的流速为1一2ul/分钟。
2质谱条件
由反相色谱流出的洗脱组分经由纳升级电喷雾接口从金属针喷出，电喷雾的电压 1.8KV;粒子传输毛细管温度设为180℃;质谱分析以一个全扫描(FullMS:350-1600) 及三个分段扫描
(MassRange:m/z350-700/680-1000/950-2600模式，一级质谱采集后依次选取离子强度大的三个离子经CID采集串联质谱，归一化碰撞能量为35%;采用串联质谱扫描的动态排除功能(Dynamicexclusion)，设置排除时间是5分钟。
3.数据标准
由串联质谱产生的原始文件经Xcalibur处理得到dia文件，用Bioworks3.O软件(ThermoFirmigan TM公司)的sequest进行检索，数据库来自国际蛋白质数据索引（International Protein Index，IPI）的Human IPI3.24数据库。
对鉴定数据的评价采用了搜索混合数据库的方法，首先将下载的人数据库做成反转数据库，即将人蛋白质的氨基酸序列完全倒置，而后再与原始的人数据库结合，从而构成混合数据库。
质谱产生的原始数据就根据构成的混合数据库进行检索。
检索后根据Sequest算法对不同电荷的肽段给出一系列的卡值，即Xcorr值。
对于每次卡值得到的肽段，再根据倒置序列占全部肽段的比例来计算假阳性率。
根据文献报道，我们将假阳性率控制在5%，最终得到的数据卡值标准如下:Xeorr值，1.84(+l)，1.85(+2)，2.69(+3);△Cn值大于0.08。
同时搜索反库用于评价数据可信度。
检索设定肽段序列氨基酸固定修饰为半胱氨酸(C，+57.02Da)、甲硫氨酸(M，+15.99Da)，肽段质量允许误差 1.4Da，水解酶为胰酶。