核酸适体技术
核酸适配体
S 1989年，悉尼· 奥尔特曼、托马斯· 切赫因为对RNA的催化
作用的研究共同获得诺贝尔化学奖。
支持RNA为生命起源假说的可能证据：
S 如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生
物；
S 如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能
性RNA的"痕迹"；
S 如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生
核酸适配体的化学本质与识别 机理
S 核酸适配体的化学本质是核酸，它与配体的结合是基于单
链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条件下， 它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键 作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结 (pseudoknot)、凸环(stem loop)、G2四分体(G2quartet)等稳 定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间 有较大的接触面积，能与靶物质的紧密结合，具有高亲和 力和高特异性。
APTAMER
适配体
S
Aptamers
(from the Latin aptus - fit, and Greek meros - part)
S 核酸适配体（Nucleic Acid aptamers） S 多肽适配体（Peptide aptamers）
什么是核酸适配体？
S 核酸适配体是具有稳定的二级结构，能够和靶标分子特异性结合
核酸适配体的应用
S 核酸适配体在分析化学中的应用 S 核酸适配体与疾病诊断和新药研发
核酸适配体在分析化学中的应用
S 靶物质的分析与检测
该方面应用的基本思路是将各种报告基团，如荧光试剂，定点标 记在aptamer核苷酸上，然后在一定条件下，使aptamer与靶物质 发生相互作用，再通过对报告基团的信号检测实现对靶物质的定 性检测或定量分析。 Tan等将aptamer应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏 检测生物分子的方法—分子aptamer信标(MAB)。他们将凝血酶 aptamer的5´和3´端分别标记上荧光素和猝灭剂，凝血酶不存在时， aptamer分子呈茎环结构，两端的荧光素与猝灭剂相互靠近发生 能量转移而观察不到荧光；在结合凝血酶后aptamer分子构象改 变，致使MAB的荧光素与猝灭剂分开从而可以检测到荧光信号， 并且随着凝血酶浓度的增加荧光强度增强。
SELEX技术
SELEX技术及核酸适体的介绍SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)。
利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体 (Aptamer)。
SELEX技术的基本思想是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合，通过重复的筛选与扩增，洗去与靶物质不结合或与靶物质有高亲和力外的核酸分子，分离纯化与靶物质高度亲和的核酸适体。
SELEX技术及核酸适体具有库容量大，适应范围广泛；分辨率高，实用性强；亲和力高；筛选过程相对简便、快速、经济；适配子体积小等优势。
该技术体外诊断和体内治疗及药物的开发等方面都具有应用。
服务内容：1. 核酸适体的SELEX筛选（基于毛细管电泳技术）。
2. 适体与靶标结合及亲和力的验证。
3. 提供适体单克隆。
客户提供1. 蛋白质类靶标——可为蛋白质溶液/冻干粉/表达在细胞表面的蛋白质分子： (1) 如为蛋白质溶液提供50μg纯度>99%的蛋白质； (2) 告之蛋白质的确切名称，并附上生物或环境安全的相关信息； (3) 如为表达在细胞表面的蛋白质分子，请提表达该蛋白的细胞和空宿主细胞；由于筛选过程中需要活细胞，我们将为此种样品提供短时的细胞培养服务（收费），客户可提供可配制500ml培养基所需的材料。
2. 小分子物质靶标： (1) 提供50μg小分子与载体的偶联物（附偶联率检测报告）； (2) 告之小分子的确切名称，并附上生物或环境安全的相关信息； (3) 提供游离的小分子物质（溶液或固体，视具体物质而定）。
我们提供 1. 能够与靶标结合，序列各异且亲和力（Kd）在10-8～10-10nmol/L的核酸适体单克隆若干（视最终测序结果）； 2. 核酸适体亲和力检测（毛细管电泳法）结果； 3. 对应核酸适体单克隆测序的峰图； 4. 带有核酸适体（载体）单克隆的大肠杆菌菌液； 5. 完整的实验报告（实验步骤、筛选过程中的富集率数据及相关的照片等）。
核酸适体技术在食品安全分析中的应用
核酸适体技术在食品安全分析中的应用徐敦明;吴敏;邹远;张强;吴崔晨;周昱;刘贤进【摘要】Aptamers are all new ligands with a high affinity for considerably differing molecules ranging from largetargets as proteins over peptides, complex molecules to drugs and organic small molecules or even metal ions. These molecules are identified and selected through an in vitro process called systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Aptamers are widely used, including medical and pharmaceutical basic research, drug development, diagnosis, and therapy. Analytical and separation tools bearing aptamers as molecular recognition and binding elements are another big field of application. The SELEX method was modified over the years in different ways to become more efficient and less time consuming, to reach higher affinities of aptamers selected and higher automation of process. In reviewing this technology, the article covers the topic, following a general introduction, under the headings: the SELEX protocol, the development of aptamers by use of SELEX, and the application of aptamers in food safety.%核酸适体(Aptamer)是经体外筛选技术(SELEX)筛选出的能特异结合蛋白质或其它小分子物质的寡聚核苷酸片段,对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力.经过十几年的发展,SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具,被广泛应用到分子生物学、基因组学、临床医学等领域.高通量筛选的技术特点与Aptamer精确识别、易体外合成与修饰等特性,使得Aptamer在分析化学与生物医药研究方面具有广阔的应用前景.本文对提高筛选效率和效果为目标的核酸适体筛选技术新进展、核酸适体技术在食品安全分析中的应用进行了回顾,展望了核酸适体在食品安全分析上的应用前景.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2011(039)006【总页数】9页(P925-933)【关键词】核酸适体;指数富集配体系统进化;食品安全;残留分析;有机小分子;评述【作者】徐敦明;吴敏;邹远;张强;吴崔晨;周昱;刘贤进【作者单位】厦门出入境检验检疫局,厦门,361026;厦门出入境检验检疫局,厦门,361026;厦门大学化学化工学院,厦门,361005;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,南京,210014;厦门大学化学化工学院,厦门,361005;厦门出入境检验检疫局,厦门,361026;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,南京,210014【正文语种】中文1953年,DNA双螺旋结构的提出,是现代分子生物学诞生的里程碑[1,2]。
核酸适配体简介
核酸适配体简介
nucleic acid oligonucleotides aptamers
适配体的类型：
★反义核苷酸链
★随机核苷酸链
反义核苷酸链
通常包含15-20个核苷酸,其碱基组成与它们的 靶序列是互补的。但是在实际应用中, 存在反 义寡核苷酸容易被核酸酶降解、对特定靶位点 的识别不够好、有一定毒性等问题,所以要对 适配体中的核苷酸进行了各种各样的化学修饰。 修饰位点一般在碱基、磷酸骨架等。★
寡核苷酸序列形 成可与配体特异 性共价结合的二 级结构，配体如 氨基酸、多肽、 甚至金属离子都 可以同随机 相互作用Selex技术简介
Selex技术简介
核酸适配体的应用
随着筛选技术研究的发展,越来越多靶分子获 得高亲和力的、高特异性的适配体,并广泛应 用于多个研究领域,特别是分子识别检测领域。 与成熟的抗体实验相比,目前适配体可以补充 抗体性能的不足, 但是不能完全取代抗体。
前景展望
核酸适配体（Aptamer）是一类新型的识别分子。 与单克隆抗体相比，其分子量较低（15-50碱基）， 没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构 改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复 性，可在常温下保存和运输。这些优点使适体有望 取代和超过抗体，在生命分析中起重要的作用 。
基于目前的现状和机遇，我们可以从以下四个方面 开展核酸适体的研究工作： 1.首先根据研究和实际应用的需要，筛选重要的生物 活性分子的适体，从而发展系列的针对特定分子的 分析方法。而不囿于现有适体的缺乏。 2.研究所筛选适体的结构特性，优化、改造适体的结 构，从而进一步缩小适体的分子大小、提高生物稳 定性、增加在复杂生物体系中特异性。 3.针对应用的需要，发展更巧妙、更简便的适体分子 探针；构建方便、实用的检测方法（如目视比色分 析、传感分析、原位成像分析等）。 4.模拟适体分子的结构，设计和筛选小分子量的识别 分子，构建可自由透过细胞膜的小分子探针，用于 生命活体分析。
核酸适体技术研究发展现状
核酸适体技术研究发展现状
核酸适体技术是一种基于核酸分子的高度特异性识别和结合其他分子的技术。
它的研究发展现状可以从多个方面来进行分析。
首先，我们可以从技术原理和方法的角度来看。
核酸适体技术主要包括SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）和方法的改进。
SELEX技术是通过不断筛选和进化，使得核酸适体与特定的靶分子结合，从而获得高度特异性的适体。
近年来，科研人员对SELEX技术进行了许多改进，如分子进化技术的应用、高通量筛选技术的发展等，使得核酸适体的筛选效率和特异性得到了显著提高。
其次，从应用领域来看，核酸适体技术在生物医药领域具有广泛的应用前景。
例如，核酸适体可以作为药物靶向输送系统的一部分，用于治疗癌症、病毒感染等疾病。
此外，核酸适体还可以用于生物传感器、分子识别和分子成像等领域，为生命科学研究提供了重要的工具和方法。
另外，从研究热点和趋势来看，近年来，随着生物技术和纳米技术的发展，人们对核酸适体技术的研究越来越深入。
例如，一些
学者致力于开发新型的核酸适体筛选平台，以提高筛选效率和特异性；还有一些研究者将核酸适体技术与纳米材料相结合，开发出具
有生物传感和药物释放功能的纳米材料复合物，为生物医药领域带
来新的突破。
总的来说，核酸适体技术在研究发展现状方面取得了许多进展，从技术原理和方法、应用领域以及研究热点和趋势等多个角度来看，都表明了这一技术的巨大潜力和广阔前景。
希望未来能有更多的科
研成果和应用突破，推动核酸适体技术的进一步发展和应用。
核酸适配体
S 钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的 Gquadruplex 二级构型并对此结构 有一定的稳定(wěndìng)作用, 因此可以通过监测核酸适配体二级结构信号的变化实现对 钾离子的检测
Lindner等还通过aptamer芯片系统成功地从混合蛋白质中识 别出专一性的蛋白，而且利用凝血酶aptamer证明了在同一 芯片上同时检测两种蛋白方法的可行性。总之，寡核苷酸 aptamer作为低分子量的分子受体，它在芯片上能专一性地 检测蛋白质而且很稳定，以它为阵列来捕获蛋白质将为蛋 白质组学研究的发展起到重共四要十六页作用。
共四十六页
亲和介质 分离 (jièzhì)
S 一些具有亲和表面的介质也用于适配体的筛选，如琼脂糖、 纤维素及具有亲和表面的小珠或小柱等。
S 如J.Colin Cox等人利用链霉亲和素标记的磁珠完成了溶菌 酶适配体的自动化筛选。具体(jùtǐ)流程为：通过链酶亲和素 与生物素的相互作用，将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。 随后特异结合序列的分离，RT-PCR扩增和转录都通过设定 的程序自动完成，最后筛选得到的序列克隆到载体中进行 测序鉴定。通过这种自动化筛选工作台，Cox等只用了不到 两天的时间就完成了12轮的筛选。
S Macugen是一种选择性血管内皮生产因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 拮抗剂。
共四十六页
核酸适配体的化学本质(běnzhì)与识 别机理
S 核酸适配体的化学(huàxué)本质是核酸，它与配体的结合是基 于单链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条 件下，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、 氢键作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结 (pseudoknot)、凸环(stem loop)、G2四分体(G2quartet)等稳 定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间 有较大的接触面积，能与靶物质的紧密结合，具有高亲和 力和高特异性。
核酸适配体技术研究
前景展望
核酸适配体（Aptamer）是一类新型的识别分子。 与单克隆抗体相比，其分子量较低（15-50碱基）， 没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构 改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复 性，可在常温下保存和运输。这些优点使适体有望 取代和超过抗体，在生命分析中起重要的作用 。
基于目前的现状和机遇，我们可以从以下四个方面 开展核酸适体的研究工作： 1.首先根据研究和实际应用的需要，筛选重要的生物 活性分子的适体，从而发展系列的针对特定分子的 分析方法。而不囿于现有适体的缺乏。 2.研究所筛选适体的结构特性，优化、改造适体的结 构，从而进一步缩小适体的分子大小、提高生物稳 定性、增加在复杂生物体系中特异性。 3.针对应用的需要，发展更巧妙、更简便的适体分子 探针；构建方便、实用的检测方法（如目视比色分 析、传感分析、原位成像分析等）。 4.模拟适体分子的结构，设计和筛选小分子量的识别 分子，构建可自由透过细胞膜的小分子探针，用于 生命活体分析。
核酸适体的应用
▲在蛋白质组学的研究中，用aptamer制备成的核酸
配基阵列更是具有抗体芯片和2-D胶不可比拟的优 势，成为备受青睐的一项工具.
核酸适体的应用
▲作为示踪剂，aptamer在疾病诊断与成像方面也有
巨大应用潜力．已有荧光标记的抗人凝血素核酸配 基用于体内诊断的报道．新药研发方面，aptamer 可以鉴定药物靶标，尤其是多道自动工作站的应用 更是加速药物靶标高通量筛选和功能鉴定的进程.
通过这些研究，希望开发出一系列拥有 自主知识产权的分离基质、诊断试剂和 工具，以成功的应用来促进适体在生命 分析应用中的发展。
• 其筛选流程包含和达尔文进化理论一样的三个过程 分别是自发突变 ﹑自然选择和大量增殖.
aptamer introduction核酸适配体的介绍
Ito等人利用三碘甲腺原氨酸作为反向筛选物质，获得能特异识别四碘甲腺原氨 酸的核酸适体。
Methods, 2000, 22: ed它们的删减往往会减弱核酸适体的结合 作用。但在有些筛选中，固定序列也可能与中间的随机序列形成一些二级结构从而 干扰核酸适体的筛选。因此，在得到核酸适体序列后还需要进一步的截短实验来确 定核酸适体的核心序列。
1.1 新型分子探针——核酸适体 (aptamer)
核酸适体：能高亲和性结合靶分子的20-50碱基的寡聚核苷酸
“Aptamer”: Latin word “aptus” 适合 + Greek word “meros” 粒子
1.1.1 核酸适体的优点
核酸适体与抗体的性能比较
性能
பைடு நூலகம்
核酸适体
抗体
大小
5-15 KD1.2.2 核酸的种类（1）结构限制性（structurally constrained library）：将随机碱基置于能形成特 定二级结构（如发夹、G-四面体或假结等二级结构）的固定序列中。当知道靶标分 子优先结合某种特定的结构蛋白时或增加所选择的核酸适体的稳
（2）反向筛选（counter selection）是为了获得专一性更强的核酸适体而提出 的，主要是通过一些方法去除能结合与靶分子类似物质的核酸序列。这种方法 首先在筛选茶碱核酸适体的实验中使用。
Jenison等人利用与茶碱结构仅差一个甲基的咖啡因作为反向靶标对茶碱进行筛 选，获得了只结合茶碱而与咖啡基因组中某段感兴趣的核酸序列（50-500 碱基）两端引入用于PCR扩增的固定序列。
1.2.3 核酸适体靶分子的多样性
简 Zn2+ 单 Ni2+ 体 系 金属离子
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SELEX技术
SELEX是指数富集配体系统进化(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment)的简称,其筛选流程包 含和达尔文进化理论一样的三个过程,分别是自发突变、自然 选择和大量增殖。
一“自发突变”
• 利用现有的分子生物学技术人工合成一个 含有10
• 核酸适体出现以后,由于其高特异性与高亲 和性的特性,使得核酸适体立即在纳米技术 领域引起了科学家们的注意,应用适体的分 子信标名为“适体信标”(Aptamer beacon)。适体信标更加稳定灵敏核酸适体， 将在发展各种可以取代抗体的蛋白质探针、 测定体内蛋白质和研究其功能、疾病早期 诊断等方面具有极大的应用潜力。
几个亚群,而针对同一表位的核酸适体的重
要功能区有相同的结构域(motif)。核酸适
体与配体的相互作用力包括如下几种类
型:“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、
静电作用和形状匹配等。
核酸适体应用进展
• 生物传感器 • 生物传感器在快速检验中发挥着重要作用,它将分 子识别与信号传导器相结合。应用抗体的免疫传 感器已获得很大进步,但固化在传感器表面的抗体 易衰减而失败,利用适体制成的适体传感器具有以 下优点:(1)固化的核酸可反复变性与复性即使在热、 盐浓度、络合剂使用下也可反复变性;(2)适体容易 以一定厚度连结在固相表面;(3)适体发生信号物广 泛,可以用荧光、酶、生物素、亲和素等。
研究核酸与蛋白质的相互作用的方法 ----核酸适体技术
• 核酸适体(aptamer)指的是经体外筛选技术 SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的 能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡 聚核苷酸片段,对可结合的配体有严格的识 别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物 传感器、新药开发以及纳米技术等方面有 着广泛的用途。
这一步起到达尔文进化论中自发突变的作
用。
二“自然选择”
• 单链的随机寡核苷酸序列,容易形成可 与蛋白质、核酸等配体特异性共价结 合的二级结构。在这一高亲和力特异 性结合的基础之上,配体如进化论中的自然选择作用。
三“大量增殖”
• 药物设计和临床治疗 • 由于核酸适体与蛋白特异性结合后往往能 抑制蛋白的功能,而且它缺乏免疫原性,体内 渗透力强,因此是一种很有发展前途的药物 分子,可用于直接干扰疾病的发生发展过程。 迄今筛选到的HIV、HCV、多种肿瘤及肿瘤 相关因子、凝血酶、弹性蛋白酶、茶碱、 氨基糖类抗生素的适体已在治疗中展示了 良好的应用前景。
• 适体技术与纳米技术的结合 • 如分子信标，它是在长度为15～30mer寡 核苷酸探针的两端分别加上5～8mer序列 互补的茎杆区。在自由状态时由于茎杆区 互补序列的结合使探针分子形成发夹状结 构。探针的5' -端及3' -端分别联用荧光素分 子及猝灭剂分子。自由状态时,发夹结构的 两个末端靠近,使荧光分子与猝灭分子靠近 (约为7～10nm)。
• 此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发 出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散 发,荧光几乎完全被猝灭。当分子信标与序 列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交 体时,信标茎杆互补区被拉开,荧光分子和猝 灭分子距离增大。杂交后,信标分子的荧光 几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与 溶液中靶标的量成正比。
• 选择性分离出核酸适体后,通过PCR或 殖的效果。
适体与配体的相互作用
• 核酸适体上富含嘌呤的环常作为外来靶序
列的结合位点,常为嘌呤-嘌呤排列(包括碱
基错配、碱基三聚体和碱基平台)Leabharlann 大多数核酸适体上都可观察到G-A错
配或G-G错配。这些错配在环与正常
的双螺旋碱基对之间的堆积处产生一
个转折点,通常导致环的关闭。
• 核酸适体与配体结合时,通常会通过构
型适配形成一些稳定的二级结构,如发
卡(hairpin)、茎-环(stem-loop )、G四聚体( G-tetramer )、假节 (pseudoknot )。
• 与同一种配体结合的核酸适体往往可分为
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