SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项
SDS-PAGE原理、试剂配制和注意事项
SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。
作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
PAGE凝胶快速银染试剂盒使用说明
PAGE凝胶快速银染试剂盒使用说明货号:G7210规格:1L保存:室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月。
试剂盒内容：G7210染色液A200ml染色液B1ml染色液C100ml显色液D100ml试剂E2g注：1L规格指可配制的银染液的体积，实际使用次数根据PAGE胶大小不同而不同。
产品说明:蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，然后用还原剂如甲醛在碱性环境下使Ag+还原成银颗粒，可把蛋白电泳带染成黑褐色。
它主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。
其灵敏度比考马斯亮蓝高，PAGE凝胶快速银染试剂盒整个过程操作简单，灵敏度高，能检测到10ng以下的蛋白条带。
操作步骤:一、染色液配制(无水乙醇自备)需要配制的染色液体积根据PAGE胶的大小而定，一般的mini-PAGE胶需要20-30mL。
配制用的器皿清洗干净后用去离子水涮洗，染色液须用去离子水配制，现用现配。
如果配制的溶液体积不是100mL，可以按比例改变各成分用量。
1.固定液：取40ml无水乙醇，10ml染色液A加去离子水至100ml，混匀；2.敏化液：取30ml无水乙醇，10ml染色液C加去离子水至100ml，混匀；3.银染液：称取0.12g试剂E，用50ml去离子水溶解，加入10ul染色液B混匀，加去离子水至100ml现用现配。
4.显色液：10ml显色液D和30ul染色液B加入去离子水至100ml，混匀，现用现配。
5.终止液：取5ml染色液A加去离子水稀释至100ml，现用现配。
二、染色：1.PAGE电泳结束后，将PAGE蛋白胶转移至玻璃平皿或搪瓷盘中，用固定液固定30min。
2.将PAGE胶转移至敏化液中，使染液没过PAGE胶，室温作用30min。
可置于摇床上缓慢摇晃3.弃去敏化液，用去离子水漂洗三次，每次10min。
4.将PAGE胶转移至银染液中，使染液没过PAGE胶，室温摇晃40min。
5.将PAGE胶转移至显色液中，使显色液没过PAGE胶，室温摇晃，该显色一般在10min 左右。
蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项
蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项货号：G0180规格：20T有效期：6个月有效。
产品内容：试剂(A):Silver Stain Sensitizer(500×)2×1ml RT试剂(B):Silver Stain(100×)10ml RT避光试剂(C):Silver Stain Developer(5×)2×100ml RT避光试剂(D):Silver Stain Stop Buffer(10×)100ml RT产品说明：蛋白快速银染试剂盒(Protein Fast Silver Stain Kit)是一种快速的可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE等蛋白银染染色的试剂盒，该试剂盒含有增敏步骤，可明显降低背景。
其优点还在于：1、操作简单、快速；2、可用于2D凝胶的银染，并可进行后续的质谱检测；3、目的条带清晰；4、不含甲醇。
Protein Fast Silver Stain Kit与Protein Silver Stain Kit 相比，前者操作速度更快，当检测灵敏度可能低于后者，尤其是在检测小分子量蛋白质的时候。
本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
自备材料：1、水平摇床或侧摆摇床2、去离子水(超纯)3、乙醇、冰乙酸操作步骤(仅供参考)：1、准备工作：以下操作以8.5×5.5cm、厚度为1.0mm的凝胶为例，以凝胶全部浸没到溶液为准，一般用量是25ml，对于凝胶体积较大的，各溶液的使用量需按凝胶体积比例放大。
整个银染过程应在摇床上进行，摇床转速控制在60～70rpm。
提前配制固定液，即按无水乙醇:冰乙酸:去离子水=5:1:4的比例配制。
提前配制洗涤液，即按无水乙醇:去离子水=1:4的比例配制。
2、水洗：电泳结束后，取凝胶放入去离子水中清洗2次，每次5min。
3、固定：取凝胶放入50～100ml固定液中，在摇床上室温摇动15～20min，重复固定步骤1次。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
SOP SDS-PAGE银染标准操作规程
文件号: QC-SOP-102 Page 1 of 4 Version: A/0 Print Date:题目：SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验流程目的：为了使员工迅速掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验而编写的操作过程。
范围：成员负责部门：QC Quality Assurance Department姓名签字日期起草人：批准人：QA：生效日期：文件号: QC-SOP-102 Page 2 of 4Version: A/0 Print Date:1.概要1.1 本操作流程用来描述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染的标准操作步骤。
2. 适用范围2.1本流程适用于操作人员进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验的操作过程。
2.2 本流程适用于在普通实验室中进行操作。
3. 责权3.1质量保证部门有责任确保操作人员接受过该流程相关实验技术及操作的培训。
3.2质量保证部门有责任确保该流程操作完全按照以下规范进行。
3.3质量保证部门有责任定期检查修订本流程。
4. 材料准备4.1 试剂和溶液4.1.1 SDS丙烯酰胺凝胶电泳所需的溶液见SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程4.1.2 固定液30ml甲醇，12ml乙酸，50ml水，50 µl甲醛（100ml）4.1.3 漂洗液35%乙醇的水溶液4.1.4 致敏液0.02%硫代硫酸钠的水溶液4.1.5 银染液0.2%硝酸银的水溶液4.1.6 显色液6g碳酸钠，50µl甲醛，2ml致敏液，加水定容到100ml4.1.7 终止液38ml甲醇，12ml乙酸，加水定容到100ml4.1.8 保存液1%乙酸的水溶液4.1.9 分子量标准蛋白标准分子量参照物使用Fermentas公司的PageRuler（10KD~170KD）4.1.10 蛋白样品待分离的蛋白样品可为纯化的蛋白，也可为细胞裂解液。
4.2 设备：4.2.1 蛋白电泳仪公司BIO-RAD 电源型号PowerPac Universal4.2.2 单道可调式移液器公司Eppendorf文件号: QC-SOP-102 Page 3 of 4Version: A/0 Print Date:4.2.3电子天平公司Acculab4.3 耗材：吸头（T-20，T-200，T-1000，T-5000）烧杯( 50mL，三个)Eppendof离心管玻璃表面皿（2个）5. 相关文件5.1 SOP-PUB-EQU-009 PH计（PB-10型）的操作使用以及清洁保养5.2 SOP-PUB-EQU-010 Acculab电子天平操作、清洁与校准5.3 SOP-PUB-EQU-013 单道可调式移液器（Thermo/Gilson）的操作、清洁与校准5.4 SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程6. 操作步骤6.1. 参照SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。
SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书
SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书Cat.No：Lot No：原理：本技术中，待分离的样品在有SDS-PAGE和还原剂的存在下通过加热而变性并被去污剂所包被。
SDS可使蛋白质带上大量的负电荷，其带电荷的多少正好与多肽的长度成正比。
聚丙烯酰胺凝胶上样后，在高电压的作用下，蛋白组分向正极（阳极）迁移。
由于所有的蛋白所带的负电荷与其分子大小成正比，因而蛋白就仅仅根据其分子量的大小不同而被分离—凝胶的分子筛效应。
蛋白质的分子量就可以通过与标准蛋白的凝胶迁移率进行比对而得到。
凝胶电泳后，特定的凝胶条带可以通过染色而观察到，并且可通过被动扩散或电洗脱从凝胶上进行回收。
两种最常用的染色方法是考马斯亮蓝法和银染法，这两种方法的蛋白条带检测灵敏度可分别达到50ng和5ng。
由于考马斯亮蓝法使用简便，并可以对收集的蛋白带作进一步分析，因而较为常用。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用范围：1）蛋白质纯度的分析；2）蛋白质分子量的测定；3）蛋白质浓度的测定；4）蛋白质水解的分析；5）免疫沉淀蛋白的鉴定；6）免疫印迹的第一步；7）蛋白质修饰的鉴定；8）分离和浓缩用于产生抗体的抗体的抗原；9）分离放射性标记的蛋白质。
试剂盒组成：1．30%预制聚丙烯酰胺胶（4℃保存）200ml2．1.5M TrisCl（PH=8.8）200ml3．1.0M TrisCl（PH=6.8）50ml4．10%SDS 30ml5．10%过硫酸铵（4℃保存）30ml6．去离子水250ml7．TEMED（4℃闭光保存！）1ml8．5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液250 ml9．考马斯亮蓝染色剂50ml10. 考马斯亮蓝脱色剂250ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液用时以去离子水1：4稀释，配成1×-甘氨酸电泳缓冲液工作液。
凝胶的配制：（1）将玻璃板安装固定好切误把玻璃弄坏（2）进行分离胶的配制（3）加入TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中，同时留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm）再在胶液面上小心注入一层水（约2—3mm高）以排除气泡和阻止氧气进入凝胶溶液。
sds page凝胶电泳步骤
sds page凝胶电泳步骤以SDS-PAGE凝胶电泳步骤为标题的文章SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和测量方法，其步骤包括蛋白质样品的制备、样品加载、电泳运行、染色和图像分析等。
本文将详细介绍SDS-PAGE凝胶电泳的步骤及相关注意事项。
一、蛋白质样品的制备准备要分离的蛋白质样品，并将其加入样品缓冲液中，以使蛋白质溶解并保持其天然构象。
样品缓冲液通常包含Tris-HCl缓冲液、甘油、SDS和β-巯基乙醇等成分，用于维持样品的pH值和还原环境，使蛋白质完全展开。
二、样品加载将制备好的蛋白质样品加载到凝胶孔中。
通常使用微量吸管或微量注射器将样品缓冲液缓慢地注入凝胶孔中，确保样品完全进入凝胶中。
三、电泳运行将已加载样品的凝胶板放置在电泳槽中，确保凝胶完全浸泡在电泳缓冲液中。
然后将电泳槽连接到电源，并设置合适的电压和电流参数。
根据需要，可以选择常规电泳或快速电泳。
在电泳过程中，蛋白质样品会在凝胶中被电场推动，根据其分子大小和电荷不同，被分离成不同的带状条带。
较小的蛋白质分子迁移速度较快，而较大的蛋白质分子迁移速度较慢。
四、染色电泳结束后，需要对凝胶进行染色以可视化蛋白质带状条带。
常用的染色方法有银染色和Coomassie蓝染色。
银染色对蛋白质敏感性高，但操作繁琐；而Coomassie蓝染色操作简单，但对蛋白质敏感性相对较低。
五、图像分析通过使用分析软件或图像扫描仪，将染色后的凝胶图像数字化，并进行分析。
可以测量蛋白质带状条带的相对迁移距离和相对强度，进而确定蛋白质的分子大小和相对丰度。
在进行SDS-PAGE凝胶电泳实验时，还需要注意以下事项：1. 准备工作确保操作台和仪器干净，并准备好所需的试剂和设备。
避免在实验过程中发生交叉污染。
2. 样品加载在加载样品时，应避免空气泡和溢出。
确保样品均匀地加载到凝胶孔中，以获得清晰的带状条带。
3. 电泳运行条件根据蛋白质样品的大小和分离需求，选择合适的电压和电流参数。
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SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项
银染注意事项:
1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。
2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。
乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。
如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。
3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。
因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。
4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.
5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。
6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS 的去离子水。
7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。
8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。
9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。
10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。
11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。
改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。
12. SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。
减少巯基乙醇的用量即可避免。
13. 凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍。
14. 染色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求。
15. 银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。
我们做蛋白质电泳的人都知道，银染色很灵敏，有很强的说服力，但通常胶背景较深，不易扫描。
在这里介绍一下低背景的蛋白质银染方法。
AgNO3, 0.075% HCHO(现用现加) 20 min
-15 min
：说明，此步中洗涤过程要控制好，时间太长，可能显色时间太长甚至染不出色；反之，时间太短，银没有洗干净，背景变深。
但做几次以后就很快掌握了。