纤维素酶产生菌的分离和筛选专业大实验
高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述
农家参谋科技研究-220-NONG JIA CAN MOU高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述王琪（河南师范大学生命科学学院，河南新乡，453007）【摘 要】纤维素作为自然界最丰富的可再生资源之一，具有易获得、廉价等优点。
近年来，随着全球经济的迅速发展，能源消耗巨大，地球环境遭到严重破坏；因此，寻找可再生的清洁能源迫在眉睫，所以高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用得到了人们广泛的关注，也是当今微生物学、农业科学、生态学的研究热点。
本文对之前高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用的研究进行进行整合归总，展望今后的研究方向。
【关键词】高产纤维素；酶菌；筛选；鉴定1 高产纤维素酶自然界中纤维素广泛存在，但是降解过程生产成本高、环境污染问题，效果不理想。
经大量研究发现，纤维素酶是酶的一种，能够有效降解纤维素。
纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。
细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶，所以近年来各界学者致力于筛选及鉴定高产的纤维素酶菌的研究。
2 高产纤维素酶的筛选与鉴定经查阅资料与分析，从一定地区取样如：土样、常年堆积干枯腐败植物茎秆、东亚飞蝗肠道内等；取一定量样品在三角瓶中富集培养；先梯度稀释，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于马铃薯平板与牛肉膏蛋白胨分离培养基之上，37℃恒温培养24d,菌落计数,然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落,重复划线接种于相应的琼脂平板上,直至纯化得到单菌落。
根据菌落形态观察，保存不同种的菌落，利用牙签蘸取菌落，放入离心管进一步富集；之后取富集液滴在圆形滤纸片上然后分别接种与刚果红培养基，保持对应关系，进行培养；继而用游标卡尺测量菌落周围水解透明圈的直径,并以其大小作为初步判断分解能力的指标；接下来把筛选出的菌株用单染色法、复染色法和指纹代谢法进行初步确定菌株类别；最后用16SrDNA 鉴定，通过PCR 电泳比对后送公司进行测序；确定菌株后进行酶活测定以及优化其酶活力的条件探究。
目前经大量实验，从陕北花马盐湖分离得到一株黑曲霉Aspergillusniger6MA1，发酵条件优化后酶活可达到47.8U/mL；从常年堆积干枯腐败植物茎秆中筛选出一株肠杆菌属Enterobactersp，在未进行发酵条件优化的情况下酶活达到为0.44u/mL；从湿润木屑中分离和筛选获得１株高产纤维素酶目的菌株ＬＹＷ－１等。
一株纤维素高效分解性细菌的分离和筛选的开题报告
一株纤维素高效分解性细菌的分离和筛选的开题报
告
选题意义：
纤维素是植物细胞壁中最主要的成分，也是地球上最丰富的可再生
能源之一，其含量达到全球植被的40%以上。
但纤维素的高结晶度和难
降解性，使其无法被直接利用。
纤维素高效分解性细菌可以通过生物方
法将固体废弃物、能源作物等转化为生物质燃料和有机酸，具有被广泛
利用的潜力。
因此，本实验旨在筛选出纤维素高效分解性细菌，为纤维
素的利用提供理论基础和技术支持。
实验方法：
1. 样品的原料：从自然环境中采集土壤、水体等样品，用0.9% NaCl溶液过滤。
2. 样品的分离：分别取10μL、100μL等不同的样品，平板涂布在含有纤维素的LB琼脂平板上，并在30°C下孵育48-72小时。
3. 筛选纤维素分解性细菌：通过碘酸钾和怀尔德染色法筛选出纤维
素分解性细菌。
4. 纤维素水解酶产酶活呼吸速率测定：取纤维素分解性细菌培养物，分别在含有纤维素、葡萄糖和对照培养基中培养，同时进行产酶活和呼
吸速率的测定。
预期结果：
通过本实验可以得出纤维素高效分解性细菌的特点和产酶酶活呼吸
速率等重要性质，为纤维素的利用提供理论基础和技术支持，对环境保
护和资源利用具有重要意义。
产纤维素酶霉菌的筛选.doc5
产纤维素酶霉菌的分离和筛选班级:09生物技术指导老师：黄志华组别: 第五小组组员：吴志娟、戴剑鹤、柯佳宝、潘凯仑、王志辉（24-29号）组长：吴志娟一．实验目的1.进一步复习生物化学、微生物学等相关专业知识。
2.掌握产纤维素酶细菌的筛选、纯化和保藏的方法。
3.学会设计实验计划。
4．综合培养动手操作能力及创新精神。
二. 实验原理纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源, 探索纤维素资源的有效利用方法具有重要的意义。
纤维素酶的来源很广泛，自然界中能产生纤维素酶的物种非常多。
在过去的半个世纪内，人们在各种原生动物、圆虫类、软体动物、甲壳类、昆虫、藻类、真菌类、细菌及放线菌中都发现了纤维素酶，近年来陆续在古菌中也发现很多纤维素酶的存在，但微生物是纤维素酶的主要来源，其中主要有真菌（霉菌）、细菌和放线菌。
菌种采集:产纤维素酶霉菌的采集选择在纤维素含量较高的地方，如花园表层土壤、腐烂的木头、造纸厂废水及反刍动物的瘤胃及其排泄物等。
本次实验拟从森林土中获得产酶菌株。
采样的土层太深则厌氧菌占优，而浅层土受紫外线照射，细菌难以存活。
故实验选取距表层土壤8cm处的土壤进行筛选。
纤维素刚果红培养基筛选菌种的原理：通过刚果红鉴定板来鉴定产纤维素酶霉菌是一种快速简便的筛选方法,透明圈直径和鉴定板孔径大小的比值能够直接反映该霉菌产纤维素酶的能力,其原理是刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂,染色之后能和纤维素结合形成红色,产纤维素酶霉菌在培养基平板上培养后产的生纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖和纤维二糖等小分子糖,在用刚果红染色之后没有被水解的纤维素能够和刚果红结合显红色,而水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。
三．实验器材与试剂1.样品：后山植物林地土壤，于地下8cm左右。
2.培养基：（1）富集培养基：配制查氏培养基的原料（硝酸钠2g 、磷酸氢二钾1g 、硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g、氯化钾0.5g 、硫酸亚铁0.01g 、蔗糖30g 、琼脂15~20g 加水1000mL、pH 自然）及链霉素。
纤维素酶的筛选
纤维素酶高产菌株的分离筛选基地一班王木兰 201630123017一、研究意义21世纪，人类面临的最主要的挑战就是资源与环境问题，生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用产物达1.5x1011 ~2.0x1011t，是人类赖以生存的基本物质来源，其中纤维素是地球上最丰富的物质之一，然而这部分资源尚未得到充分开发利用，目前主要用于燃料、畜牧饲料与积肥，利用率低，对环境污染严重。
纤维素酶的研究为纤维素更有效利用开辟了一条新途径，纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，根据其作用方式可分为外切β-1，4-葡聚糖苷酶、内切β-1，4-葡聚糖苷酶和β-1，4-葡萄糖苷酶3类，在这三种酶协同下，纤维素最终被完全降解为葡萄糖。
研究表明纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织和造纸等领域有广阔的应用前景。
利用纤维素酶降解天然纤维素，对于解决世界环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。
但目前纤维素酶的生产存在着酶活力低，生产周期长等问题，还未能真正应用于大规模工业生产，因此选育具有高酶活的纤维素分解菌株成为关键之一。
二、国内外研究动态目前获得纤维素酶高产菌株主要是通过自然界选育、诱变育种以及利用基因工程技术改造菌株。
其中，研究较多的是通过对已知纤维素产生菌进行诱变，以增加产酶微生物菌种，提高酶活力。
迄今为止，产纤维素酶能力最强的是里氏木霉，它是产纤维素酶和半纤维素酶最主要的工业生产菌种，国内外已有很多这方面的报道，1971年，Mandels等通过绿色木霉QW60获得了产酶活力提高一倍的QW9123；上海植生所纤维素酶组采用野生木霉As3.3002和拟康氏木霉，经物理、化学诱变，获得了高活力的菌株Ea3-967和N2-78。
纤维素酶基因克隆的研究始于20世纪70年代末，自1982年Whittle等人首次报道Cellulomonas fimi的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌和真菌中发现分离纤维素酶系，迄今为止，据报道已经有近100多纤维素酶及木聚糖酶基因都可在大肠杆菌中克隆表达。
一株产纤维素酶细菌的筛选与发酵产酶试验
纤维素酶是一种多组分的复合酶系，由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三种组分组成。
由于纤维素在自然界广泛分布，很多细菌、放线菌、酵母和霉菌都具有降解纤维素的能力。
此前纤维素降解菌的研究多以霉菌为主，而对细菌的研究着力较少。
近年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，通过细菌发酵生产纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。
本文拟从土壤中筛选出产纤维素酶的细菌并进行初步鉴定，以期为纤维素酶制剂的生产提供可能的细菌菌种。
一、材料与方法1.材料（1）土壤样品。
从南京科技职业学院校园小树林堆放枯枝和落叶处采集腐殖土土样，五点取样，混匀，放入无菌的袋中备用。
（2）富集培养基。
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，加水至1000mL，调pH7.0-7.2。
（3）初筛培养基。
羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5g，(NH4)2SO44g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨1g，琼脂15g，加蒸馏水至l000mL，pH自然。
（4）复筛培养基。
CMC-Na 2g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，刚果红0.4g 琼脂15g，加蒸馏水至l000mL，pH自然。
（5）液体发酵培养基。
CMC-Na 10g，蛋白胨10g，酵母粉10g，NaCl 5g，KH2PO4 1g，加蒸馏水至l000mL，灭菌后用无菌Na2CO3溶液调pH至10。
2.方法（1）土壤细菌的富集。
称取土样10g，放入装有玻璃珠和90mL无菌水的锥形瓶中，充分振摇。
取5mL悬液放入含45mL富集培养基的250mL锥形瓶中，37℃，150r/min振荡培养一昼夜。
（2）初筛培养基稀释涂布。
将富集后的土壤细菌培养物进行梯度稀释，取10-4,10-5,10-6三个稀释度各0.1mL于初筛培养基平板上进行稀释涂布，37℃倒置培养一昼夜，得到单菌落。
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者：王春学号:11101680摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。
产纤维素酶菌种的分离筛选和酶学性质的研究
１ａｅｏ ３ ｈｗ ｄａｈｇ ｔ ｉｔ ａ ｐ ｏ７０—８ ０ １ ｏｃ ｓｏ Ｔ ｅｇｏｔ ｄｅｚｍ ｔ ｈｒ ｔｉｔｓ ｆｌ ｅ ｒｌ ｉａｉ ｏｆｍ ｄ ｗ ｉ ｌ ｕ ｆ１ ｓｏ ｅ ｉ ｓ ｂｌｙ ｔ Ｈ ｆ ． ｓ ５ ｈ ａ ｉ ． ．Ｃ ｎｌ ｉ Ｊ ｈ ｒｗｈａ ｎｙ ａｉｅａａ ｅ ｓｃ ｔ ｗ ｒ ｐｅｉ ｎｒｙｅｎ ｒ ｅ ， ｈｃ ｕ ｎ ｎ ｃ ｅｒ ｉ ｏ ５ ｅ ｍ ｌ ｉ ｈ
摘要 ［ 目的 ］ 寻找产 纤维素酶的 高产 菌。［ 方法］ 通过 固体培 养初 筛和摇 瓶发 酵复 筛获得 产 纤维素酶 的菌株 ， 过考 察培 养基 、 通 生长温 度、Ｈ值 、 ｐ 产酶时 间等主要 的影响 因子及酶 学特性对产纤 维素酶酶活较 高的菌株进 行 了初步的研 究。 ［ 果］ 结 筛选得 到 了产纤维 素酶活 较高 、 稳定性较好 的茵株 Ｂ。通过对 Ｂ 茵的研究 ， ５ ５ 发现其 最适生长培养基 为查氏培养基 ， 最适 生长温度 为 ３ ℃ ， ５ 最适生长 ｐ Ｈ值为 ７５ ．， 产酶的最佳 时间为 ７ ； ２ 通过对其酶 学特性的研 究， ｈ 发现该 酶反应的 最适 温度为 ５ ０℃， 酶反应 的最适 ｐ 值 为 ７５酶在 ｐ Ｈ ．， Ｈ值 为 ７０ ８０ ．～ ． 范 围内稳定性较 高。［ 结论］ 初步确定 了 Ｂ 菌的生 长特性 和酶学特性 ， 下一 步的研 究提供 了科 学的依据。 ５ 为 关键词 纤维素酶 ； 筛选 ； 酶学性质 中图分类号 Ｓ ８ 文献标识码 Ａ １ ２ 文章编号 ｏ １ — ６１２０ ）３ ０ ８ — ２ ５ ６ １（０９ １ — ５４ ０ ７ ６
纤维素酶产生菌的分离和筛选专业大实验
纤维素酶产生菌的分离和筛选方案目标：从自然界采用选择性分离的方法，获得纤维素酶的高产菌株。
意义：把含纤维的自然资源及纤维废料加以充分利用，转化成糖类作为食品工业和发酵工业的原料或制成优质饲料，具有深远的现实意义。
1.材料与方法1.1材料与仪器1.1.1原辅料土壤品来自南阳理工学院以下各处离地表3-8cm深处泥土装入塑料瓶中，带回实验室处理。
（1）新校区竹林腐叶下的土壤（2）校门口东边的松树林腐叶子下的土壤（3）青年公寓外小树林（4）2号教学楼后面花园的土壤1.1.2试剂羧甲基纤维素CMC、NaCl、MgS04·7H20、KH2P04、酵母浸粉、蛋白胨、蒸馏水、琼脂、Na2HP04、酵母膏、刚果红试剂。
1.1.3仪器小铁铲和无菌纸或袋（可省）、小烧杯、100ml量筒、滤纸、漏斗、棕色试剂瓶、1000ml三角烧瓶1个、500ml三角烧瓶1个、试管24个、高压蒸汽灭菌锅、培养皿24个、36支1mm无菌吸管、无菌玻璃涂棒12支、显微镜、无菌水。
1.2培养基及试剂的配制1.2.1培养基配制初筛培养基A：羧甲基纤维素CMC 20g、NaCl 5．0g、MgS04·7H20 0．2g、KH2P041．0g、酵母浸粉 5.0g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH自然，121℃湿热灭菌20min。
复筛培养基B：CMC 10g、Na2HP04 1.25g、KH2P040.75g、MgSO4·7H2O 0.1g、蛋白胨1.25g、酵母膏O.25g、蒸馏水500mL、琼脂10g，pH自然，121℃灭菌20min。
2.2.2试剂配制1％刚果红试剂：称取刚果红试剂1g于干净的小烧杯中，用量筒量取蒸馏水100ml使之溶解，过滤，贮于棕色试剂瓶中。
2.3方法2.3.1初筛的方法步骤(1)配初筛培养基A，灭菌，倒平板。
(2)用稀释涂平板的方法分离纤维素分解菌。
稀释涂布平板法步骤：A．倒平板将配好的琼脂培养基溶化，待冷至55—600C时，用右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶盖，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，瓶口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。
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纤维素酶产生菌的分离和筛选方案
目标：从自然界采用选择性分离的方法，获得纤维素酶的高产菌株。
意义：把含纤维的自然资源及纤维废料加以充分利用，转化成糖类
作为食品工业和发酵工业的原料或制成优质饲料，具有深远的现实意义。
1.材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1原辅料
土壤品来自南阳理工学院以下各处离地表3-8cm深处泥土装入塑
料瓶中，带回实验室处理。
（1）新校区竹林腐叶下的土壤
（2）校门口东边的松树林腐叶子下的土壤
（3）青年公寓外小树林
（4）2号教学楼后面花园的土壤
1.1.2试剂
羧甲基纤维素CMC、NaCl、MgS04·7H20、KH2P04、酵母浸粉、蛋白胨、
蒸馏水、琼脂、Na2HP04、酵母膏、刚果红试剂。
1.1.3仪器
小铁铲和无菌纸或袋（可省）、小烧杯、100ml量筒、滤纸、漏斗、棕色试剂瓶、1000ml三角烧瓶1个、500ml三角烧瓶1个、试管24个、高压蒸汽灭菌锅、培养皿24个、36支1mm无菌吸管、无菌玻璃涂棒12支、显微镜、无菌水。
1.2培养基及试剂的配制
1.2.1培养基配制
初筛培养基A：羧甲基纤维素CMC 20g、NaCl 5．0g、MgS04·7H20 0．2g、KH2P041．0g、酵母浸粉 5.0g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH自然，121℃湿热灭菌20min。
复筛培养基B：CMC 10g、Na2HP04 1.25g、KH2P040.75g、MgSO4·7H2O 0.1g、蛋白胨1.25g、酵母膏O.25g、蒸馏水500mL、琼脂10g，pH自然，121℃灭菌20min。
2.2.2试剂配制
1％刚果红试剂：称取刚果红试剂1g于干净的小烧杯中，用量筒量取蒸馏水100ml使之溶解，过滤，贮于棕色试剂瓶中。
2.3方法
2.3.1初筛的方法步骤
(1)配初筛培养基A，灭菌，倒平板。
(2)用稀释涂平板的方法分离纤维素分解菌。
稀释涂布平板法步骤：
A．倒平板将配好的琼脂培养基溶化，待冷至55—600C时，用右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶盖，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，瓶口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。
B．制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分
散。
用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。
然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、lO-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
C．涂布将上述培养基的三个平板底面或培养皿盖周边分别用记号笔写上lO-4、10-5、和10-63种稀释度字样，每种培养基每稀释度标记3皿，然后用三支1ml无菌吸管分别由lO-4、10-5、和10-6三管土壤稀释液中各吸取0．2ml对号放入已写好稀释度的平板中央位置，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5-10分钟。
D．将培养基平板倒置于28℃温室中培养3日。
E．将培养后长出的单个菌落分别挑取用平板画线法接种到培养基A的平面上，置28℃--29℃温室中培养，待菌苔长出后，观察水解圈情况，往培养皿中加入适量1% 的刚果红溶液，染色5min，检查菌苔是否单纯可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养物。
2.3.2复筛的方法步骤
以水解圈直径与菌落直径的比值(D／d)作为判别指标，挑选比值大于2的菌株在复筛培养基B上以平板划线法进行分离纯化，待菌苔长出后，并再次刚果红溶液鉴别。
将纯化得到的纤维素降解菌进行观察对比并记录生长情况、培养天数及菌落形态等。
2.3.3检测方法
A．测透明圈直径，并计算CMC酶相对活性A=d／t，式中：A为相
对活性，cm／d；d为透明圈直径，cm；t为培养时间，d。
B.对滤纸的分解效果测定将各菌株接种到以滤纸为唯一碳源的液体培养基中，30℃，在转速为110r／min的摇床培养5d，观察滤纸的崩解效果，以“+”的多少来表示滤纸崩溃程度，“+”越多，说明该菌株的降解效果越强。
3.结果与讨论
4.结论
1.实验原理
刚果红：在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。
当纤维素被纤维素酶分解后，就无法形成刚果红-纤维素复合物，培养基中就会出现透明现象。
根据透明圈的大小从而可以筛选活性高的纤维素分解菌。
1、采样：即采集含菌的样品
为获得纤维素酶产生菌（有木霉属菌株、中性芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌等）土样的采集要在富含纤维素的环境中进行这是因为在纤维素含量丰富的环境中通常会聚集较多的分解纤维素的微生物应采集学校树木下用于堆肥的树叶腐烂泥样及表层泥土为样品因此样品含纤维素酶产生菌取样时由于细菌绝大多数分布在距地表约3—8cm的土壤层要先除去表层土再用瓶子对土壤进行采样土壤保存时间不宜超过12小时。
2、增殖培养（又称丰富培养）
增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。
因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。
3、纯种分离
在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。
通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。
纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
4.玻璃器皿的洗涤和包装 1.玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。
将三角瓶、
试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。
移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。
洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。
2.灭菌前玻璃器皿的包装 1培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸或牛皮纸将几套培养皿包成一包。
2移液管的包扎：在移液管的上端用细铁丝塞入一小段棉花，塞入此小段棉花应距管口约 0.5cm 左右，棉花自身长度约 11.5cm。
棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。
实验图-3 移液管的包扎先将报纸裁成宽约 5cm 左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧。
在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。
上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。