基因表达的分析技术
基因表达的检测技术
基因表达的检测技术
基因表达的检测技术是用来研究和识别一个细胞或组织中的基因在特定条件下是否被转录成RNA，并进一步翻译成蛋白质的过程。
以下是几种常见的基因表达检测技术。
1. RNA测序（RNA-Sequencing）：这是一种高通量的技术，用于确定细胞或组织中所有转录的RNA序列。
通过分析RNA测序数据，我们可以了解到哪些基因在特定条件下被表达，并可以比较不同条件下基因表达的变化。
2. 实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）：qPCR是一种常用的基因表达检测方法，它能够快速、准确地测量特定基因的转录水平。
这种技术利用特定引物和荧光探针，通过PCR扩增基因的RNA或DNA，并实时监测荧光信号的累积量来定量目标基因的表达水平。
3. 原位杂交（In situ hybridization）：原位杂交是一种用来检测特定RNA序列在组织或细胞中的位置的技术。
它使用标记有特定序列的探针与目标RNA序列结合，然后通过可见或荧光标记来显示目标RNA的位置。
这种技术可以帮助研究者确定特定基因在组织中的表达模式和水平。
4. Northern印迹（Northern blotting）：这是一种传统的技术，用于检测和定
量RNA的表达水平。
它使用电泳将RNA分离，然后将其转移到膜上，并使用特定的探针与目标RNA结合，最后通过探针的放射性或非放射性标记来检测目标RNA的存在与数量。
这些技术在研究基因表达调控、细胞分化、疾病发展等领域起着重要作用。
通过这些技术，我们可以更深入地了解基因的功能和调控机制。
基因表达差异的分析方法研究
基因表达差异的分析方法研究基因表达差异是指在不同生物或不同条件下，对同一基因进行的表达实验中，所测得的表达量之间的差异。
对基因表达差异的研究可以帮助我们更好地理解基因功能和调控机制，并为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
接下来，将介绍一些基因表达差异分析的方法。
1. 微阵列技术微阵列技术是最早被用于基因表达差异分析的方法之一。
该技术利用DNA芯片上固定的互补DNA序列与待测RNA样品进行杂交，测定样品中各个基因的表达水平。
具体操作步骤包括：样品采集、RNA提取、标记、杂交与扫描等多个步骤。
虽然微阵列技术具有高通量、高灵敏度和高精度等优点，但也存在着成本高、样品处理复杂和标记的局限性等问题。
2. RNA测序技术随着二代测序技术的发展，RNA测序技术已成为一种常用的基因表达差异分析方法。
RNA测序技术利用高通量测序平台对RNA样品进行测序，可以对基因的转录和剪切等过程进行全面的检测和定量。
与微阵列技术相比，RNA测序技术不需要依赖于基因组序列信息，同时还可以检测未知序列和新基因的表达情况。
但RNA测序技术也存在着不同的测序深度和质量、样品处理和分析方法等影响分析结果的因素。
3. 质谱技术质谱技术是一种基于蛋白质组学的方法，也可以用于基因表达差异的分析。
该技术主要包括两个步骤：蛋白质消化和质谱分析。
在蛋白质消化步骤中，蛋白样品被加入胰酶等酶类，将多肽生成后进行分离。
在质谱分析中，分离后的多肽样品被注入质谱仪，得到其质量和放电荷比例的信息。
由此可以推断出蛋白的氨基酸组成和序列等信息。
质谱技术的优点包括定量、选择性和灵敏度高，同时可以进行定量分析和鉴别分析。
4. 基因编辑技术随着基因编辑技术的发展，我们还可以通过CRISPR-Cas等技术对基因表达差异进行分析。
在这种方法中，我们可以将CRISPR-Cas系统引导的RNA处理后注入细胞内，选择性地打靶并对目标基因进行编辑，从而直接体现基因在表达水平上的变化。
生命科学中基因表达分析技术的研究与应用
生命科学中基因表达分析技术的研究与应用基因是生命的基础单位，它们是DNA序列的一部分，控制着所有生命过程。
基因表达是指基因转录成RNA，然后转录成蛋白质的过程。
基因表达调控是生命过程中的一个关键点，它可以影响细胞的分化和生长，以及疾病的发生和治疗。
因此，研究基因表达分析技术在生命科学中的应用具有重要意义。
一、什么是基因表达分析技术基因表达分析技术是一组用于定量测量特定基因表达的技术。
这些技术包括实时荧光定量PCR，微阵列分析和RNA测序。
这些技术可以测量基因表达的水平，以确定特定基因的转录活动是否增加或减少。
1.实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（qPCR）是一种快速测量特定基因表达水平的技术。
它使用DNA聚合酶将RNA转录成DNA，该过程称为反转录。
接下来，PCR被用于扩增DNA，使其可以被侦测。
qPCR使用荧光探针或DNA染料检测特定的PCR产物。
该技术可以在短时间内测量小量的RNA，因此在诊断和生物学研究中广泛使用。
2. 微阵列分析微阵列分析是一种大规模测量基因表达水平的技术。
它通过核酸杂交探针在微阵列上测量基因表达变化。
该技术可以用于高通量分析基因表达，并确定与疾病相关的基因。
3. RNA测序RNA测序是一种高通量的基因表达测量技术，它通过直接测量RNA文库中的含量来检测基因表达水平。
该技术可以在不需要参考基因组的情况下对RNA的序列进行测量，因此对于新物种基因表达分析十分有用。
二、基因表达分析技术的应用基因表达分析技术的应用非常广泛。
以下是其中一些应用：1. 研究细胞生命周期基因表达分析技术被广泛应用于研究细胞生命周期的调控。
这些研究发现，许多基因与细胞周期的不同阶段相关，包括DNA复制和有丝分裂。
通过这些技术可以确定基因表达的动态变化，揭示细胞周期的基因调控机制，为生物研究提供了可靠的分析工具。
2. 肿瘤诊断基因表达分析技术用于肿瘤诊断。
肿瘤细胞与正常细胞不同，其基因表达级别也不同。
检测基因表达变化的方法
检测基因表达变化的方法基因表达变化是指基因在特定条件下转录和翻译水平的变化。
检测基因表达变化的方法有很多种，以下是几种常用的方法：1. 转录组测序（RNA-seq）转录组测序是一种基于高通量测序技术的方法，可以检测基因在不同条件下的转录水平。
该方法首先从细胞中提取总RNA，然后通过建库、测序和分析得到每个基因的转录本序列。
通过比较不同条件下的转录本序列，可以发现基因表达的变化。
RNA-seq具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，适用于研究基因表达的复杂性和动态性。
2. 定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）qRT-PCR是一种基于PCR技术的方法，可以检测特定基因的表达水平。
该方法首先从细胞中提取总RNA，然后通过反转录得到cDNA，再通过PCR扩增得到目的片段。
通过比较不同条件下的目的片段拷贝数，可以发现基因表达的变化。
qRT-PCR具有高灵敏度、高特异性和可重复性好等优点，适用于验证RNA-seq等高通量测序方法的结果。
3. 微阵列分析微阵列分析是一种基于芯片技术的方法，可以同时检测多个基因的表达水平。
该方法将已知序列的探针集成在芯片上，然后将待测的cDNA或RNA与探针进行杂交。
通过检测杂交信号的强度，可以发现基因表达的变化。
微阵列分析具有高通量、高效率和高灵敏度等优点，适用于大规模的基因表达谱研究。
4. 原位杂交原位杂交是一种将探针与组织切片上的目标基因进行杂交的方法，可以检测目标基因在组织中的表达位置和表达水平。
该方法将探针与组织切片上的目标基因进行杂交，然后通过荧光或免疫组化等方法显色标记杂交信号。
通过观察杂交信号的数量和分布，可以发现基因表达的变化。
原位杂交具有高特异性、高灵敏度和定位准确等优点，适用于研究基因表达的组织特异性。
5. 免疫组织化学免疫组织化学是一种利用抗体与目标蛋白进行特异性结合的方法，可以检测目标蛋白在组织中的表达位置和表达水平。
该方法将抗体与目标蛋白进行特异性结合，然后通过显色标记抗体结合的位置。
大规模基因表达数据的分析技术发展
大规模基因表达数据的分析技术发展自从人类基因组的测序完整之后，基因科学逐渐进入一个全新的时代。
大规模基因表达数据的分析技术的发展，则是基因科学领域取得进展的关键之一。
本文将分析大规模基因表达数据的分析技术发展历程和现状，以及未来的发展趋势。
一、基因表达数据基因表达是指基因蛋白质产生的过程。
在表达过程中，基因在细胞核内的DNA被转写成RNA，并通过RNA聚合酶复制到细胞质中。
该RNA被翻译成具有特定功能的蛋白质。
在细胞生命周期中，基因表达是一系列复杂而多步骤的过程。
基因表达数据是指衡量基因表达的数据，通常使用通过RNA晶片、RNA测序技术或其他分子生物学技术测得的基因表达水平。
这些数据可以帮助科学家理解细胞、组织和器官的复杂功能，同时还可以诊断疾病，并帮助科学家发现新的药物和治疗方法。
二、大规模基因表达数据分析技术发展基因表达数据分析技术是指将大量基因表达数据应用于计算机分析，以了解基因表达特定模式的方法。
这种技术涉及统计学、计算机科学、生物学和化学等学科的交叉应用。
大规模基因表达数据分析技术的发展历程可以追溯到DNA微阵列（DNA microarray）技术的出现。
DNA微阵列是用于监测基因表达的技术，它通过同时检测大量的基因表达水平，使得大规模分析基因表达数据成为可能。
DNA微阵列技术的出现，推动了基因表达数据分析技术的发展，许多新的基因分析工具被开发。
随着技术的发展，数据挖掘、机器学习、图形和统计学技术被应用到基因表达数据的分析中，并为基因表达数据分析带来了许多新的思路和方法。
三、大规模基因表达数据分析技术现状和挑战在大规模基因表达数据分析技术的发展历程中，随着数据量的逐渐增加，数据处理、数据存储和数据传输等问题成为了分析过程中的一个难点。
同时，基因表达的量级也存在显著的异质性和不确定性，数据预处理和归一化等问题也成为很大的挑战。
此外，基因表达数据的时间序列性质和多元性质也给数据分析和预测带来很大的挑战。
基因表达谱分析技术的原理与方法
基因表达谱分析技术的原理与方法随着基因组学技术的发展，我们可以从一个细胞或组织中同时检测数以万计的基因，了解人体健康和病理的分子机制。
基因表达谱分析技术，又称转录组学技术，是一种重要的基因组学技术，它可以帮助我们深入了解基因表达的变化及其对生物学特征和疾病的影响。
在本篇文章中，我们将介绍基因表达谱分析技术的原理和常用方法。
原理基因编码不同功能蛋白的RNA是由基因的转录过程产生。
基因表达是指在特定的时间点和组织中转录某一基因所产生的RNA数量和质量。
例如，心脏细胞和肝脏细胞表达不同的基因，因为它们需要不同的蛋白质来执行其特定功能。
基因表达谱分析技术就是通过检测RNA水平的变化来揭示不同组织、疾病和情况下基因的表达变化。
在基因表达谱分析中，采集组织或细胞的RNA，把RNA转化为cDNA，再将cDNA探针的引物或/和微阵列片段引入cDNA上进行探针测序或比较。
探针把其考察的基因特异性的cDNA附着在cDNA探针上，然后将其组分检测出。
在反转录，多聚酶链反应（PCR）或减少串接的基础上，引物是特异探针或一段数字长cDNA中的一个段落，被称作探针序列，以检测在RNA大样本中是否有包含这样的特异性片段。
通过这种方法，我们可以得到不同组织或情况下的RNA表达状况，从而分析基因表达谱。
方法1.微阵列微阵列是最常用的基因表达谱分析技术之一。
在微阵列上，数千个cDNA探针被绑定到玻璃片上，每个探针用来检测一个特定的基因。
将RNA转化成标记染料的cDNA，将其添加到微阵列上，并运用一些特殊的分子技术比如荧光检测或电化学检测等，检测cDNA与微阵列上的探针结合的信号。
这种方法非常适合于同时分析数千个基因，在研究基因调控网络及其调节中扮演重要角色时，微阵列可以很好地对大规模基因表达谱的分析。
2. RNA测序RNA测序技术已成为转录组分析领域的领导者。
它可以直接检测RNA而不需要提前知道基因序列，而且这种技术不受在微阵列上的探针长度或性能的影响。
生物信息学研究中的基因表达分析方法
生物信息学研究中的基因表达分析方法随着技术的不断发展，基因表达信息已经成为了众多生物学研究的重要数据来源。
我们可以通过基因表达信息来了解细胞内基因转录活动的变化、探索基因调控网络的结构和功能，甚至可以预测未来细胞发育的走向。
在研究中，我们经常会使用一些生物信息学中的基因表达分析方法，本文将简单介绍一些常见的基因表达分析方法和应用领域。
1. 基因表达聚类分析基因表达聚类分析是将大量样品中基因表达谱进行分类，从中找到具有相似表达谱的基因，将它们放入同一组别。
对于一个未知的基因，我们可以通过它与已知基因的表达谱进行比较，将其归入相应类别。
这种方法常见的应用场景包括：基于表达谱的肿瘤亚型分类、基因功能预测等。
其中，基于聚类分析的聚类算法主要有层次聚类和k均值聚类两种。
层次聚类算法将样本或基因逐步归类，生成一个树状结构(Dendrogram)，可以根据需要将树状结构切割成指定数量的聚类；k均值聚类则根据事先指定的聚类数量将所有数据划分为指定数量的类别。
2. 差异基因表达分析在比较两个或多个生物组织或环境的基因表达水平时，常用差异分析来筛选表达差异明显的基因。
通过差异分析，我们可以发现哪些基因在不同的细胞类型、组织类型和发育阶段中表达水平差异较大，甚至可以帮助我们发现潜在的疾病标记物。
常见的差异分析方法包括t检验、方差分析和较新的DESeq、edgeR等差异表达分析软件包。
3. 基因组拼接分析在基因组拼接分析中，我们对齐基因组序列和转录组序列以鉴定剪切变异、外显子水平表达和全内含子表达等信息。
基因组拼接分析使得我们能够进一步挖掘基因、蛋白质和RNA转录本的相互作用模式和基因区域的多样性。
常用的方法包括软件包如TopHat、Cufflinks等。
4. 生物网络分析通常，基因表达谱是由多个基因表达水平组成的，而这些水平之间可能相互影响。
基于此，我们可以构建生物网络图谱并挖掘功能模块来获得新的知识。
这种方法的优点在于我们可以通过挖掘关键基因和互作关系来发掘新的靶点和以及不同疾病之间的关系。
基因表达系列分析技术的原理和流程
基因表达系列分析技术的原理和流程英文回答：Gene Expression Profiling Technologies.Gene expression profiling technologies are used to measure the expression of thousands of genes simultaneously, providing a comprehensive overview of gene activity in a given sample. These technologies have revolutionized the study of biology and disease, allowing researchers toidentify genes and pathways involved in various biological processes and to diagnose and treat diseases.The two main types of gene expression profiling technologies are:Microarray technology uses DNA oligonucleotides fixedto a solid surface to measure the expression of a large number of genes. mRNA from a sample is labeled and hybridized to the oligonucleotides, and the amount ofhybridization is measured. The intensity of the signal for each gene is proportional to the expression level of that gene.RNA sequencing (RNA-Seq) technology uses high-throughput sequencing to measure the expression of all transcripts in a sample. mRNA from a sample is converted to cDNA and then sequenced. The abundance of each transcript is proportional to the expression level of that gene.Gene expression profiling technologies have a wide range of applications in research and medicine, including:Identifying genes and pathways involved in biological processes.Diagnosing and treating diseases.Developing new drugs and therapies.Monitoring the response to treatment.The general workflow for gene expression profiling experiments is as follows:1. Sample preparation.2. RNA isolation.3. Labeling and hybridization (microarray) or cDNA synthesis and sequencing (RNA-Seq)。
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第二篇细胞的遗传物质第三章基因表达的分析技术生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。
对基因结构与基因表达调控进行研究，是揭示生命本质的必经之路。
在基因组研究的过程中，逐步建立起一系列行之有效的技术。
针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。
第一节PCR 技术聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）技术是一种体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。
PCR 技术日斟完善,成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。
应用PCR 技术可以使特定的基因或DNA 片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。
扩增的片段可以直接通过电泳观察,并作进一步的分析。
一、实验原理PCR是根据DNA变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。
第一，按照欲检测的DNA的5,和3,端的碱基顺序各合成一段长约18〜24个碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。
引物设计需要根据以下原则：①引物的长度保持在18〜24bp 之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影响产物的合成效率；②GC含量应保持在45〜60%之间；③5,和3,端的引物间不能形成互补。
第二，将待检测的DNA 变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。
通过95C变性，在进入较低的温度使引物与待扩增的DNA 链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与模板DNA 链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条DNA 双链合成为两条双链。
通过变性（92〜95C）—复性（40〜60C）—引物延伸（65〜72C）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA 片段。
理论上循环20周期可使DNA 扩增100余万倍。
二、PCR技术的分类及其应用范围1. 逆转录PCR 逆转录PCR (RT-PCR)是将RNA反转录和PCR结合而建立起来的一种PCR技术。
其包括两个过程：通过逆转录合成cDNA和对之进行PCR 扩增。
其中，用于逆转录的RNA 模板要求完整，并且不含DNA 和蛋白质等杂质。
逆转录PCR可以检测低于10个拷贝的特异RNA。
2. 原位PCR 原位PCR技术(in situ PCR)是将检测细胞内特定基因的原位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。
它是扩增组织切片或细胞内微量的基因，并将其检测出来的技术。
3. 甲基化PCR 甲基化PCR 与常规PCR 在原理上一致，但在引物的设计以及DNA 样本的处理上有所不同。
针对扩增的DNA 甲基化区域，一般需要设计三条引物：正常序列引物、甲基化对应引物以及DNA 序列修饰引物。
通过三组PCR,判断DNA序列中甲基化的存在与否。
4. 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR) 是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，并能对起始模板进行定量分析。
RT-PCR需要荧光探针参与，常用的探针可分为以下几类：1)内掺式染料SYBR Green I ；2)序列特异性探针：Taqman, Molecular Beacons，Dual Probes；3)特异性引物：Amplifluor(Intergen)，Lux 引物，Scorpion；4)阴阳探针。
荧光定量PCR 不仅可以测定靶DNA 的含量，用于临床诊断，而且可以应用不同的探针检测基因突变和SNP分析。
5. 多重引物PCR多重引物PCR是在同一扩增体系加入多对引物，同时扩增多个基因片段的PCR 技术。
其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或同一疾病的几个不同的基因突变。
6. 随机引物PCR 多态DNA 的随机扩增 ( random amplication of polymorphic DNA，RAPD)或随机引物PCR (arbitrarily primed PCR，AP PCR) 是应用基因组DNA 中单一、随机序列的短引物，通过PCR扩增产生一组代表种或株特性的DNA 片段。
因此，RAPD 是获得种或株的DNA 分子指纹图谱的通用方法。
7. 套式PCR 又称巢式PCR，是对靶DNA片段设计两套引物系统，第1 套引物扩增15〜30个循环，再用扩增的DNA片段内设定的第2套引物扩增15〜30 个循环，可使目的DNA 序列得到高效扩增。
套式引物PCR 可减少引物的非特异性扩增，增加特异性扩增，减少PCR的误诊率。
8．突变体构建PCR（1）应用载体构建突变体的PCR：原理是将野生型目的基因的cDNA插入到克隆载体上，设计携带突变点的一对引物，对克隆载体进行扩增，然后将经过PCR而获得的DNA转染感受态细胞，并用筛选培养基筛选转染的细胞，获得的克隆可以通过细胞扩增，获得大量的携带突变体DNA 的载体。
（2）应用内外引物构建突变体的PCR：载体构建突变体PCR是构建点突变的高效方法，但不适用于缺失、易位、倒位等突变方式。
内外引物构建突变体PCR 可以克服载体构建突变体PCR 的不足。
其原理是合成两对引物，即一对扩增整个cDNA 的外引物和一对包含突变序列并部分互补的内引物。
分别以一个外引物与一个内引物进行PCR，可以获得两条DNA序列，该两条DNA在突变位点存在部分重合。
去除引物，将两条DNA 变性，而后进行复性，将可导致两条DNA重合部分互补，并在Taq酶的作用下补齐3,末端。
用外引物扩增DNA，将获得含有突变的cDNA。
PCR引物的设计是PCR成功的关键，必须遵守以下原则：①确定扩增区域及其长度；②确定引物的Tm值；③避免引物自身二聚体、引物间二聚体和发夹结构等二级结构的形成；④具有扩增的特异性。
三、应用PCR 技术检测性别决定基因（一）实验原理SRY基因又称睾丸决定基因（Testis determining factor），位于人类Y染色体，在X染色体上没有相应的同源节段。
根据SRY基因序列合成一对特异性引物，通过PCR 反应检查患者有无此基因相应扩增片段，以及患者的表型可对患者的真正性别和病因作出判断，另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病患儿的出生。
（二）实验准备1. 材料人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、1.5ml 及0.5ml Eppendorf 管。
弓I物序列：（SRY1: 5'-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG- 3'; SRY2:5-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG- 3')2. 试剂（实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理）生理盐水、细胞裂解液（50mmol Tris-HCl , pH 8.0; Immol Na? EDTA , pH 8.0;0.5% SDS; 0.1mmol NaCI）、10mg/ml 蛋白酶K、20%SDS、水饱和酚（1mol/L Tris-HCl 抽提）、酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 ：1）、氯仿：异戊醇（24 ：1）、8mol/L 醋酸钾、无水乙醇、70%乙醇、TE（pH8.0）（10 mmol/L Tris-HCl ,pH8.0;0.1 mmol/L Na2EDTA, pH8.0）、10duffer （500mmol/L KCl、100mmol/L Tris HCl, pH8.3, 室温15mmol/L MgCl2；0.1% 明胶）、4XdNTP （1 mmol/LdATP , 1 mmol/L dCTP , 1 mmol/L dGTP, 1 mmol/L dTTP）、Taq 酶（1U/ 卩）1、引物溶液（10pmol/ 015X TBE 缓冲液（1000ml）（54g Tris 碱，27.5g 硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA , pH8.0）、DNA 分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液（100ml）（0.2%溴酚蓝，50%蔗糖，10mol/L NaOH仏2滴）、10mg/ml 溴化乙锭溶液（戴手套谨慎称取溴化乙锭约200mg,放入棕色瓶中，加重蒸水20ml,溶解后置4C冰箱保存备用。
使用时100ml 琼脂糖凝胶中加5卩l 10mg/ml溴化乙锭溶液，终浓度为0.5卩g/n）。
3. 实验仪器PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测仪。
（三）实验步骤1. DNA模板制备方法I:取毛发12根，尽量剪碎，于15 20ml生理盐水中100C水浴10min, 离心取上清备用。
方法U:外周血提取DNA（1）白细胞的分离①抗凝血用1〜2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。
②在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。
③室温以2000rpm离心15min〜20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。
④吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。
⑤用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。
⑥最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于DNA的提取，或冻存于超低温冰箱中，直至使用。
(2)DNA 的提取(见本篇第一章) 。
2. PCR 反应体系配制及扩增(1) PCR反应总体积50卩,1取一洁净的0.5ml Eppendof管，依次加入：10 x buffer5卩dNTP5卩引物1 2.5卩引物2 2.5卩模板DNA10^Taq DNA2Ud3H2O补足50(2)将反应管放入PCR扩增仪上进行聚合酶链反应，条件为94C变性10min 后，94r 45s、55r 45s、72C 90s共30个循环；最末一个循环紧接72C再延伸10min。
3. 扩增产物电泳检测取PCR扩增产物10卩与2卩上样缓冲液混合后，与DNA Marker同时进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳结束，取出凝胶置于紫外检测仪上观察。
(四)注意事项1. 实验过程应设阴性及阳性模板对照。
2. PCR常见问题及解决办法(1)没有得到预期的PCR扩增产物：①确证聚合酶的活性是否正常；② DNA解链是否充分，变性温度是否准确；③引物组成是否正确，有无二级结构组成；④反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在，使聚合酶或模板及产物降解。
(2)有非特异性扩增产物出现：①增加复性温度，缩短复性时间及延伸时间；②降低引物和Taq DNA聚合酶的用量；③调整皿§2+浓度；④减少热循环次数。
(3)形成了引物二聚体：①检查引物的序列，特别是3端是否有互补区；②增加引物的长度；③调整引物与模板浓度，使模板比例增高，降低引物使用浓度；④增加复性温度；⑤减少热循环次数。
(4) PCR产物在凝胶电泳中成片状：①减少Taq DNA聚合酶的用量；②增加复性温度，减少复性时间及延伸时间；③降低Mg2+浓度；④减少循环次数；⑤从凝胶中回收与预期分子量相同的DNA，再次进行PCR反应。