荧光标记二抗的选择
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
如何制作荧光二抗
如何制作荧光二抗
荧光二抗是一种常用于生物实验的染色剂，它可以用来检测细胞、组织或蛋白质的存在和分布情况。
荧光二抗通常是用来在荧光显微镜下观察样品，所以其荧光强度很重要。
下面就介绍一下如何制作荧光二抗。
1.选择荧光二抗
首先，你需要选择合适的荧光二抗。
常用的荧光二抗有FITC、TRITC、Cy3等，这些荧光二抗的波长不同，可以用来检测不同的标记物。
你需要根据自己的实验需要选择合适的荧光二抗。
2.准备荧光二抗溶液
其次，你需要准备荧光二抗溶液。
通常，荧光二抗是以粉末形式存在的，你需要将其加入适当的溶剂中，按照说明书指定的浓度进行稀释。
常用的溶剂有PBS、DMSO等，你需要根据自己的实验需要选择合适的溶剂。
3.添加防腐剂
接着，你需要添加防腐剂。
荧光二抗易被氧化，所以溶液中需要添加防腐剂来防止荧光二抗的氧化。
常用的防腐剂有硫酸钠、抗坏血酸等。
你可以根据自己的实验需要选择合适的防腐剂。
4.进行质量控制
最后，你需要对制作的荧光二抗溶液进行质量控制。
你可以使用荧光显微镜或流式细胞仪等仪器对荧光二抗的荧光强度进行检测。
如果荧光强度不符合要求，你可以调整溶液浓度或更换溶剂来调节荧光强度。
以上就是关于如何制作荧光二抗的方法。
在制作荧光二抗时，你需要注意选择合适的荧光二抗和溶剂，并加入防腐剂，最后进行质量控制。
这样，你就可以制作出高质量的荧光二抗溶液，为你的实验提供可靠的检测数据。
免疫荧光染色质量影响因素分析
免疫荧光染色质量影响因素分析免疫荧光染色是一种常用的细胞或组织分析方法，它能够通过特异性的抗体与目标蛋白结合，然后再使用荧光标记的二抗来检测目标蛋白的分布及表达水平。
免疫荧光染色技术具有灵敏度高、特异性好等优点，因此被广泛应用于生物医学研究领域。
免疫荧光染色的质量受多方面因素的影响，本文将对这些影响因素进行分析。
一、抗体的选择抗体的选择对于免疫荧光染色的结果至关重要。
需要选择具有高亲和力和特异性的抗体来保证染色的准确性和可靠性。
抗体的工艺制备和保存也会影响染色的质量，因此需要选择合适的抗体生产商或来源，并严格按照抗体的使用说明进行保存和使用。
二、样品的固定和预处理样品的固定和预处理对于免疫荧光染色的结果影响也较大。
不同类型的样品需要采用不同的固定和预处理方法，以确保目标抗原的完整性和可溶性。
在固定和预处理过程中，需要注意避免抗原损失或降解，同时保证样品的完整性和稳定性。
三、荧光标记的二抗选择荧光标记的二抗用于检测抗体与目标蛋白的结合情况，因此对于染色结果具有重要影响。
在选择荧光标记的二抗时，需要考虑其荧光标记物的稳定性和亮度，以及与抗体结合的效率和特异性。
四、染色试剂的质量免疫荧光染色过程中所使用的染色试剂的质量也会对染色结果产生影响。
染色缓冲液的pH值和离子强度、染色溶液的稀释比例等都会对染色的结果产生影响，因此需要选择高质量的染色试剂，并严格按照使用说明进行操作。
五、免疫荧光染色条件的控制免疫荧光染色过程中，温度、时间、光照等条件的控制也会对染色结果产生影响。
需要根据样品类型和抗体特性等因素，选择适当的染色条件，并严格控制每一步操作的执行。
六、荧光显微镜的性能和参数对于免疫荧光染色结果的观察和分析，荧光显微镜的性能和参数也会产生影响。
荧光显微镜的分辨率、亮度、对比度等参数会影响染色结果的清晰度和准确性，因此需要保证荧光显微镜的性能和参数处于最佳状态。
免疫荧光染色的质量受多方面因素的影响，包括抗体的选择、样品的处理、染色试剂的质量、染色条件的控制以及荧光显微镜的性能和参数等。
免疫荧光标记为什么不能直接标记一抗而标记二抗
一抗只识别一种底物，如果每种一抗都需要荧光标记，那这样成本很高。
而二抗既可以和一
抗结合，又带有可以被检测出的标记（如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是
检测一抗，提高了通用性。
一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体，即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。
一抗二抗都是一种可以特异结合别的物质的基团，而且一抗可以至少结合两种其他基团（底
物和二抗）。
特点是：
特异性强、敏感性高、速度快。
主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的
客观性不足，技术程序也还比较复杂。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。
与放射免疫法相比，荧光
免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。
国外生产的TDM用试剂盒，有相当
一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。
由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。
新发展了
几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
细胞免疫荧光步骤[1](干货分享)
](https://img.taocdn.com/s3/m/ba3d4b9c336c1eb91b375d28.png)
细胞免疫荧光步骤方法一:1.首先需要把细胞养在玻璃片上(悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片)2.然后在4％PＦA里面室温下固定30分钟，ＰBＳ洗两次，0.1％TX—100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记,需要在一个大的容器（面积大,扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的pａrａfilm,在上面滴上稀释在1％ＢSＡ/TＢＳ中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片３0ul 足够,把玻璃片盖在上面（细胞面朝下）,室温下孵育３0分钟，然后在PBＳ里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上ｍounting medium(大约每个玻璃片加10uｌ)，把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WＢ检测一下你的抗体,看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rａbｂiｔ和rａt的抗体,二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是ｄonｋｅy ａｎtｉ—rabbiｔ－FITC（绿）和doｎkey anti-ｒat-Ｔｅx－Red（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育.抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致,我用的是1０％的正常donｋey血清.5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作.方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片,还有直接在2４welｌ/12well/９6wｅll中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
免疫荧光 双标
免疫荧光步骤（双标）1.冰冻切片制备将脱水后的脊髓标本放于冰冻托盘上，加OCT使组织被完全包埋，置于冰冻切片机中，调节箱体温度为-22℃，冷冻头温度为-23℃。
观察OCT冻成白色固态状时，将其放置于冷冻头，准备切片。
设置切片厚度为8µm，必要时用刷子辅助将切好的OCT薄片贴附于载玻片上。
室温下晾干载玻片后保存于-20℃冰箱。
2.免疫荧光染色（1）室温下晾干切片15min，待完全晾干后放置于湿盒内，PBS冲洗浸泡5min/次，3次（以除去OGT）。
（2）抗原修复液(1X)（双蒸水稀释），95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内)。
20-30分钟内冷却至室温。
PBS冲洗5min/次，3次。
（3）用滤纸吸干玻片上残余PBS，用免疫组化笔在标本周围画一适当大小圆圈，避免接触标本，将配置好的封闭液（5%驴血清=920ulPBS+50ul驴血清+30ul 10%trition）加入圆圈内，室温下封闭1h。
（4）用滤纸吸去封闭液，向标本加入相应一抗：（1%BSA）兔源一标：兔抗IL-33（1：50）小鼠源二标：小鼠抗NeuN（1：500，神经元）小鼠抗GFAP（1：300，星形胶质细胞）小鼠抗OX42（1：100，小胶质细胞）小鼠抗OLIG2（1: 25，少突胶质细胞）一抗于4℃静置过夜孵育。
（5）次日，PBS洗去一抗，10min/次，3次，用滤纸吸干PBS，之后操作均需避光，向标本加入相应二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG（1：300），Dylight 594标记驴抗小鼠IgG（1：300），二抗室温静置避光孵育2h。
（6）PBS清洗二抗，10min/次，3次，清洗后晾干后滴加DAPI封片，加盖玻片后于荧光显微镜下拍摄图片并保存。
计划：1.IL-33组：1）IL-33/NeuN X2个配比浓度2）IL-33/GFAP X23）IL-33/Iba-1 X24）只孵二抗X22.Sham组：1）IL-33/NeuN X12）IL-33/GFAP X13）IL-33/Iba-1 X14）只孵二抗需要购买：Triton-100，驴血清，一抗：小鼠抗RBFOX3/ NeuN、小鼠抗GFAP、小鼠抗OX42，二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG，BSA(牛血清白蛋白)注意：1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤如下：
1.细胞培养：在无菌条件下，将细胞种植在适宜的培养基中，进行细胞培
养。
2.固定：在适宜的时机，弃去培养基，用冷的PBS清洗两次，然后使用适当
的固定剂（如4%多聚甲醛）进行固定。
3.透膜处理：在固定后的细胞中加入0.1% Triton X-100的PBS进行透膜处
理，以使荧光染料能够进入细胞。
4.抗体孵育：根据实验需求，选择适当的特异性抗体，加入细胞中，室温孵
育一定时间，使抗体与细胞内的目标蛋白结合。
5.洗涤：在抗体孵育后，用PBS洗涤细胞，以去除未结合的抗体和其他杂
质。
6.荧光标记：选择适当的荧光染料标记二抗，加入细胞中，室温孵育一定时
间，使二抗与结合的特异性抗体结合。
7.洗涤：再次用PBS洗涤细胞，以去除未结合的荧光染料和其他杂质。
8.观察：在荧光显微镜下观察染色后的细胞，观察目标蛋白的分布和定位情
况。
请注意，具体的实验步骤可能因不同的实验需求和条件而有所差异。
在进行实验前，建议仔细阅读相关文献和实验指南，以确保实验的准确性和可行性。
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荧光标记二抗的选择
荧光标记二抗的选择-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA
一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP)，荧光基团(FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine)和生物素。
选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。
对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术)中通常使用荧光标记的二抗。
如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。
其
中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种：
【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】
FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的
荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。
FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
然而FITC的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。
【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】
这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发射波长(570, 590, 620nm)。
尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。
在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因
为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。
氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。
因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞
仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白(PE)耦联基团要比罗丹明好。
TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。
最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。
因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。
【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】
Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。
Cy2和FITC使用相同的滤波片。
由于Cy2比FITC在光下更稳定。
要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在
染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。
Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。
Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。
因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。
Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。
Cy3可以和荧光素一起作双标。
Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。
Cy5耦联基团的激
发波长最大650nm，发光波长最大670nm。
在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。
Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。
由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。
通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。
在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。
使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。
【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】
存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转
化成能量，供其发育生长。
当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长
的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。
藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。
藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。
【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】
耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。
对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。
由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。
AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。
由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。
AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。
且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。
如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。
注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。
另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。
例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。
如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。