酵母双杂交原理ppt演示
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酵母双杂交系统技术介绍ppt课件
QDO/X/A
2266 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: 传统细菌筛选培养
取1ml菌液按 照一定比例 用LB稀释， 150ul/板进 行涂板，过 夜培养。
提取质粒
刮取平板上的 菌落，提取质 粒。
转化酵母菌
将提取的质粒 转化Y187， 获得酵母 。Mating筛选将文库与诱饵 培养液混合， 进行Mating。 涂筛选板，挑 取阳性克隆子 。
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
G1
1133 酵母双杂交系统技术介绍
G2
1/11/2020
•
主要内容
1144 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
•
Clontech 酵母双杂交系统: MM Series
1155 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
630467 Easy yeast Plasmid Isolation Kit
2299 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
•
验证互作: 体内验证
630305
Mammalian Matchmaker TwoHybrid Assay Kit 2
SEAP
3300 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•构建: Clontech MM构建方法
SMART合成cDNA 共转化，涂板 培养，收集菌液 分装，冻存1ml mating
SMART cDNA
两
小
时
聪明的酵母
构
自己
建
做克隆
Y187
文 库
同源重组
SD/Leu-
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
结合后的复合物可以激活或抑制报告基因的表达，从而判断待研究的蛋 白质是否与DNA相互作用。
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母单Байду номын сангаас交
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交完整ppt课件
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22
•
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23
上图显示了酵母三杂交系统的原理。在酵母三杂交 •系统，lexA启动子调控下游LacZ基因和His3基因 的表达，而lexA启动子的激活取决于DNA结合结构 域和转录激活结构域能否在空间上相互靠近。
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为 能结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为 噬菌体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分 组成，一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构 域，另一部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
•
当从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-
LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，
并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因
在生物学功能上的联系。
•
另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基
化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白 是否有相互作用。
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9
•
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10
这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生 GAL4，又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因 此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。 当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时， 功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的 报告基因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，从而通过功 能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的 酵母菌株中的AD-LIBRAR能相关的主要方法。
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14
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是 利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相 互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质 与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应 则可以通过酵母双杂交进行检测。
酵母双杂交原理ppt演示
第一个蛋白质是DNA结合域，通常来源于酵母转录因子GAL4，能够特异结合上游 激活序列；第二个蛋白质是转录激活域，能够激活转录起始复合物的形成。
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
酵母双杂交系统PPT课件
• ii. GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA结 合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有转录 激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。二个 结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功 能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。单独的 DB虽然能和启动筛选相互作用的蛋白
.
8
序列分析
• 从酵母中分离质粒然后转化E. coli • 从大肠杆菌中提取质粒并测序 • 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性
.
9
质粒构建
• 在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的 DNA结合域前面的多克 隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒
Promoter LacZ(or HIS3) reporter gene
.
12
iii. 如果AD和BD分别与两个基因编码序列融合，且两种
蛋白质能相互发生结合，就可导致GAL1-LacZ基因
的表达。其中与AD融合的基因称之为钓饵基因，与
BD融合的基因可称之为目的基因(即建立的基因文
库)。
为了提高报告基因的表达活性，LacZ基因还可以
.
3
酵母双杂交的原理
• 利用酵母作为真核鉴定蛋白的相互作用 • 使用不同的培养基筛选阳性克隆
.
4
• 双杂交系统的两个重要元件：
• 转录激活因子： DNA结合结构域（DNA binding domain， 简称为DB）和转录激活结构域（activation domain，简称 为AD）
• 再次，双杂交鉴定过程中要经过两次转化，而且，酵母细 胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。
.
8
序列分析
• 从酵母中分离质粒然后转化E. coli • 从大肠杆菌中提取质粒并测序 • 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性
.
9
质粒构建
• 在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的 DNA结合域前面的多克 隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒
Promoter LacZ(or HIS3) reporter gene
.
12
iii. 如果AD和BD分别与两个基因编码序列融合，且两种
蛋白质能相互发生结合，就可导致GAL1-LacZ基因
的表达。其中与AD融合的基因称之为钓饵基因，与
BD融合的基因可称之为目的基因(即建立的基因文
库)。
为了提高报告基因的表达活性，LacZ基因还可以
.
3
酵母双杂交的原理
• 利用酵母作为真核鉴定蛋白的相互作用 • 使用不同的培养基筛选阳性克隆
.
4
• 双杂交系统的两个重要元件：
• 转录激活因子： DNA结合结构域（DNA binding domain， 简称为DB）和转录激活结构域（activation domain，简称 为AD）
• 再次，双杂交鉴定过程中要经过两次转化，而且，酵母细 胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
酵母单、双杂交PPT
Amp抗 评 价及 鉴定分装 及冻存诱饵质粒构建流程
目 的 基 因 合 成
载目
重
体的
组
的片
鉴
连段
定
接与
重 组 质 粒 纯 化
诱饵质粒 自激活 及细胞质 定位检测
自激活检测 （排除bait蛋白可 与myristlyation
signal结合）
细胞质定位检测 （用于验证Sos-bait
信号(Myr) ，加入galactose可诱导表达
Sos蛋白介导的双杂交系统原理
人类Sos蛋白和所研究的基因融合而成诱饵蛋白。靶蛋白上连有一 个十四烷基化（Myristylation）膜定位信号，它使靶蛋白锚定到细 胞膜上。诱饵和靶蛋白的相互作用使人类Sos蛋白在酵母细胞膜上定 位，从而激活Ras信号转导级联反应（cascade）。
细胞信号传导研究
通过细胞内一系列蛋白 质间的相互作用或蛋白质与 其它分子间的相互作用完成 的
5 Part
赛尔生物酵母单、双杂交技术服务
酵母单、双杂交验证实验
基因克隆的获得
及DNA测序检验
1
每个基因克隆的酵母
双杂交自激活检验
3
赛尔 生物
基因的酵母单、双杂交
2
载体构建及其DNA测序
检验
酵母细胞内的蛋白-蛋
酵母菌株标志性表型的鉴定
确
定
酵 母 菌 表 型
营养缺陷 型筛选
Trp(-)、Leu (-) 、 His (-) 、Ura (-) 不能生长，在 YPDA上可以生长
检测 回复 突变
接种于YPDA 培养基， 25℃有菌生长， 37 ℃无菌生长构建流程ds cDNA ＋
连接并转化 XL1-blue 感受态细菌
酵母双杂交原理和应用PPT课件
You ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱnow, The More Powerful You Will Be
结束语
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
酵母双杂交系统分类
➢核内蛋白质相互作用的研究 ➢膜蛋白、膜相关蛋白和可溶性蛋白间相互 作用的研究
核内蛋白质间相互作用的研究
原理：
➢转录激活因子通常有两个可分割的、功能相互独立的结构域， 即DNA特异性结合结构域（DNA-binding domain， DBD）与 转录激活结构域（transcriptional activation domain, AD）。
分离的泛素系统
分离泛素（split-ubiquitin）系统
应用
➢
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
➢DBD-Bait 和 prey-AD 这两个融合蛋白是如何构建的？ ➢又是如何进入同一个酵母细胞的呢？
➢因此完整的酵母双杂交由三个部分组成：bait 载体，prey 载体，和带有报告基因的酵母菌株。
➢根据目前通用的系统中DBD来源的不同，主要分为GAL4 系统和LexA系统。
➢GAL4系统来源于酵母；LexA系统的BD来源于原核生物， 在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
蛋白质相互作用研究—— 酵母双杂交系统
专业: XXX 学生：XXX
研究背景 系统分类 系统原理 操作过程
研究背景
蛋白质---蛋白质的相互作用是细胞生命活动的基础和特征。 例如细胞与细胞、细胞与基质的连接；细胞信号转导；代 谢网络；以及转录、翻译调节等.
结束语
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
酵母双杂交系统分类
➢核内蛋白质相互作用的研究 ➢膜蛋白、膜相关蛋白和可溶性蛋白间相互 作用的研究
核内蛋白质间相互作用的研究
原理：
➢转录激活因子通常有两个可分割的、功能相互独立的结构域， 即DNA特异性结合结构域（DNA-binding domain， DBD）与 转录激活结构域（transcriptional activation domain, AD）。
分离的泛素系统
分离泛素（split-ubiquitin）系统
应用
➢
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
➢DBD-Bait 和 prey-AD 这两个融合蛋白是如何构建的？ ➢又是如何进入同一个酵母细胞的呢？
➢因此完整的酵母双杂交由三个部分组成：bait 载体，prey 载体，和带有报告基因的酵母菌株。
➢根据目前通用的系统中DBD来源的不同，主要分为GAL4 系统和LexA系统。
➢GAL4系统来源于酵母；LexA系统的BD来源于原核生物， 在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
蛋白质相互作用研究—— 酵母双杂交系统
专业: XXX 学生：XXX
研究背景 系统分类 系统原理 操作过程
研究背景
蛋白质---蛋白质的相互作用是细胞生命活动的基础和特征。 例如细胞与细胞、细胞与基质的连接；细胞信号转导；代 谢网络；以及转录、翻译调节等.
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and
do these two protein bind each other?
One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method.
To understand the method we must first consider how gene expression is regulated in yeast......
We start with yeast possessing a reporter gene (a gene making a product that is easy to detect).
And now we introduce genes coding for two hybrid proteins.....
UAS (upstream activation sequence)
transcription machinery gene
and now back to the question...
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
activation domain DNA binding domain
UAS (upstream activation sequence)
transcription machinery gene
Do these proteins bind?
Y X
X
Y
thus forming a functional transcription activator... X Y
our two hybrid X Y proteins bind!
yes, we have expression of the reporter indicating that the proteins bind!
do we get expression of the reporter?
reporter gene
transcription activator
activation domain DNA binding domain
UAS (upstream activation sequence)
transcription machinery gene
Do these two protein bind?
Y X
His, β-gal
reporter gene
His, β-gal
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
activation domain DNA binding domain
一. 酵母双杂交系统原理
(Yeast Two-hybrid System)
jnulynn提供
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Suppose we have two proteins...