实验八 重组克隆筛选(酶切鉴定)
实验八 重组克隆筛选(酶切鉴定)
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
重组体克隆的筛选和鉴定
抗性筛选
通过载体上的抗性基因，如Amp抗性 基因，对重组体克隆进行筛选，重组 的克隆具有抗性。
筛选流程
转化
将目的基因和载体DNA共转化到大肠杆菌中 。
克隆筛选
根据筛选方法，从转化子中筛选出重组体克 隆。
培养和扩增
将筛选出的重组体克隆进行培养和扩增，以 备后续鉴定。
筛选中的注意事项
避免假阳性
在筛选过程中要严格控制条件，避免出现假阳 性结果。
生物化学鉴定法
通过检测表达产物的生化性质， 如酶活性等，判断目的基因是否 成功表达。
鉴定流程
构建重组体克隆
将目的基因与载体DNA连接， 形成重组体克隆。
转化受体细胞
将重组体克隆导入受体细胞中 ，使目的基因在受体细胞中表 达。
筛选阳性克隆
通过抗性筛选、PCR鉴定等方 法筛选出含有目的基因的阳性 克隆。
生物信息学技术
通过生物信息学技术，可以对重组体克隆进行全面的分析和鉴定，包 括基因组、转录组和蛋白质组等多个层面。
重组体克隆在其他领域的应用前景
生物制药
重组体克隆技术在生物制药领域具有广泛的应用前景，可用于生 产高纯度、高质量的药物。
生物能源
利用重组体克隆技术可以改良微生物，提高生物燃料的生产效率。
在生物制药领域的应用
药物靶点发现
01
通过筛选重组体克隆，可以发现新的药物靶点，为新药研发提
供基础。
药物作用机制研究
02
通过鉴定重组体克隆，可以深入了解药物的作用机制，为药物
优化提供依据。
药物筛选
03
利用重组体克隆进行高通量药物筛选，提高药物发现的效率。
在基因治疗领域的应用
基因功能研究
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双 链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质 粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；
③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性 的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢 复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心 可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除 去。
实验重组质粒DNA提7 取及双酶切鉴定
一.质粒DNA的制备
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
实验重组质粒DNA提8 取及双酶切鉴定
(1)质粒的定义
质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复 制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的 超螺旋(supercoil)形式存在。
3.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤
①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） ②细菌的收集与裂解
收集——高速离心的方法 ③质粒DNA的纯化
所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环 状的性质。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA
3.1 实验原理：
①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌， 可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、 质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA 断裂成不同长度的双链DNA。
3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量）
实验八 重组克隆筛选(酶切鉴定)
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
重组克隆的筛选与鉴定
五、PCR鉴定 PCR鉴定 根据目的基因的序列设计 引物
六、DNA序列分析 DNA序列分析 只需提供距离外源基因最近的 载体序列（如启动子） 载体序列（如启动子）即可
七、的目的DNA片段,原位杂 交和斑点杂交是常用的方法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1.将基因从琼脂糖凝胶转移至 1.将基因从琼脂糖凝胶转移至 固相支持物上 2.探针标记 2.探针标记 3.杂交 3.杂交
蛋白质水平检测
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳
根据分子量来确定分离胶浓度
丙烯酰胺凝胶浓度（％） 线性分离范围 15 1212-43 10 1616-68 7.5 3636-94 5.0 5757-212
重组克隆的筛选与鉴定
DNA水平的检测 DNA水平的检测
一、a互补：诱导物IPTG和生色底 一、a互补：诱导物IPTG和生色底 物蓝白菌落形成 外源基因插入失活，产生白斑， 空白载体转化产生蓝斑。
X-gal and IPTG can be added to the LB agar at a final concentration of 70 µg/ml and 80 µM, respectively, just prior to pouring the plates.
二、抗生素选择标记
小量抽提质粒DNA DNA进行限制 三、小量抽提质粒DNA进行限制 性酶切分析
1.碱解法 1.碱解法 针对所有大肠杆菌菌株都卓有成效 2.煮沸法 2.煮沸法 该法只适用于经氯霉素处理的培养 物
四、酚/氯仿快速鉴定转化子
优点：可快速鉴定重组子 操作：直接取少量菌液离心，加入约20 µl 操作：直接取少量菌液离心，加入约20
二、双相电泳 第一相根据等电点的差异分离 蛋白 第二相根据分子量分离蛋白
酶切鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和应用；2. 学习质粒DNA的提取、纯化方法；3. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用；4. 通过酶切鉴定，验证目的基因的插入和表达。
二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme）是一种特殊的核酸酶，能够识别特定的DNA序列并在这些序列上切割双链DNA。
根据识别序列的长度和切割方式，限制性核酸内切酶分为两类：I类酶和II类酶。
其中，II类酶在分子生物学实验中应用最为广泛，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
酶切鉴定实验的原理是：通过将目的基因与载体连接，构建重组质粒。
然后，利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行酶切，观察酶切后的DNA片段长度，以判断目的基因是否成功插入载体。
三、实验材料1. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、紫外分光光度计等；3. 样品：重组质粒、载体DNA、目的基因DNA等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）取含有重组质粒的细菌，用碱裂解法提取质粒DNA；（2）将提取的质粒DNA进行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，得到纯化的质粒DNA。
2. 重组质粒的构建（1）取目的基因DNA和载体DNA，分别进行PCR扩增；（2）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的基因和载体DNA的大小；（3）利用DNA连接酶和T4 DNA连接酶，将目的基因连接到载体上；（4）转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
3. 酶切鉴定（1）取重组质粒和载体DNA，分别进行酶切反应；（2）将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的DNA片段长度；（3）根据酶切结果，判断目的基因是否成功插入载体。
4. 结果分析根据琼脂糖凝胶电泳结果，比较重组质粒和载体DNA的酶切产物。
若重组质粒在目的基因插入位点附近出现新的酶切位点，则说明目的基因成功插入载体。
分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
第三次分子生物学实验报告重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一、实验目的1、通过酶切鉴定重组质粒的插入片段的大小；2、学习并掌握PCR技术的原理和基本操作。
二、实验原理1、重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
2、PCR原理PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
（1）聚合酶链式反应原理CR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。
置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
基因工程-重组体克隆的筛选和鉴定PPT文档共86页
谢谢
基因工程-重组体克隆的筛选和鉴定
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 பைடு நூலகம்，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
8第八章重组体的筛选ppt课件
④结果 单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的 结果
五、DNaseⅠ足迹实验〔footprinting assay）
检测与特定蛋白质结合的DNA序列的 部位及特性
优点：可形象地展示出特殊的蛋白 质因子同特定DNA片段之间的结合区 域
1
10
(a)
32p
*
1 10
(b) *
(c)
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体〔一抗〕和第二抗体〔二抗〕 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
重组子的筛选直接筛选间接筛选dna鉴定载体筛选翻译产物转录产物其他方法报告基因等northernblottingwesternblotting标记补救筛选质粒载体的互补筛选蓝白色斑筛选法噬菌体包装容量的正性筛选质粒载体的抗性标记筛选同源性分析鉴定原位杂交dna序列分析重组子酶切图谱鉴定重组子大小鉴定一遗传学检测法1根据载体表型特征的筛选1抗药性标记插入失活筛选法第一节核酸分子的遗传学与物理检测法半乳糖苷酶显色反应筛选法蓝蓝白白落落蓝白菌落蓝白菌落筛选白色菌落2根据插入基因遗传性状的筛选重组体dna分子转化到大肠杆菌受体细胞之后如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补那么就可以利用营养突变株进行筛选
4、直接凝胶电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
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实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）
【实验目的】
1.掌握质粒提取的基本方法的原理；
2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】
重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）
使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小
从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定
对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交
为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
5．PCR法
用PCR对重组子进行分析，不但可以迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA序列分析。
因为对于表达型重组子，其插入片断的序列的正确性是非常关键的。
PCR法既适用于筛选含特异目的基因的重组克隆，也适用于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。
前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。
6．菌落（或噬菌斑）原位杂交
菌落或噬菌斑原位杂交技术是将转化菌DNA转移到硝酸纤维膜上，用放射性同位素或非放射性标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆。
这种方法能进行大规模操作，是筛选基因文库的首选方法。
本实验采用限制酶图谱鉴定。
核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。
现已发现几百种限制性内切酶，分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶，它能识别双链DNA分子中特定的靶序列（4～8bp）, 以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5＇端为P，3＇端为OH。
由于限制性内切酶能识别DNA 特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。
酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1μg DNA的酶量为一个单位。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.质粒提取试剂（见实验五）
2.限制性内切酶Kpn I 及10×酶切缓冲液。
3.限制性内切酶Xbal I及10×酶切缓冲液。
4.TAE电泳缓冲液或TBE电泳缓冲液
5.琼脂糖（Agarose）
6.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。
（二）器材
水平电泳装置、电泳仪、水浴锅、恒温振荡器、台式高速离心机、微量移液器、凝胶成像系统等。
（三）菌株
大肠杆菌DH5α转化菌。
【操作方法】
1. 质粒提取步骤(见实验五)
2. 酶切反应
1)在灭菌的0.5mL EP管中加入重组质粒DNA 1μg和相应的10×M buffer 2μL（见附录1），再加入灭菌重蒸水至酶切总体积为20μL，将管内溶液混匀后各加入1μLKpn I和Xbal I酶液双酶切，用手指轻弹管壁使溶液混匀或用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。
如果是同一条件下进行多个酶切反应，建议统一加好相同的组分后混匀分装，最后加入DNA样品。
酶切反应加样表：
2)混匀反应体系后，将EP管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2h-3h，使酶切反应完全。
3)每管加入2μL 0.1mol/L EDTA (pH8.0)，混匀，以停止反应，或置65℃水浴中10min，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，可参照说明书进行。
灭活后的酶切溶液置于冰箱中保存备用。
4)琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果。
【注意事项与提示】
1.影响限制性内切酶活性的因素包括：
a)酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质；
b)识别序列在DNA中的分布频率；
c)与DNA的构象有关（SC,L,OC）；
d)DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）
因此，酶切时应尽量注意将影响酶切的因素降低到最小。
2.市售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释；可采取适当延长酶切时间或增加酶量的方式提高酶切效率，但内切酶用量不能超过总反应体积的10%，否则，酶活性将因为甘油过量受到影响。
3.由于EDTA的存在会抑制连接酶的活性，通常采用加热方法终止酶切反应。
4.酶切反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶活性降低，取酶时应在冰上操作且动作迅速。
【实验安排】
第三天观察转化结果（蓝白斑情况），计算重组率。
提取重组质粒DNA、酶切鉴定。
【实验报告要求与思考题】
1.提交重组质粒酶切琼脂糖凝胶电泳检测结果。
2.提交连接产物转化平板照片并计算重组率。
阳性重组率= [ 白色菌落数/（白色菌落+蓝色菌落）]×100%
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