胶内酶解
生命科学前沿技术智慧树知到课后章节答案2023年下苏州大学
生命科学前沿技术智慧树知到课后章节答案2023年下苏州大学苏州大学第一章测试1.样本在鞘液流的环包下形成流体动力学聚焦，使其不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过（）。
A:荧光照射区B:X光照射区C:激光照射区D:散射光照射区答案:激光照射区2.流式细胞仪测定的标本，不论是外周血细胞，还是培养细胞，首先要保证的是（）。
A:双倍体细胞悬液B:单倍体细胞悬液C:单细胞悬液D:白细胞悬液答案:单细胞悬液3.流式检测时，前向角散射信号可以检测细胞膜厚度。
（）A:错 B:对答案:错4.流式细胞仪综合了激光技术、电子技术、流体技术和计算机技术。
（）A:错 B:对答案:对5.流式细胞术可检测的生物学颗粒包括（）。
A:DNAB:细菌C:细胞D:蛋白质答案:DNA;细菌;细胞;蛋白质第二章测试1.以下哪个不是荧光显微镜的用途（）。
A:光操控研究细胞动态变化B:荧光信号定量分析C:测量细胞膜电信号变化D:细胞核，细胞膜标记答案:测量细胞膜电信号变化2.荧光标记的方法有（）。
A:样本自发荧光成像B:量子点、镧系元素表C:新型有机染料标记，Alexa Fluo系列D:荧光蛋白转染标记，GFP等E:传染有机染料标记，DAPI，FITC等答案:样本自发荧光成像;量子点、镧系元素表;新型有机染料标记，Alexa Fluo系列;荧光蛋白转染标记，GFP等;传染有机染料标记，DAPI，FITC等3.荧光染料不可以用来标记活细胞。
（）A:错 B:对答案:错4.关于激光扫描共聚焦显微镜与宽场荧光显微镜，描述正确的是（）。
A:激光扫描共聚焦显微镜与宽场荧光显微镜成像原理是一样的B:使用激光扫描共聚焦显微镜核宽场荧光显微镜时可以设定曝光时间C:激光扫描共聚焦显微镜有pinhole，荧光显微镜没有pinholeD:激光扫描共聚焦显微镜都是倒置显微镜，荧光显微镜都正置显微镜答案:激光扫描共聚焦显微镜都是倒置显微镜，荧光显微镜都正置显微镜5.影响激光扫描共聚焦显微镜成像质量的条件有（）。
胶内酶解
一、试剂准备1．30mmol/L K3Fe(CN)6铁氰化钾9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水2．100mmol/L Na2S2O3硫代硫酸钠24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水3．200mmol/L NH4HCO3碳酸氢铵0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水4. 覆盖液（酶解缓冲液）40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水5. 萃取液50％ACN，0.1% TFA6. 胰蛋白酶贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。
工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL7. 脱色液银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合考染脱色液：50％ACN, 40mmol/L NH4HCO3以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。
二、实验步骤1. 切胶用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。
2. 脱色银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。
（3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O）考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。
卡拉胶降解酶的分离纯化
卡拉胶降解酶的分离纯化1.前言卡拉胶是一种具有商业价值的亲水凝胶（属天然麒麟糖植物胶），主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。
卡拉胶是由，1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。
与琼胶相比，卡拉胶所有的β-连接和α（1-4）连接的残基都是D构型，但琼胶在α（1-4）连接半乳糖基上在中是L-构型。
对卡拉胶来说，它的结构在α（1-4）连接的半乳糖基上还形成了3，6-内醚，见图[1]卡拉胶可分为八种类型。
κ-卡拉胶，τ-卡拉胶，λ-卡拉胶，γ-卡拉胶，υ-卡拉胶，φ-卡拉胶，ξ-卡拉胶，ω-卡拉胶。
另一种分类方法是根据己确定的各种类型的理想的卡拉胶重复二糖的结构特征，以及1，3-连接的D-半乳糖上的硫酸基位置，可将各类型的卡拉胶分类为β-族卡拉胶、κ-族卡拉胶、λ-族卡拉胶。
卡拉胶是从红藻如角叉菜、杉藻、麒麟菜等中提取的一种水溶性多糖。
我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶，后统一为卡拉胶。
有许多种红藻类都可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶有近一半是用麒麟菜作原料，此外还有角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶[2]。
而卡拉胶酶主要有κ-卡拉胶酶，τ-卡拉胶酶，λ-卡拉胶酶等，其主要是依据所降卡拉胶降解酶的分离纯化解的底物命名的。
许多海洋微生物如Pseudoalteromonas carrageenovora,Pseudomonas carrageenovora[3,4]等都能产出卡拉胶酶，其他来源例如在海洋软体动物（Marine mollusks）体内也有[5]。
根据作用机制的不同卡拉胶降解酶可分为保持型和转换型两种。
1995年，Philippe Potin等人报道了交替单胞菌A.carrageenovora的cgkA基因所编码的κ-卡拉胶降解酶，预测其相对分子质量为44,212 Da，远远大于经SDS-PAGE测定的从发酵液纯化出的酶蛋白的相对分子质量35 kDa。
SDS-PAGE蛋白质胶内酶切
蛋白质胶内酶切步骤一、溶液准备考染脱色液：50mM NH4HCO3/ACN（1：1，vol/vol）；银染脱色液：30mM K3Fe(CN)6/Na2S2O3(1:1,vol/vol);铁氰化钾/硫代硫酸钠覆盖液：25mM碳酸氢铵溶液；酶液：2ug分装后的promega质谱级胰酶，用160ul 覆盖液充分混和溶解；萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2，vol/vol）；二、操作步骤1.水洗胶块2次，吸走液体；2.胶块脱色。
1）考然胶块：加考然脱色液100ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色1h 左右，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；水洗胶块2次，将脱色后的染料洗去，吸走液体；2）银染胶块：加银染脱色液50ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色5min，至胶块颜色完全褪去；迅速将脱色液吸走，并加水终止；水洗胶块3次，至胶块变得完全无色透明；3.胶块脱水。
加50%ACN溶液，让胶块脱水；再加100%CAN，让胶块变白完全脱水；分别吸走液体；4.还原烷基化（SDS一维电泳条带，请做此步；2D电泳点不需要此步）1)加入50ul 10mMDTT溶液（溶于25mM NH4HCO3），56℃水浴50min；离心，吸走液体；2)加入50ul 55mM IAA溶液（溶于25mM NH4HCO3），避光反应15min；吸走液体；3)加入100ul水洗胶块，将反应剩余液体吸走；4)胶块脱水，重复步骤4；6．加入胰酶5-20ul（具体视胶块大小而定），让胶块充分吸胀，变透明20min，再剩余1-3ul的酶液；7. 37℃水浴过夜16h；8. 若做MALDI-MS分析，则直接取酶解液上清点样做质谱即可；若做ESI-LCMS分析则需要萃取胶内的多肽，分别加100ul萃取液，超声10min萃取两次，冷冻干燥待做LCMS；。
蛋白胶内酶解方法
三、制备方法（一） 胶内酶解方法[9]1.操作步骤1)用手术刀片切下电泳胶上目标条带(或用自制切点器切下感兴趣的点)，置于EP管中(胶块切成约1mm3大小)，同时切下空白胶块作对照2)加入200～400ul 100mM NH4HCO3/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干(注：脱色液体积过量为好，脱色至透明，不必担心蛋白的损失，因为完整蛋白在此条件下很难被洗脱)(若为银染)[10]取30～50ul 30mM K3Fe(CN)6:100mM Na2S2O3=1:1(体积比)加入胶块内，清洗至蛋白点棕色消失，去除上清，立刻加200ul水终止反应，10分钟后，去除上清，再加入100ul 100mM NH4HCO3,静置20分钟，去除上清3)(若是2-D gel，则跳至第8步) 每管加入90ul 100mM NH4HCO3，10ul 100mM DTT，56℃孵化30分钟，还原蛋白质(注：溶液体积过量，若温度为室温，反应时间相应延长至1～2小时)4)去上清，每管加100ul 100%ACN，5分钟后吸去5)每管加入70ul 100mM NH4HCO3，30ul 200mM IAA(现配，避光保存)，暗处20分钟6)去上清，每管加入100ul 100mM NH4HCO3，室温15分钟7)去上清，加入100ul 100%ACN，5分钟后吸去，冻干8)冻干后，各加入5ul 2.5～10ng/ulTrypsin溶液，置于4℃冰箱30～60分钟，使胶块充分吸胀(若仍有剩余液，吸出打掉)注：50ng酶量是基于考染一块胶1mg的上样量，12.5ng是基于银染一块胶100ug的上样量。
上样量增加，酶量同比增加，酶与被分析蛋白质量比一般为1：20～1：100[11,12]9)再加入20~30ul左右50mM NH4HCO3缓冲液(无Trypsin)，PH 7.8～8.0(Promega)注：缓冲液体积视胶块体积而定，一般没过胶块20ul左右10)37℃反应过夜，20小时左右11)吸出蛋白酶解液，转移至新EP管中，原管加入100ul 60% ACN/0.1%TFA,超声15分钟，吸出溶液，并入前次溶液，反复抽提3次，合并，冻干12)样品制备完成，可以复溶，点样，进行质谱分析2.注意事项1)若样品种类较多，切记编号离心管，样品对号入管2)考染方案各注释均适用于银染方案3)整个操作过程应注意角蛋白等的污染4)佩带一次性乳胶手套，使用洁净的离心管及Millipore H2O5)不同公司的酶，最适PH范围不同，调节PH值3.试剂配制1)100mM NH4HCO3：称取1.581g NH4HCO3(MW 79.06)溶于200ml Milli Q水中2)50 mM NH4HCO3：称取0.791g NH4HCO3溶于200ml Milli Q水中3)100mM DTT：称取DTT(MW 154.3)0.0154g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中4)200mM IAA：称取IAA(MW 185.0)0.0370g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中5)TPCK-Trypsin无需配制，Promega公司已提供成品，浓度为0.5ug/ul，用时可按需稀6)30mM K3Fe(CN)6：称取K3Fe(CN)6(MW 329.25)0.0099g溶于1ml Milli Q水中7)100mM Na2S2O3·5H2O：称取Na2S2O3(MW 248.11)0.0248g溶于1ml Milli Q水中8)银染脱色液：将6)和7)以1:1体积混合，现配。
凝胶胶内酶解技术路线
凝胶胶内酶解技术路线用到的试剂如下：1．100mMNH4HCO3：称取1.975g NH4HCO3溶于250mL的双蒸水中2．脱色液：乙腈:50mM NH4HCO3=1:13．10mmol/LDTT还原液：称取0.0154g溶于10mL 100mM NH4HCO3中4．55mmol/L烷基化溶液：称取0.102g碘乙酰胺溶于10mL100mM NH4HCO35．酶解贮液：Trypsin(Promega，V5111)制备为0.5μg/μL水溶液，分装1-3μg－20℃保存6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.125μg于25mMNH4HCO3溶液7．肽提取液Ⅰ：5%TFA（v/v）水溶液8．肽提取液Ⅱ：乙腈:5%TFA=1:19、考染脱色液（100ML）：乙醇25 ml、乙酸8 ml、水67ml混合一、Hela细胞线粒体、细胞核、胞浆的提取。
（详见各试剂盒的操作说明书）二、蛋白质SDS-PAGE分离和酶切肽提取蛋白质SDS-PAGE分离,每个泳道上样量为50μg,共10个泳道，恒压100伏。
考马斯亮蓝染色，加脱色液至无色。
电泳后样品的酶切肽提取过程如下：1．考马斯亮蓝染色凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片。
2．加入脱色液(乙腈:50mM NH4CO3=1︰1)100μL浸泡，振荡20min，弃去溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽。
3.加入50μL DTT（10mmol/L）还原液，30min，56℃；弃废液，加100μL乙腈脱水5-10min。
4．加入50μL碘乙酰胺(55mmol/L)烷基化，于暗处30min。
5．加入100μL脱色液，洗5-10min,弃废液，冰冻干燥20min。
6．加入15-20μL酶液（12.5ng/μL），置于4℃放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液15-20μL，使胶完全浸没。
37℃保温15小时或过夜。
7．加提取液Ⅰ（5%TFA）100μL，40℃加热水浴1小时，30min时，超声3min左右. 8．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取液Ⅱ(50%乙腈，2.5%TFA)100μL，30℃保温1小时，30min时，超声3min左右9．将提取液合并，氮气吹干乙腈后，真空离心干燥。
蛋白质胶内酶切步骤
蛋白质胶内酶切步骤一、溶液准备考染脱色液：50mM NH4HCO3/ACN（1：1，vol/vol）；银染脱色液：30mM K3Fe(CN)6/Na2S2O3(1:1,vol/vol);铁氰化钾/硫代硫酸钠覆盖液：25mM碳酸氢铵溶液；酶液：2ug分装后的promega质谱级胰酶，用160ul 覆盖液充分混和溶解；萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2，vol/vol）；二、操作步骤1. 水洗胶块2次，吸走液体；2. 胶块脱色。
1）考然胶块：加考然脱色液100ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色1h 左右，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；水洗胶块2次，将脱色后的染料洗去，吸走液体；2）银染胶块：加银染脱色液50ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色5min，至胶块颜色完全褪去；迅速将脱色液吸走，并加水终止；水洗胶块3次，至胶块变得完全无色透明；3. 胶块脱水。
加50%ACN溶液，让胶块脱水；再加100%CAN，让胶块变白完全脱水；分别吸走液体；4. 还原烷基化（SDS一维电泳条带，请做此步；2D电泳点不需要此步）1) 加入50ul 10mMDTT溶液（溶于25mM NH4HCO3），56℃水浴50min；离心，吸走液体；2) 加入50ul 55mM IAA溶液（溶于25mM NH4HCO3），避光反应15min；吸走液体；3) 加入100ul水洗胶块，将反应剩余液体吸走；4) 胶块脱水，重复步骤4；6．加入胰酶5-20ul（具体视胶块大小而定），让胶块充分吸胀，变透明20min，再剩余1-3ul 的酶液；7. 37℃水浴过夜16h；8. 若做MALDI-MS分析，则直接取酶解液上清点样做质谱即可；若做ESI-LCMS分析则需要萃取胶内的多肽，分别加100ul萃取液，超声10min萃取两次，冷冻干燥待做LCMS；。
酶解法制备骨明胶
治。此时此刻 ， 成功只有靠正道去驾驭 ， 任何
Байду номын сангаас
车间进行生产。新工艺与传统工艺 的磷钙获
（ 下转 第 １９页 ） ３
第 ３ 卷第 ３期 １
李培仁 ： 可食性薄膜和 可食性包覆层
・１ ９・ ３
组分薄膜有效地抑止水分 的迁徙 。含 甲基纤 道 的 多糖 基薄 膜相 比 ， 有较 低 的水 蒸气 渗 透 具 维素（ Ｃ 或羟丙基 甲基纤维素（ Ｐ ） Ｍ ） Ｈ ＭＣ 和脂 性 。 含有脂肪 酸 蔗糖 酯 和羧 甲基 纤 维 素 钠 的 肪酸的包 覆层也可用 以控制抗 菌剂 （ 山梨 包覆层 ， 如 有效地减慢 了水果产品的成熟速率 。
表 １ 传统 工艺 生产 １ ９ ００吨明胶的销售收入
５ ＜ ５ ｌｏ ５ 见 ） 新工艺改变了传统工艺生产模式 ， 提胶道 ７ ％ ， ２０Ｂｏｍ —ｇ为 ２ ％ （ 表 ２ 。从 销 同样生产 １０ ０ ０吨明胶 ， 销售收入可 次只有 ２次。从冻力指标来区分 ， 新工艺生产 售额来看 ， 的冻 力 ＞２０ Ｂｏｍ —ｇ的 明胶 占总 产 量 的 ５ ｌ ｏ 达 到 ５２ ６５万 ， 多盈 利 近 ７ ５万元 人 民 币 。 ２
煎 熬 是 成 功 的 煎 熬 。 因 为 “ 业 难 ， 业 更 时髦 的社 会 陋 习 在 中 国大地 上从 未 得 以彻 底 创 守
难” 。人们可 以在奋 斗 中千方百计 克 服各种 根 除 。赤橙 黄 绿青 蓝 紫 ， 就 出一个 色彩缤 纷 造 各样 的艰难 险阻， 但是却 很难驾驭成功 ， 经受 的世 界 。中 国企业 运作 与 经营之 路 ， 须亦 不 无 住 成功 的煎 熬 。 因而 往 往 在 创 业 征 途 上 很 少 该只有一条可走。实事求是 ， 企 ” 因“ 制宜 ， 才 犯错 ， 当凯歌高奏 、 庆辉煌 之后却常 常把握 是企 业 得 以持 续 发 展 的正 确 方 向 与 策 略 。丁 共 不住 自己。实际上 ， 当你在行业中成了万众仰 立国的反思与选 择 ， 我 品味到 了真 正 的精 使 慕 的领军人物 ， 一切细小的琐事却都成了大政 美。不敢藏私 ， 故与有心 的诸位同仁分享 。
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1.2.2 蛋白质谱鉴定
（1）胶内酶解
斑点切取：用剪刀将200 μL枪头尖端剪掉约1-2cm，孔的直径约为2-3 mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中（离心管灭菌后浸泡于75%乙醇，用时取出自然干燥）。
操作时注意减少污染，戴帽子手套操作，尽量减少所切取蛋白质点周围的凝胶体积，勿使样品干燥。
脱色、脱水：每管加入100 μL脱色液（50% 乙腈，25 mM 碳酸氢铵），室温放置30 分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。
加入60 μL 乙腈使凝胶脱水10 min，丢弃上清液。
酶解：每块凝胶加入约8 μL（浓度为12.5 ng/μL）溶于100 mmol/L 碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃ 吸胀1 h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12 h。
加入10 μL 5% 三氟乙酸，1 h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。
加入10 μL 2.5% 三氟乙酸，1 h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。
将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。
用0.2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。
保存？？？
（2）质谱鉴定
①点靶：将冻干肽混合物中加入2μL 0.2% 三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。
取每个样品0.6 μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
再取0.6 μL饱和基质α-手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800 Proteomies Analyzer)。
②质谱鉴定：样品用4800串联飞行时间质谱仪4800 Proteomies Analyzer 进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。
肽指纹图谱（PMF）质量扫描范围为800-4000Da，且一级质谱强度最大的 5 个峰进行串级质谱分析。
谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。