小鼠肺癌原位模型的建立
小鼠肺癌原位模型的建立
小鼠肺癌原位模型的建立作者：胥孜杭刘菲邹纯朴朱诗国陈晓来源：《中国医药导报》2015年第01期[摘要] 目的肺癌的发病率和病死率居高不下，而目前用于实验研究的肺癌动物模型存在较大的局限性，故本研究认为建立一个稳定、类似于人体肿瘤微环境的肺癌原位模型是深入研究肺癌的基础。
方法直接将稳定表达虫萤光素酶的鼠Lewis肺腺癌细胞与基质胶的混悬液注射于C57 BL/6小鼠左肺，无需打开胸腔只需将小鼠左胸部皮肤剪开约1 cm小口，定期利用小动物活体成像系统中的生物发光技术监测小鼠肿瘤形成及转移情况，并将小鼠处死后立即进行肺部组织活体取材，采用石蜡包埋、切片、HE染色做出病理学诊断。
结果采用肺内注射的原位造模法成瘤率高，Lewis肺腺癌细胞数量只需0.5×105个即可成瘤，成功率达90%以上，且利用活体成像系统中的生物发光技术能监测到模型小鼠肿瘤可转移至对侧胸廓、对侧肺组织、双侧腋下及腹股沟淋巴结等。
结论注射虫萤光素酶稳定表达的鼠Lewis肺腺癌细胞与基质胶混悬液构建的肺癌原位模型所需细胞数量少，成瘤率高，无手术死亡风险，转移性好，监测方便，操作简单且可重复性高，为深入研究肺癌提供了良好模型。
[关键词] 肺癌;原位模型;活体监测[中图分类号] R734.2 ; ; ; ; ;[文献标识码] A ; ; ; ; ;[文章编号] 1673-7210（2015）01（a）-0015-04Establishment of orthotopic lung cancer model in miceXU Zihang ; LIU Fei ; ZOU Chunpu ; ZHU Shiguo ; CHEN XiaoSchool of Basic Medical Science， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai ; 201203， China[Abstract] Objective Morbidity and mortality remain high in lung cancer， but the animal lung cancer models used for the experimental research are limited， so to establish an orthotopic lung cancer model， which is stable and similar to the human tumor microenvironment， is a foundation for the further study of lung cancer research. Methods Luciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix were directly injected into the left lung of C57BL/6 mice after cutting open a incision of the skin， which about 1 cm， and there was no need to open the chest. Small animal in vivo bioluminescence imaging system was used to monitor tumor growth and metastasis. At different time points， mice were sacrificed and the lung tissues were isolated and imbedded with paraffin. Pathological diagnosis was made by sliced and HE stained. Results LLC cells （0.5×105） were enough to form an orthotopic pulmonary tumor， and the success rate was above 90%. The metastases to contralateral thoracic， contralateral lung， bilateral axillary and inguinal lymph nodeswere monitored by bioluminescence technique. Conclusion The orthotopic tumor models of lung cancer can successfully built by injection of luciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix mixture. Furthermore， a few LLC cells are needed， and the tumor formation rate is high， besides there is no operation death risk. It has good metastases and high repeatability， in addition it's easy to operate and easy to be monitored， which provides a good method for the establishment of mouse models for further study of lung cancer.[Key words] Lung cancer; Orthotopic model; Live monitoring目前肺癌的发病率无论在国内还是国外都已位居各类肿瘤发病率的前列，在国内还呈现逐年上升的趋势，其中约80%的肺癌都属于非小细胞肺癌[1-3]，这引起了无论是西医还是中医、临床还是实验室的广泛重视。
两种小鼠肺癌模型的构建及MicroPETCT观察
doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2019.01.008两种小鼠肺癌模型的构建及Micro PET-CT观察沈艳"，王韵2,张汝2,阮铮2,毛建华2(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院实验医学研究中心，上海200025;2.医学基因组学国家重点实验室，上海血液学研究所，上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海，200025;3.南京农业大学，动物医学院，南京，210095)［摘要］目的比较尾静脉注射与肋间隙肺部原位注射人源非小细胞肺癌(NSCLC)细胞制备肺癌小鼠模型肿瘤形成情况的差异。
方法使用NSCLC株NCI-H1975细胞，通过尾静脉注射以及经肋间隙肺部原位注射的方法制备N O D-SCID小鼠肺癌模型，于造模后15d,应用小动物PET-CT 技术观察小鼠肺部肿瘤形成情况：解剖小鼠，检测肺部病理改变。
结果造模15d后，经尾静脉注射NCI-H1975细胞的小鼠在肺部不能检测到肿瘤，而经肋间隙肺部原位注射NCI-H1975细胞的小鼠能够在肺部检测到明显的肿瘤形成。
结论肋间隙肺部原位注射肺癌细胞制备的肺癌小鼠模型肺部肿瘤形成均一、稳定、可重复、高效，是较好制备原位肺癌模型的方法.［关键词］原位肺癌；小鼠模型；小动物PET-CT;尾静脉注射；肋间隙注射［中图分类号］Q95-33［文献标志码］A［文章编号］1674-5817(2019)01-0039-07肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤⑴，分为小细胞肺癌(占15%)和非小细胞肺癌(占85%严。
对非小细胞肺癌的生物学特性以及筛选有效的药物进行实验研究，制备稳定的、重复性好的、简单易操作的原位肺癌小鼠模型是关键。
原位肺癌模型包括自发性肺肿瘤模型、气道内接种模型以及转基因模型等13.4］。
应用化学致癌药物，如苯并花、二乙基亚硝胺、3-甲基胆蔥苯等诱导的肺肿瘤模型耗时较长、成瘤性难以保证、肿瘤类型不一®7］。
气道内接种模型，通过在支气管内注射肺癌细胞制备原位肺癌模型，发现成瘤部位及肿瘤大小不稳定，成瘤率较低價叽而转基因模型存在造模时间难掌［收稿日期］2018-06-28［基金项目］国家自然科学基金(81101721),上海市浦江人才计划项目(16PJ1406100),上海市自然科学基金(16ZR1421000)［作者简介］沈艳(1977-),女,硕士，高级兽医师，从事实验动物管理和人类疾病动物模型研究。
小鼠Lewis肺癌原位模型的构建
小鼠Lewis肺癌原位模型的构建刘馨;伍治平;左曙光;周永春;陈艳;王熙才【摘要】背景与目的肺癌原位模型包括小鼠自发性肺肿瘤模型和气道内接种模型等,但自发性肺肿瘤模型耗时较长且成瘤率不能保证,而气道内接种模型成瘤部位及大小不稳定.本研究以3LL细胞系细胞接种于C57BL/6小鼠肺原位,与皮下接种模型比较,探讨其稳定性、转移特性,并建立小鼠肺原位癌模型的优化方法.方法将不同数量级的3LL细胞分别直接接种于C57BL/6小鼠左侧腋下制备皮下接种模型和以Matrigel悬浮后接种于其左肺制备原位接种模型,观察两种模型的生存期,并对小鼠进行解剖后行病理切片检查、免疫组化染色检测微血管密度、流式细胞仪检测CD44v.结果皮下组成瘤率分别为100%、66.7%、16.7%,未见明显转移.原位组成瘤率分别为100%、100%、83.3%,并可转移至对侧胸廓及肺脏.原位组中位生存期(38 d、35 d、23 d)明显少于皮下接种组(82 d、72 d、50d).原位接种组微血管密度(120.2±9.73)高于皮下组(92.6±7.12).原位接种组肿瘤细胞悬液CD44v表达(26.46±1.56)96高于皮下接种组(23.13±1.02)96.结论以3LL细胞接种于小鼠肺部所建立的肺癌原位模型简单可靠,重复性高,具有较皮下接种模型更强的转移特性.【期刊名称】《中国肺癌杂志》【年(卷),期】2010(013)001【总页数】6页(P42-47)【关键词】肺肿瘤;动物模型;小鼠【作者】刘馨;伍治平;左曙光;周永春;陈艳;王熙才【作者单位】650118,昆明,昆明医学院第三附属医院(云南省肿瘤医院)肿瘤研究所;650118,昆明,昆明医学院第三附属医院(云南省肿瘤医院)肿瘤研究所;650118,昆明,昆明医学院第三附属医院(云南省肿瘤医院)肿瘤研究所;650118,昆明,昆明医学院第三附属医院(云南省肿瘤医院)肿瘤研究所;650118,昆明,昆明医学院第三附属医院(云南省肿瘤医院)肿瘤研究所;650118,昆明,昆明医学院第三附属医院(云南省肿瘤医院)肿瘤研究所【正文语种】中文【中图分类】R734.2动物模型的建立是研究非小细胞肺癌生物学特性和各种体内治疗实验研究的基础。
人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体步骤及方法
人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体步骤及方法将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549，G418筛选获得稳定表达GFP细胞，对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。
将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死。
HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。
利用KODAK IS2000MM系统检测肿瘤播散情况。
一、实验材料准备1. BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周龄，体重18-20 g，无特定病原体(SPF)级饲养。
2. 肺腺癌细胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibcobrl公司)，5% CO237℃培养，常规传代。
3. 质粒和筛选药物质粒pRNAT-U6/Neo(美国Genscript公司)，携带Neomycin耐药基因供筛选，在CMV启动子控制下编码cGFP作为转染标记物。
G418(美国Promega公司)800 μg/ml初筛后200 ug/ml维持筛选。
二、细胞的转染1. 哺乳动物磷酸钙转染系统(美国Promega公司)，按照操作指南将质粒pRNAT-U6/Neoo转入A549细胞，转染后24~48 h荧光显微镜下观察转染效率。
2. 后培养液内加G418筛选获得稳定转染。
3. 利用平板克隆形成试验测定细胞克隆形成率>10%后，有限稀释法获得表达GFP阳性细胞。
4. 1月后收获转染细胞，常规传代培养，培养液中加G418(200 ug/ml)维持筛选。
5. 测定转染后A549细胞增殖动力学指标，对比转染前后A549细胞生长曲线，检测转染后细胞的生长活性是否受转染的影响。
6. 待细胞增殖达一定数量后，裸鼠皮下注射转染前后细胞，记录成瘤时间，用公式V=1/2x长x宽计算肿瘤体积，对比转染前后两组裸鼠的瘤体大小以检测成瘤性是否有差别。
三、人肺腺癌A549裸鼠原位种植模型的建立1. 取转染后细胞，用不含血清的RMPI 1640培养液冲洗2次并调整细胞最终浓度为5x106/0.2 ml备用。
小鼠Lewis肺癌胸腔移植模型的建立
小鼠Lewis肺癌胸腔移植模型的建立【摘要】目的：通过胸腔移植的方法建立晚期肺癌的动物模型。
方法：经C57BL/6小鼠的腋后线第6肋间胸腔(胸腔模型组)或小鼠腋部皮下(皮下模型组)分别移植鼠源性Lewis肺癌细胞0.2ml （5×106ml-1），观察小鼠的生存时间、小鼠体重、饲料消耗量、游泳试验、常压耐缺氧试验，大体观察胸腔、纵隔、胸水等肺癌细胞浸润和转移情况。
结果：胸腔模型组小鼠中位数生存时间13.5（8～18）d，皮下模型组小鼠中位数生存时间45（25～71）d，胸腔模型组的生存期范围离散程度较皮下模型组小（Ｐ<0.05）。
病程中胸腔模型组小鼠体重下降、摄食减少等恶病质体征较皮下模型组明显（Ｐ<0.01），胸腔模型组小鼠活动减少、睡眠时间缩短、蜷曲、毛发脱落等现象较皮下模型组多见，胸腔模型组小鼠游泳实验及耐缺氧实验时间较皮下模型组明显缩短（Ｐ<0.01），胸腔模型组小鼠早期可出现胸水和肿瘤转移，而皮下模型组小鼠早期未见胸水和肿瘤转移。
结论：胸腔移植模型可作为晚期肺癌动物模型。
【关键词】 Lewis肺癌胸腔移植模型皮下移植模型晚期肺癌小鼠肺癌动物模型与临床结果一直存在差距，尤以晚期模型更为明显。
我们在进行动物实验研究中发现，目前使用的肿瘤皮下移植模型中，动物生存时间差异很大，不利于生存期观察。
肿瘤发展到晚期也可以出现转移，但是发生率很不一致。
另外，模型的肿瘤负荷和产生的症状、并发症、生存状态也很不一致。
为了克服皮下移植模型缺陷，有学者采用将人类癌组织或肿瘤细胞悬液直接植入支气管的方法，可以很好模拟支气管肺癌的临床特征，但是其技术要求较高，成功率较低［12］。
另外，也有人采用外科手术移植方法，同样也是成功率低于10%［3］。
这些模型都需要无胸腺裸鼠或SCID小鼠，饲养条件高，实验费用昂贵。
鉴于肺癌模型的建立现状，至今未见有经胸腔直接移植建立晚期肺癌模型的报道，因此，作者采用清洁级小鼠C57BL/6胸腔种植鼠源性Lewis肺癌细胞的方法，进一步比较该模型和皮下移植模型肿瘤生长状况，观察治疗前后小鼠生存时间、生存状态及其相互关系，研究该模型稳定性和实用性。
小鼠肺癌原位模型的建立
小鼠肺癌原位模型的建立Establishment of orthotopic lung cancer model in mice XU Zihang LIU Fei ZOU Chunpu ZHU Shiguo CHEN XiaoSchool of Basic Medical Science ，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine ，Shanghai 201203 ，China[] Objective Morbidity and mortality remain high in lung cancer ，but the animal lung cancer models used for the experimental research are limited ，so to establish an orthotopic lung cancer model，which is stable and similar to the human tumor microenvironment ，is a foundation for the further study of lung cancer research. Methods Luciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix were directly injected into the left lung of C57BL/6 mice after cutting open a incision of the skin ，which about 1 cm ，and there was no need to open the chest. Small animal in vivo bioluminescence imaging system was used to monitor tumor growth and metastasis. At different time points ，mice were sacrificed and the lung tissues were isolated and imbedded with paraffin. Pathological diagnosis was madebysliced and HEstained. Results LLC cells (0.5 x 105) were enough to form an orthotopic pulmonary tumor ，and the success rate wasabove 90%. The metastases to contralateral thoracic ，contralateral lung ，bilateral axillary and inguinal lymph nodes were monitored by bioluminescence technique. Conclusion The orthotopic tumor models of lung cancer can successfully built by injection ofluciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix mixture. Furthermore ，a few LLC cells are needed ，and the tumor formation rate is high ，besides there is no operation death risk. It has good metastases and high repeatability ，in addition it's easy to operate and easy to be monitored ，which provides a good method for the establishment of mouse models for further study of lung cancer.目前，肺癌动物模型的构建方法有化学诱导法、转基因法、异位移植法、原位移植法等。
小鼠小细胞肺癌模型的建立
肺癌占全世界肿瘤发病率的 12.7%、死亡率的 18.2%，是目前最常见的引发死亡的疾病之一[1]。在 临床和组织病理学上，肺癌分为两大类，小细胞肺 癌 （small cell lung cancer, SCLC） 和非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer, NSCLC）。小细胞肺癌大 约占肺癌的 20%，而更具有肿瘤异质性的非小细胞 肺癌大约占 80%[2]。小细胞肺癌与非小细胞肺癌相 比恶性程度较高，转移早而广泛，尽管小细胞肺癌 对化疗、放疗敏感，但很快出现复发或病情进展[3]， 目前尚无有效的靶向治疗药物，因此小细胞肺癌是 研究肿瘤转移很好的模型。由于人小细胞肺癌中肿 瘤抑制基因 Trp53 和 Rb1 的高突变率，所以 Trp53 和 Rb1 基因的缺失可能为建立小鼠小细胞肺癌模 型提供了合理的手段[4]，我们利用 Cre-loxP 系统来 特异性敲除 Trp53loxP/loxP；Rb1loxP/loxP 小鼠肺上皮细胞中 Rb1 和 Trp53，其 Ad-Cre 重组腺病毒是通过气管插 管来感染小鼠。因此体内气道上皮和肺泡域型细胞 中敲除 Rb1 和 Trp53，诱发小鼠的小细胞肺癌。
作者简介 王子乔（1996-），女，本科在读，研究方向：肺癌转移；通信 作者：刘喆，E-mail:zheliu@。
1 材料和方法 1.1 材料 Trp53loxP/loxP；Rb1loxP/loxP 小鼠由中科院上海 生化细胞研究所季红斌教授馈赠, 所用腺病毒 AdCre 来 自 VECTOR BIOLABS （The Gene Delivery Company，货号 1045）。 1.2 试剂 PCR 试剂盒购自北京全式金生物技术 有限公司。DAB 显色试剂购自北京中杉金桥。CgA 抗体购自美国 ABcam 公司（货号 ab15160）。Cgrp 抗 体购自 Milipore（货号 AB5920）。TTF-1 抗体购自迈 新试剂 （货号 MAB-0599）。小鼠麻醉剂购自美国 Sigma 公司（货号 T48402）。 1.3 小 鼠 的 鉴 定 Trp53 基 因 型 鉴 定 引 物 ：5忆 CGCAATCCTTTATTCTGTTCG-3忆，5忆- AGCACATAG GAGGCAGAGAC-3忆，5忆- TGAGACAGGGTCTTGCTA TTG-3忆。Rb1 基因型鉴定引物：5忆- GAAAGGAAAGT CAGGGACATTGGG-3忆，5忆- GGCGTGTGCCATCAA TG-3忆。 1.4 小鼠小细胞肺癌动物模型的建立 首先腹腔注 射麻醉剂麻醉 2 月龄小鼠，再以 Ad-Cre CaP（i Ad-Cre CaPi：滴度为 107PfU 的 Ad-Cre 2 滋L 加入到 246.8 滋L
小鼠肺癌模型
（1）尾静脉注射
（2）骨髓注射
比较符合解决临床问题的模型
转基因模型（定制）
SP-C /myc / IgEGF双转基因小鼠(寿命9个月)、K-ras和p53突变的肺癌小鼠、EGFR突变和K-Ras诱导的内源性小鼠模型
SV40T抗原与p53蛋白和Rb蛋白结合，建立的转基因小鼠UT7.1发展出多灶性细支气管腺癌
皮下移植：将肿瘤细胞悬液或外科手术中采集的肿瘤组织移植到小鼠的背部、57 BL/6小鼠
（1）支气管注射
（2）肺内注射
（3）胸膜注射
有较高的肿瘤成瘤率，而且能突显肿瘤的侵袭和转移特性，从更大程度上模拟人体肺肿瘤的微环境，故该模型为目前较为理想的肺癌动物模型
转移模型
小鼠肺癌模型
类型
小鼠品系
方法
优点/缺陷
化学诱导肺癌模型
A/J小鼠或者BALB/c裸鼠，自发肺肿瘤频率最高的小鼠品系为A/J
使用化学致癌物，常用的如乙基亚硝脲采用口服、吸入、腹腔注射、支气管灌注或支气管黏膜下注射等方法对小鼠进行诱癌
成瘤时间长（数月），诱发肿瘤不易转移
异位移植模型
C57BL/6、昆明种小鼠（少）、IRM-2小鼠
肺原位注射模型
肺原位注射模型
细胞准备
取状态良好的肺癌细胞（如A549）胰酶消化收集，用PBS分散细胞悬液，离心后，加入基质胶（高浓度型），配比为50µl细胞悬液+50µl基质胶，其中细胞悬液中的细胞量为3*106个。
裸鼠准备
选取5-8周龄健康裸鼠
操作步骤
1.裸鼠100µl水合氯醛麻醉后右侧卧位固定，右侧胸部皮肤用酒精消毒。
2.确定小鼠肺部位置，位于小鼠左侧肋骨下缘以上约1cm处，有两条纵向较粗的血管，肺部位于这两条血管之间。
3. 用手术剪剪开右侧胸部皮肤，一般可以看见颜色浅于肌肉的随呼吸运动上下起伏的肺叶，如视野不明朗，可以用镊子钝性分离肌肉组织暴露目标视野。
4. 用胰岛素针将准备好的细胞混合液，垂直进针，打入右肺中叶，进针深度在3-5mm，推针速度尽量慢，全部推进去后可以轻轻压住进针处。
5.缝合皮肤，消毒，待小鼠苏醒后放回动物房继续饲养
注意事项
基质胶要注意使用温度，保证在冰上进行，不要让它凝固。
小鼠肺癌模型
小鼠肺癌模型
小鼠肺癌模型
小鼠肺癌模型
将小鼠平放，与左右侧腋下中部以碘伏消毒并备皮，剪开膈肌，沿 两侧肋骨剪开胸腔暴露肺脏、心脏
首先观察肺脏是否存在出血或充血，其次观察是否存在水肿或 气肿，剪开上下俩端气管，将部分肺组织置在离心管中，注入 PBS缓冲液并密封标记，随后存放在冰箱中
取部分肺组织进行常规组织石蜡包埋步骤，最后进行HE 染色
小鼠肺癌模型
4、 病理学报告：形态与原代体外细胞形态相似 ,程 长梭形 ,核幼稚 ,细胞核深染 ,核异型性明显 ,排列
杂乱紧密 ,与邻近肺组织特征完全不同
5、 评估肺癌模型：通过观察肿瘤的生长情况、组织学 检测、免疫组化染色等方法对肺癌小鼠模型进行评估
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谢
谢
小鼠肺癌模型
小鼠肺癌模型
目录
小鼠肺癌模型
1、 实验动物 :无特定病原体(SPF) 级 C57BL/6 小鼠 ,6 ~8 周 ,雌 性 ,体重约 22 g ,共10只。实验 动物使用的 3R原则给予人道主义 关怀
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2、 体内移植肺癌细胞：将 体外培养的肺癌细胞注射到 小鼠体内，形成移植瘤模型
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小鼠肺癌模型
3、 实验方法 细胞复苏 1、 将水浴锅预热至37℃，准备好干净的一次性PE手套，置于含 10%血清、 1%双抗的 DMEM/HIGHGLUCOSE 基础培养基中 2、 将细胞从液氮罐中取出放入PE手套中，迅速没入水浴锅，摇晃冻存管加速溶解，以1 分钟内全部溶解为宜 3、 在超净台中将复苏好的细胞液加入到装有新鲜培养基的离心管内，1200rpm/min 离 心3分钟，离心完毕去掉上清 4、 用适量与细胞对映的完全培养基重悬细胞，接入到无菌容器中(培养瓶或培养皿)， 补充培养基到适宜，放入培养箱培养 5、每天镜下观察细胞生长状态,每 2 天换液处理,约每 3 d 进行消化传代一次。细胞汇 合率达 80%进行传代培养