蛋白质学

质 谱 法 用 于 蛋 白 质 顺 序 测 定
（1）必要性：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导 致的氨基酸残基的修饰问题，Edman降解不能解决N端 封闭肽的测序问题 ，而质谱法能使问题迎刃而解 。 （2）20世纪80年代初出现快原子轰击质谱能准确确定 的分子量达到数千。相继发展的串行质谱可以把 FAB(fast atom bombardment)得到的分子离子进行再一 次惰性原子轰击，使肽链在不同部位断裂从而得到一 组片段的质谱信息，使多肽顺序测定得以实现。
2.1 蛋白的提取 样品制备原则
1、尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质
的损失。
（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白质；
（2）不同类型的蛋白质需要不同的方法；
（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两
种方法； 2、细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解， 从特殊亚细胞器提取蛋白还需分级分离。
棕黄色或棕黑色。
特点：
（1）相对于考染，灵敏度高，可达200pg。 （2）其线性范围不是很好，定量不很准确 （3）但由于存在戊二醛的特异性反应， 对下一步的酶切肽谱提取存在困难。 现在比较流行的做法是，用银染法进 行分析处理，再用考染法来进行样品微量 制备，用于质谱鉴定。
2.4 图像分析
2-DE胶上有好几千个点，要从中找到 差异表达的蛋白点，光靠肉眼是不行的， 需要有专门的软件来进行图像分析。图象 分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比 和数据分析。现在已经有很多商业化的软 件，比较常用的有PDQuest(Bio-Rad)、 Imagemaster 2DPlattium(GE Health)、 Melanie(Genebio)，Progenesis(Nonlinear Dynamics)、Z3(Compugen)等。
2.5 质谱技术
基本原理：
样品分子离子化后，根据离子间质荷比 （m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。
质谱技术的特点：
（1）分子电离时保留整个分子的完整性， 不会形成碎片离子。 （2）高灵敏度、高通量及自动化，从而 能与蛋白质组大规模研究相适应等优点。
样品导入系统
离子源
质量分析器
检测器
真空泵
固相pH梯度等电聚焦的优点
克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 稳定的可以随意精确设定的pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二
轮分析，大大提高了分辨率及重复性。
双向电泳操作流程
双向电泳特点

可分离10～100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配
肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting)：
蛋白质被酶切位点专一的的蛋白酶水解后得到的 肽片断质量图谱。由于蛋白质的氨基酸序列不同，其肽 混合物质量数也具特征性，所以称为肽质量指纹谱，用 于蛋白质的鉴定。
基于串联质谱的肽序列测定
用特定蛋白水解酶作用于蛋白质，将得到的 肽段送入一级质谱，产生前体离子，经过一定选 择的前体离子在碰撞室发生CID。结果是前体离 子肽骨架酰胺键的特异性断裂，并产生了一系列

MALDI-TOF MS是目前蛋白的肽指 纹谱(PMF)测定最常用的方法。其特点是： 精确度高，可达0.1个质量单位；灵敏度高， 能检测皮摩尔甚至是埃摩尔量的蛋白；分 析时间短，测定仅需几分钟；自动化程度 高。 ESI是以连续离子化方式使样品电离， 已经运用到很多串联质谱中，如三级四极 杆质谱、四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱、 离子阱(ion-trap)质谱等。ESI是液相进样， 它可以与高效液相色谱(HPLC)、毛细管电 泳(CE)等技术联用，因此可以用于复杂混 合物的分析。
可用于确定氨基酸序列的y 型和b 型等离子。获得
CID二级质谱图后可算出肽序列。
CID: collisioninduced desociation (碰撞诱导解离)
样品制备
与IPG胶条水化 胶内直接染色
IPG电泳
与上样缓冲液浸润 SDS-PAGE
染色
转PVDF膜
取出蛋白点
浓缩于多孔吸附柱上 胰酶等消化 反向HPLC分离 MALDI-MS， PSD片段分析 未知 ESI-MS-MS、微测序
（3）20世纪80年代末出现了电喷雾质谱和基质辅 助激光解吸电离-飞行时间质谱。能对分子量达30 万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差率可精 确到十万分之一。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的 应用可成功地进行蛋白质C端与N端的顺序测定， 该方法一个显著的优点是用样品量极微（12pmol），且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。 （4）质谱技术不能完全取代Edman降解与其他蛋 白质分析方法。通常是联合运用这些技术。
capillary electrophoresis，CE
注意：
二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白，
由于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键还
原和烷基化处理，即蛋白质的高级结构已被
消除，最终得到的是蛋白质的亚基。
2.3 蛋白质的检测技术
2-DE胶蛋白质点的检测方法大致有：考 马斯亮兰染色法、银染法、负染法、荧光染色 法、放射性同位素标记法等。这几种检测方法 的灵敏度各不相同。目前最常用的是银染法和 考马斯亮兰染色法。
（一）考马氏亮蓝染色
考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类
三苯基甲烷衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350
（红兰色） 、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合 生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰 （ 595nm 最大），且在比较宽的范围内（15-20 mg ） 扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在 595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下， 这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。
分步法提取植物蛋白
如果我们只想要细胞特定部位的蛋白， 我们可以利用分步法提取植物蛋白，其流 程如图1. 通过逐步增加蛋白提取液的变性 程度，把蛋白分成三个组分。第一个组分 主要是细胞质蛋白，第二组分主要是膜蛋 白，第三组分主要是核蛋白。
2.2 双向电泳
基本原理：
第一向等电聚焦(Isoelectrofocusing，IEF)根 据蛋白的等电点不同进行分离；第二向SDS聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按亚基分子量大小进行分离。 固化pH梯度胶（IPG）的出现，大大地提高了等 电聚焦的分辨率与稳定性(Gorg等,2004)。现在商品 化的IPG胶条pH范围从2.5-12，这使得极酸和极碱蛋 白的分离成为可能。
2-DE技术的缺点
极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质， 极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋 白质用此种技术难于有效分离。
胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱 联用实现自动化。
新型非凝胶技术

液相色谱法
liquid chromatography，LC 分配色谱法
吸附色谱法
离子交换色谱法
排阻色谱法

毛细管电泳
蛋白质组学根据使用策略的不同可以分为 基于胶的蛋白质组学、基于质谱的蛋白质组学、 基于芯片的蛋白质组学等。目前应用最多的还 是基于胶的蛋白质组学。
基于胶的蛋白质组学
基于胶的蛋白质组学主要流程包括蛋白提 取、双向电泳分离（2－DE）蛋白、蛋白染色、 图象分析、蛋白点切割、蛋白酶解和质谱 （MS）鉴定。其中双向凝胶电泳技术和质谱鉴 定技术是蛋白质研究的两大关键技术。
植物蛋白质组学及其研 究方法
一、蛋白质组及蛋白质组学的含义
Proteome : Protein +Genome （蛋白质组）
Genome:
一个细胞或一个生物体包含的所有遗传信息。
所有蛋白质的存在形式及其活动方式。
Proteome：一种细胞/组织/生物体某个时间段所包含的
蛋白质组学的概念： 蛋白质组学是后基因组时代涌现的新研究 领域，借助于多种技术从整体水平研究生物 体内蛋白质。 蛋白质组学研究主要包括蛋白的表达模 式和蛋白的功能模式两个方面。
（最多105）
（4）基因可采用PCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有扩
增和自动测序技术
二、蛋白质组研究的技术路线
蛋白质组研究的基本技术路线
蛋白质样品的制备 双向电泳 凝胶中的蛋白 图像分析
转印至膜上的蛋白
混合肽
肽指纹图 肽序列质谱数据 蛋白质质量 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 N端测序
T hank you
记录放大器
质谱仪结构示意图质Leabharlann 分析流程主要质谱类型
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 （matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）
蛋白质组学的应用范围
蛋白质组学包括三项主要应用：
1. 蛋白质表达谱 2.蛋白质修饰谱 3. 蛋白质网络谱
蛋白质组学研究远比基因组学研究复杂
（1）一个生物对象的蛋白质数量远大于基因数量
如人的基因组有3-5万个基因而蛋白质则有30-100万；
（2）基因组的组成是固定的，蛋白质组组成是动态的；
（3）细胞内蛋白质的拷贝数（108）远比基因拷贝数大
3、样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80°C，
不要反复冻融样品。
4、通过超速离心清除所有的杂质，主要去除盐、小 分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、 脂类、酚类等。 5、加入尿素之后，加温不要超过37°C，以防蛋白 质氨甲酰化。
对于植物蛋白的提取最常用的方法 是TCA/丙酮沉淀法（Granier，1988）。 它的优点在于在沉淀蛋白的同时，抑 制了蛋白酶的活性，去除了一些干扰 物质（如盐、色素和酚类物质）。