离子交换树脂层析分离混合氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸【目的要求】1．学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理；2．掌握离子交换柱层析的基本操作；3．掌握氨基酸和茚三酮显色机理。
【实验原理】一、离子交换层析原理离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。
有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如错误！未找到引用源。
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等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应，如：或这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。
功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。
可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。
因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。
其中使用的最普遍的是离子交换树脂。
由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即可被分离。
带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各自所带电量不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。
离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。
氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值。
在pH5.3条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。
在pH12条件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。
学习指南5 离子交换柱层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸——学习指南l 学习重点 1. 学习离子交换柱层析技术的基本原理和操作。
2. 掌握根据分离对象的性质差异进行实验条件的选择和设计。
l 知识要点1. 树脂：惰性的不溶高分子化合物。
根据树脂修饰的功能基团的性质差异，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
阳离子交换树脂：功能基团是酸性的，其可解离的H ＋离子可与溶液相中的其它阳离子发生交换作用。
阴离子交换树脂：功能基团是碱性的，其可解离的OH －离子可与溶液相中的其它阴离子发生交换作用。
2. 离子交换柱层析法分离氨基酸：不同氨基酸的等电点不同，在同一缓冲液中，不同氨基酸所带电荷的性质和数量具有差异，与离子交换树脂的亲和力不同。
因此，不同的氨基酸会在洗脱的过程中先后流出层析柱，达到分离的目的。
3. 茚三酮法：在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应生成紫蓝色化合物（脯氨酸、羟脯氨酸反应生成黄色化合物），最大检测波长在570nm 处。
l 试剂 1. 阳离子交换树脂（Amberlite IR-120）。
2. 0.45mol/L pH5.3柠檬酸缓冲液。
3. 氨基酸样品：0.005mol/L 的Asp 和Lys （用0.02mol/L HCl 配制）。
4. 0.5%茚三酮溶液。
5. 0.1% CuSO 4溶液。
l 仪器层析柱、层析柱支架台、螺旋夹、恒流泵、旋涡混合仪、电磁炉、电磁炉锅、紫外可见分光光度计l 操作l 注意事项 1. 新鲜树脂通过预处理，可去除树脂生产过程中残留的溶剂、低聚物及少量的重金属离子等杂质。
2. 树脂预处理后的保存液与洗脱液不同，因此需预先平衡，以保证分离体系已经全部替换成洗脱液。
一般来说，需2~3倍柱床体积完成平衡。
3. 装柱时应注意液面不能低于树脂表面，加入树脂的速度不能太快，以免产生气泡。
4. 加样时应避免冲坏树脂表面，注意不能将样品全部加在某一局限部位。
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理主要是基于它们在不同条件下的溶解性、酸碱性和极性的差异。
以下是常用的氨基酸分离方法：
1. 薄层层析法：将氨基酸溶液均匀涂布在薄层层析板上，通过上机进行高效层析分离。
根据氨基酸在固定相和流动相中的相互作用力的不同，氨基酸在薄层上的迁移距离也不同，从而实现分离。
2. 离子交换色谱法：利用带电的树脂固定相对氨基酸进行分离。
树脂可以选择正离子交换树脂或阴离子交换树脂，根据氨基酸的酸碱性质进行选择。
溶液中的氨基酸通过与固定相发生离子交换，从而实现分离。
3. 气相色谱法：利用气相色谱仪将氨基酸蒸发后送入色谱柱进行分离。
根据氨基酸在固定相和载气中的分配系数不同，氨基酸在色谱柱中的保留时间也不同，从而实现分离。
4. 高效液相色谱法：利用高效液相色谱仪将氨基酸在流动相中进行分离。
根据氨基酸与固定相之间的亲疏水性差异，通过调节流动相组成及流速，实现氨基酸的分离。
综上所述，氨基酸的分离原理主要是利用它们在不同条件下的物理化学性质的差异，通过各种色谱方法实现分离。
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
离子交换层析分离氨基酸
离子交换层析分离氨基酸[目的]1．熟悉离子交换层析技术的基本原理和方法2．熟悉离子交换层析分离氨基酸的基本原理和操作[原理]氨基酸是两性电解质，不同的氨基酸有其特定的等电点，在溶液pH小于其pI值时带正电，大于其pI时带负电。
故在一定的pH条件下，各种氨基酸的带电情况不同，与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同。
因而得到分离。
本实验选用Dowex 50作为离子交换剂，它是含磺酸基团的强酸型阳离子交换剂，分离的样品为Asp、Gly、His三种氨基酸的混合液，这三种氨基酸分别属于酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸，它们在pH4.2的缓冲液中分别带负电荷和不同量的正电荷，与Dowex 50的磺酸基团之间的亲和力不同，因此被洗脱下来的顺序亦不同，可以将三种不同的氨基酸分离开来，将各收集管分别用茚三酮显色鉴定。
[操作]1．装柱前准备：用流水冲洗层析柱、然后用蒸馏水冲洗，柱流水口装上橡皮管放入2-3ml蒸馏水，按压橡皮管内气泡，抬高流出管防止蒸馏水排空。
2．装柱：将处理好的Dowex 50悬液小心倒入层析柱内，待Dowex 50自然下沉至柱下部时，打开下端放出液体，再慢慢加入悬液至Dowex 50沉积面离层析柱上缘约3cm 时停止。
装柱时注意防止液面低于交换树脂平面以及气泡的产生。
3．平衡：用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液反复加在柱床上面，平衡10分钟，最后接通蠕动泵，调节流速1ml/min。
4．加样：柱内缓冲液的液面与树脂平面相平，但勿使树脂露出液面，马上用滴管加7滴样品在树脂平面上（注意不能使树脂平面破坏），然后加少量缓冲液使样品进入柱内，反复两次，当样品完全进入树脂床后，接通蠕动泵，用PH4.2的柠檬酸钠缓冲液洗脱，分步收集器收集。
5.收集与检测：取12支试管编号，每管加入茚三酮显色液20滴，依次收集洗脱液每管2m1，混匀，置沸水浴15分钟取出，观色，用自来水冷却后在波长570mm处比色、当收集至第二洗脱峰刚出现时，(茚三酮显色)即换用0.1N NaOH溶液洗脱直至第三洗脱峰出现后，停止洗脱。
离子交换层析法分离氨基酸
3.平衡、加样
用pH5.8的柠檬酸缓冲液冲洗平衡交换柱。调节流速为 1mL/min，流出液达到床体积的2-3倍时即可上样。 由柱上端仔细加入氨基酸的混合液0.5mL，同时开始收集流 出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入0.5mL柠檬酸 缓冲液冲洗加样品处。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入 0.5mL缓冲液。如此重复两次，
各种氨基酸分子的等电点不同在同一ph时所带电荷不同与离子交换树脂的结合力有差异因此可依据结合力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来达到分离的效果
实验三 离子交换层析法分离氨基酸
【实验目的】
（1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。 （2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。
【实验原理】
离子交换层析法主要是利用溶液中各种来自电离子与离子交苯乙烯磺酸钠型树脂（强酸1×8，100—200目）。 2mol/L盐酸溶液；2mol/L氢氧化钠溶液。 混合氨基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸溶液。 柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液（pH5.8，钠离子浓 度0.45mol/L） 显色剂（茚三酮溶液）
12cm×1cm层析管; 蠕动泵; 部分收集器；烘箱。
【实验步骤】 1.树脂的处理 ：碱-酸-碱
H+或Na+
SO3—
—CH2—CH2—CH—CH2—CH2—CH—
有氢型和钠型
—CH —CH2—CH2—CH— 苯环—SO3— H+或Na+
从交换剂上洗脱目的物的方法有两种： 1.调节洗脱液的pH，使目的物在此pH下 失去电荷甚至带相反电荷。
2.用高浓度的同性离子，将目的离子取代 下来。
【试剂和器材】
4.洗脱
并将柱与蠕动泵想和部分收集器相连。开始用试管收集洗脱液， 每管收集1mL，共收集40—50管。
离子交换柱交换层析法分离氨基酸知识讲解
离子交换柱交换层析法分离氨基酸离子交换柱层析法分离氨基酸一、实验原理离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的分离技术。
离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。
树脂（惰性支持物）上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合，改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。
由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。
从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出，达到分离的目的。
带电荷量少，与交换剂亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量大，与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。
本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂，分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。
在一定的pH下，Asp和Lys的带电情况不同，与磺酸集团的亲和力不同，因此被洗脱下来的次序不一样。
将各收集管分别用茚三酮显色后，测定吸光度，从而得到洗脱曲线。
二、实验器材实验仪器：层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂：Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液（pH5.3）、0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品（0.005mol/L的Asp和Lys，用0.02mol/L的HCl配制）三、实验操作记录1、树脂的处理干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。
再用1mol/L NaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。
2、装柱前的准备选择直径1cm，长度15~20cm的层析柱，观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。
将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1cm高）的洗脱液，打开出水口，排净管内空气后关闭出水口。
阳离子交换树脂
应用注意事项
1、贮存运输 ①应贮存在密封容器内，避免受冷或爆晒。 ②贮存温度：4℃—40℃之间。 ③树脂贮存期为2年，超过2年复检合格方可使
用。若发现树脂失水，不能直接向树脂中加水， 应先加入适量浓食盐水，使树脂恢复湿润。
④运输贮存中应保护好标记，以免与外界树脂 混淆。
⑤应防止包装物挤破，不能野蛮装卸。
（6) 搅拌速度
加大搅拌速度可以减小膜厚度，从而提高扩散速度。 但搅拌速度达一定值以后，交换反应速度便不再上升。 液膜扩散速度随水流速增加而增大 。
（7)交换离子的性质
主要是离子的价态和水化离子的大小。在树脂内扩 散的离子是由于树脂的固定的离子库仑力的吸引而扩 散进入的，故离子价态越高，吸引力越大，扩散速度 越快。水化离子越大，则越难扩散。
3 通液
溶液准备好（包括温度控制）之后，便可 进行通液交换操作。通液的目的可以是吸附、 洗涤、洗脱、再生等等。无论那种操作，速度 控制十分重要的。流速可以通过计量泵、阀、 流量计、液位差等手段调节。小型实验中的简 单装置，可通过收集量和滴数等方法控制。
实验室常用线流速表示速度，单位为Ml /(cm2.min).， 即每分钟单位柱截面上通过的溶液的毫升数。
内部铁污染可用 10％的 HCl 泡 5－12 小时，或配用 其它络合剂协同复苏处理。 ③有机物污染
有机物分解产物含带负电荷的基团，能与阴树脂带正 电的固定基团发生电性复合作用，紧紧地吸附在交换位 置上。
对策：10％NaCl＋2％的 NaOH，加热至 40－50℃， 用量为 1－3 倍树脂床。
离子交换的选择性、可逆性
? 最常用的法则是依据树脂功能基的类别。
依据树脂功能基分类
分為強酸型、中強酸型和弱酸型三類
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实验二离子交换树脂层析分离混合氨基酸【实验目的】1. 了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术。
2. 学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。
【实验原理】离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。
高聚物分子由能电离的性基团及非极性的树脂组成。
极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。
通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、强碱(＝N+＝R：)和弱碱(＝NH2＝NHR＝NR2)。
离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。
但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。
故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。
在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH 或离子强度可分别洗脱分离。
【实验材料】1．实验器材层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(Dowex 50)2．实验试剂(1)2mol／L HCl(2)2mol／L NaOH(3)0.1mOl／L HCl(4)0.1mol／L NaOH(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml(6)pH5的醋酸缓冲液：0.2mol／L NaAc 70ml加0.2mol／L HAc 30ml(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮(8)氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10m1加0.1mol／L HCl 3m【实验方法】1. 树脂的处理100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml 12mo1／L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。
加25ml 12mol／L NaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。
将树脂悬浮于50ml pH4.2柠檬酸缓冲液中备用。
2. 装柱取直径0.8cm～1.2cm、长度10cm～12cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，在加入一些树脂，至树脂沉积至8cm～10cm高度即可。
于柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH为4.2为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。
3. 加样、洗脱及洗脱液收集打开山口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。
用长滴管将15滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。
当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol／L HCl 3ml，以10滴／min～12滴／min的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。
当HCl液面刚平树脂表面时，用1m1 pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2ml pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10滴／min～12滴／min 并注意勿使树脂表面干燥。
在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。
显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。
在用pH4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部剩余的pH4.2柠檬酸缓冲液移去。
于树脂顶部加入2ml 0.1mo1／L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面I续用0.1mo1／L NaOH洗脱并逐管收集(注意仍然保持流速10滴／min～12滴／min)，每管20滴。
做洗脱液中氨基酸检验，在第三个氨基酸用0.1mo1／L NaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。
最后以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以-，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。
【注意事项】1. 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。
2. 一直保持流速10滴/min～12滴／min，并注意勿使树脂表面干燥。
【思考题】1. 为什么混合氨基酸从磺酸阳离子交换树脂上逐个洗脱下来?2. 树脂如何保存?Experiment 13 Separating Mixed Amino Acids by Ion – ExchangeChromatography【Purpose】1. Know the principle and operating techniques of ion - exchange - resin chromatography.2. Learn to use ion- exchange- resin chromatography to separate the mixed amino acids.【Principle】Ion - exchange resin is a kind of synthetic polymer. It can’t be soluble in water, but can expand by absorbing water to dilate. Polymer molecule consists of polar groups that can ionize and nonpolar resin. The ions on the polar groups can be exchanged with the ion in the solution, but the physical property of the nonpolar resin will not change. Usually the groups that carried by ion- exchange resin can be divided into strong acid (＝R＝SO3H ), weak acid (＝COOH ), strong base (＝N+＝R3 ) weak base (＝NH2＝NHR=NR2 ).It’s relatively ideal to use ion - exchange - resin to separate small molecules such as amino acid, adenosine, and adenylate and so on. But it’s not proper for macro-molecule substance like protein, because it can’t diffuse into the chain structure of resin. So we can choose ion- exchange reagent that takes polysaccharide such as cellulose and dextran as the supporter to separate biological macromolecules.This experiment uses sulfonic acid cation - exchange resin to separate the mixture of acidic amino acid (aspartic acid), neutral amino acid (alanine) and basic amino acid (lysine). In the condition of certain pH, the degree of their dissociation is different, so they can be respectively eluted and separated by changing the pH and the ion strength of eluting solution.【Materials】1. Apparatus:(1)Column（16/20）(2)Pump(3)Gradient maker(4)Ultraviolet meters(5)Sulfonic acid cation- exchange- resin (Dowex 50)2．Reagents:(1)Hydrogen chloride (2mol/L)(2)Sodium hydroxide (2mol/L)(3)Hydrogen chloride (0.1 mol/L)(4)Sodium hydroxide (0. 1mol/L)(5)Citric acid buffer (pH4.2): 54ml of 0.1mol/L Citric acid and 46ml of 0.1mol/L sodium citrate(6)Acetate acid buffer (pH5): 70mi of 0.2mol/L sodium acetate and 30ml 0.2mol/L acetate acid(7)Neutral triketohydrindene hydrate solution (0.2%): 0.2g of triketohydrindene hydrateand 100ml of acetone(8)Mixture of amino acids: 10ml of each of alanine, aspartic acid, lysine and 3ml of 0.lmol/L hydrogen chloride【Procedures】1. The disposal of resin:Put about 10g of resin in a 100ml beaker, add 25 of 12mol/L hydrogen chloride, and stir them for 2 hours. Eliminate the acid liquor, and wash the resin completely to neutral with distilled water. Add 25ml of 12mol/L sodium hydroxide to the above resin and stir for 2 hours. Eliminate the basic liquor, and wash it to neutral with distilled water. Suspense the resin in 50ml, pH4.2 sodium citric acid buffer, and keep it for use.2. Packing:Take a chromatography column with the diameter of 0.8 cm～1.2cm and the length of 10 cm～12cm, put a piece of glass cotton or sponge circular cushion at the bottom, and pour the above prepared resin from the top. Close the exit of chromatography column. When the resin sediment appears, let out the excessive solution, add more resin until the height of the resin sediment is about 8 cm～10cm. Add pH4.2 citric buffer from the top to wash it until the flowing liquor reaches pH4.2. Close the exit of the column, and keep the level of the liquor surface about 1cm higher than that of the resin.3. Loading, elution and collection of eluent:Open the exit to make the buffer flow out. When the level of the liquor is at almost the same height with that of resin, close the exit (don’t make the surface of resin dry). Use a long dropper to add 15 drops of mixture of amino acid to the top of resin directly and carefully, and open the exit to make it flow into the column slowly. When the level of the liquor is just at the same height as that of resin, add 3ml of 0.lmol/L hydrogen chloride, and elute it at the flowing rate of 10drops/minute～12drops /minute. Collect the eluent, 20 drops per tube and collect it one by one. When the level of hydrogen chloride solution is just at the same height as that of resin, use lml of pH4.2 citric acid buffer to wash the column wall once, then elute with 2ml of pH4.2 citric acid buffer. Keep the flowing rate at 10 drops/minute～12 drops/minute. Pay attention not to make the surface of resin dry.While collecting the eluent, check the amino acid in the eluent with triketohydrindene hydrate tube by tube. The process is: Add 10 drops of pH5 acetate acid buffer and 10 drops of neutral triketohydrindene hydrate solution into every tube of eluent. Heat for 10 minutes in the boiling water bath. The solution showing royal blue means some amino acid has been eluted out. The degree of the color can show the concentration of amino acid, and it can be determined by color matching.After eluting out the second amino acid with pH4.2 critic acid buffer, collect two tubes of the negative parts of the action of triketohydrindene hydrate. Close the exit of chromatography column, and transfer the pH4.2 critic acid buffer left on the top of the resin.Add 2ml of 0.1mol/L sodium hydroxide from the top of the resin, open the exit to make it flow into the column slowly. Elute with 0.lmol/L sodium hydroxide according to the above operation, and collect it tube by tube (caution to keep the flowing rate of 10 drops/minute~12 drops/minute) by 20 drops per tube. Check up the amino acid in the eluent. After the third amino acid has been eluted out by 0.lmol/L sodium hydroxide, keep on collecting two tubes of thenegative parts of the action of triketohydrindene hydrate.Finally, take the optical density of every tube of eluent (take water as blank and at the wavelength of 570nm) or the degree of color (expressed with "-, +, +, ++ …...") as ordinate, and the tube number of eluent as abscissa, then draw an elution curve.【Attentions】1. Be sure not to emit the bubbles, tier and don’t let the level of the liquor in the column be lower than that of the resin when packing.2. Keep the flowing rate at 10 drops/minute ~ 12 drops/minute, and pay attention not to make the surface of the resin dry.【Advisements after experiment】1. Why can the mixed amino acids be eluted from the sulfonic acid cation - exchange resin one by one?2. How to preserve the resin?。