小鼠单抗腹水纯化步骤
单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化一、腹水型单抗的纯化在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。
常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。
1、二氧化硅吸附法新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。
2、过滤离心法用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。
3、混合法即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。
二、单抗的粗提1、硫酸铵沉淀法（1）饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。
临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。
（2）盐析吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。
（3）脱盐常用柱层析或透析法。
柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。
第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。
透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。
通过小鼠腹水如何大量制备单克隆抗体
教学中产生的问题：单克隆抗体的制备过程中，大家都关注了筛选过程，往往没有关注制备的两条途径，其中之一，细胞培养的途径许多学生能理解，而腹水生产的途径就不熟悉，教材中也没有介绍，而这对内环境的知识也是有帮助的。
单克隆抗体（monoclonal
antibody，MAb），是针对专一的抗原决定簇产生的抗体。
单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，主要原理是利用产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
两种方法生产单克隆抗体：
目前大量制备单抗的方法主要有两种方法，一种是动物体内生产法（腹水制备），在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体；另一种是细胞体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
由于腹水中单克隆抗体的产生通常会导致内源性宿主蛋白的污染，因此细胞培养对于小规模和大规模单克隆抗体的生产至关重要。
重点问题解疑：如何通过腹水产生单克隆抗体？
杂交瘤细胞被注射到小鼠腹腔内，由于有组织液提供足够的营养，所以能够大量分裂。同时部分杂交瘤细胞分泌抗体，这些细胞和抗体导致腹腔组织液渗透压增高，血浆和淋巴就会渗出并潴留在腹腔内形成腹水。
腹水制备法的优点：
腹水制备法操作简单、制备成本低，是目前国内生产抗体的主要方式，但是，得到的腹水常混有小鼠的各种杂蛋白（包括免疫球蛋白Ig），而且还有污染动物病毒的危险。而体外培养法通过转代培养制备的细胞培养得到的抗体，不但不含小鼠杂蛋白和动物病毒，而且抗体易纯化，目前在国外抗体生产中非常流行。
杂交瘤腹水纯化方法
杂交瘤腹水纯化方法
腹水纯化是获得高纯度单克隆抗体的重要步骤。
以下是一种常见的杂交瘤腹水纯化方法：
1. 离心：将收集的腹水离心，去除细胞和固体杂质。
2. 过滤：使用0.22 微米的过滤器过滤腹水，以去除微小的颗粒和悬浮物。
3. 亲和层析：使用针对单克隆抗体的亲和层析柱进行纯化。
将腹水加载到层析柱上，使抗体与层析柱上的配体结合，而其他杂质则流过柱子。
4. 洗脱：使用适当的洗脱缓冲液将结合在层析柱上的单克隆抗体洗脱下来。
洗脱缓冲液可以是具有竞争结合能力的物质，或者是改变pH 值或离子强度来打破抗体与配体的结合。
5. 浓缩和透析：将洗脱下来的抗体溶液进行浓缩，可以使用超滤或透析的方法去除多余的盐分和缓冲液，同时调整抗体的浓度。
6. 保存：将纯化后的单克隆抗体保存于适当的条件下，如低温冰箱或加入防腐剂。
需要注意的是，腹水纯化的方法可能因实验需求和设备条件而有所不同。
在进行腹水纯化之前，建议参考相关的实验手册和文献，以选择适合的纯化方法，并确保操作的正确性和安全性。
实验四 腹水型单抗的制备及纯化
实验四腹水型单抗的制备及纯化迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首先BALB/c 小鼠。
本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。
可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有细胞及其残渣、小颗粒物质、脂肪滴以及小鼠的各种杂蛋白，因此在很多情况下要提纯后才能使用。
而腹水单抗的纯化是一个相当困难的工作，本实验将进行IgG1型腹水单抗的提纯方法。
材料：1、成年BALB/c小鼠。
2、灭菌液体石蜡或福氏不完全佐剂；处于对数生长期的杂交瘤细胞；新鲜采集的腹水（或冻存的腹水）。
3、饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，正辛酸，0.1M NaOH，1M NaOH，0.06M，pH4.0NaAc-HAc缓冲液，0.01M，pH7.4 PBS，10×PBS（0.01M，pH7.4）。
方法：一、腹水的制备1．取12周龄的BALB/ c小鼠腹腔注射灭菌石蜡，0.5ml/只或腹腔注射福氏不完全佐剂，0.2-0.3ml/只。
2．1周后（注射灭菌液体石蜡）或3天后（注射福氏不完全佐剂）腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1—3×106/0.3ml。
3．间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水。
将腹水离心（2000rpm离心5min），吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，将上清加入50﹪甘油冻存于－20℃冰箱，留下一小部分测定效价。
二、辛酸—硫酸铵法纯化腹水中的单抗1．取3ml腹水，2500r/min离心弃杂质，加入0.06M，pH4.0 NaAc-HAc缓冲液3ml，调pH 至4.8（用0.1M NaOH调）；2．加入99ul正辛酸（33ul/ml腹水），室温搅拌≥30min，4℃搅拌≥60min，逐滴加完，4℃澄清2h（20min）；3．取出15000r/min离心30min（10min）（4℃），去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白），上清加入1/10体积的10×PBS（0.01M，pH7.4），用1M NaOH调pH至7.2；4．上清滴加等量饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，使硫酸铵的饱和度为50％，继续搅拌10-30min，静置30min；5．10000rpm（4℃）离心30min（10min），弃上清，将沉淀溶于1.2ml，0.01M，pH7.4 PBS 中，6．0.01M，pH7.4 PBS透析过夜（4℃），其间换液3次，收集透析袋内液体，—20℃保存备用。
高效液相色谱两步法纯化小鼠腹水IgM单克隆抗体
高效液相色谱两步法纯化小鼠腹水IgM单克隆抗体
商澎;田方;陈镔复;金伯泉
【期刊名称】《单克隆抗体通讯》
【年(卷),期】1992(8)2
【摘要】随着单克隆抗体技术的普遍应用,IgM类单克隆抗体的液相色谱分离纯化方法越来越多。
由于IgM分子的特殊性而使得IgM的纯化较为困难,迄今还没有一种特别有效的方法。
除免疫亲和色谱外,IgM的色谱纯化方法多用强阴离子交换色谱柱Mono-Q结合凝胶过滤色谱的两步法;还有45％饱和度(NH_4)_2SO_4盐析后,使用常压凝胶过滤色谱和离子交换色谱纯化。
【总页数】3页(P69-71)
【关键词】液相色谱;单克隆抗体;纯化
【作者】商澎;田方;陈镔复;金伯泉
【作者单位】第四军医大学中心实验室;第四军医大学免疫学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R392－33
【相关文献】
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小鼠单克隆抗体的制备与纯化
小鼠单克隆抗体的制备与纯化关键词：细胞骨髓瘤细胞 B细胞培养基试剂标准物质北京标准物质网小鼠单克隆抗体的制备与纯化一般可分为细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选与单克隆化、单克隆抗体的生产与纯化等过程。
1.细胞融合动物免疫方法与抗血清制各相同。
为保证得到的B细胞有较强的分泌抗体活性，在融合前3天须进行一次静脉加强免疫。
融合时小鼠骨髓瘤细胞(如SP2／0-Ag14细胞株)要处于对数分裂期的良好生长状态，对在无菌条件下获得的小鼠脾脏B细胞需用无血清培养液洗2至3遍，以去除小鼠血清。
融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例一般为5：1至10：1，常用的融合剂为50%的聚乙二醇，完成融合后要用培养液缓慢稀释后离心，除去PEG，然后将细胞用HAT选择培养基(RPMI1640含10%～20％胎牛或小牛血清和HAT悬浮后接种于96孔板中。
正常情况下在融合后的第3、4天在光镜下即可看到克隆的生长，在第10天后可以进行筛选。
PEG虽融合效率较低，但方法简单，成本低廉，故较为常用。
电融合虽融合率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故较少使用。
在融合后的细胞培养过程中，可同时添加同种动物的腹腔细胞(即饲养细胞)，其中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片，有助于杂交瘤细胞的生长。
商品化的杂交瘤细胞生长因子，也可以促进杂交瘤细胞的生长。
2.阳性杂交瘤细胞的筛选与单克隆化杂交细胞经约10～14天培养后(此间要换培养液1～2次)可进行筛选，ELISA是最常用的筛选方法。
对获得的阳性克隆细胞要通过有限稀释法进行亚克隆，以保证抗体分泌细胞来源于单个细胞。
由于融合细胞的染色体容易发生丢失，故一般要通过数次亚克隆，直至来自同一克隆的所有亚克隆细胞均为反应阳性，表明该克隆的抗体编码基因已较稳定，可以扩大培养并建株。
3.单克隆抗体的扩大生产采用什么方法进行单克隆细胞株的扩大培养及抗体制备，取决于实际需要。
目前生产大量单克隆抗体的常用方法有小鼠腹水制备、大瓶培养和中空纤维反应器三种，前者多用于实验室制备，后二者适用于工厂化生产。
腹水的制备
这里还有一个获得腹水经验性步骤，不知道能否帮的了你1) 选用雌性Balb/c小鼠，小鼠一定要健康。
2) 腹腔注射0.5ml石蜡油/鼠，1-2周后（我一般选用注射10天后的小鼠，不过注射3-4周后的小鼠仍可用）腹腔注射细胞。
3) 打腹水时，细胞要处于对数生长期，细胞数量过多过少都不好，我一般是注射10^6/鼠，每株杂交瘤打3只。
4) 约7天后，触摸小鼠腹部有肿胀感时，即可用16号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心。
我每次可采集4-5ml 腹水/鼠，有时甚至可达6ml，隔天后再次采集，一般可采集三次左右，每只小鼠可采集十多ml腹水。
有时一只小鼠采到20多ml腹水后仍然活得很好（这也很烦）。
还有一点，采集用的针头要事先灭菌！小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同，有的注射后一周即死亡，有的会出现血性腹水，有的可以反复收取腹水2-3次。
我做过2种类别10株细胞的腹水，以下供参考：1、每组细胞准备2只小鼠，8-10周龄，最好与制备单抗的小鼠同系；接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂，可以用石蜡油（提前一周）或不完全弗氏佐剂（提前三天）；2、第一只接种细胞数可以控制在10的6次方，如果出现腹水少、死得快的现象，则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*10的5次方；注射细胞少腹水形成慢但效价会更高；3、待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况，如果活力佳，有明显移动性腹水，可以放腹水2次左右；一旦发现小鼠活动受限，要立即处死放腹水；4、一般每次可以收取2-3ml。
制备小鼠腹水细节剪刀剃毛，酒精消毒止血钳、镊子夹提腹部皮毛小号针头，越细越好，减少损伤eppendorf管或玻璃试管装均可，但要高压灭菌刺入针头时注意先提起腹部皮毛，在腹部中线旁刺入空隙，勿扎住内脏腹水采集分成两类：1：活着是抽取腹水2: 处死抽取腹水活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器（2-5ml）以及灭后菌的eppendorf管(因为腹水还要分离所以用这个最好，便于离心）。
小鼠腹水的纯化
小鼠腹水的纯化腹水制备：1、提前十天免疫，不完全佐剂0.5ml/只。
2、每只老鼠2*105个细胞/只。
试剂：醋酸盐配制：A：0.06mol/L NaAc 0.4926g，加水至100mlB：0.06mol/L HAc 0.344ml，加水至100mlA与B以59:41混合，调整溶液pH值4.8。
（经验值：NaAc 0.3g+HAc 0.14ml 加水至100ml）1、取腹水15000rpm，30离心弃沉淀，取上清。
2、辛酸-硫酸铵沉淀（加下述各种试剂都要在搅拌下缓和逐滴加入NaOH、HCl、硫酸铵）1）取5ml 腹水加2倍（即10ml）醋酸盐缓冲液中，用1M HCl 300μl调pH值至4.8。
（例：32.5ml腹水+HAC buffer 65ml+1.5ml-4M HCl）2）加入165μl辛酸（即11×（5+10））的比例（11:1）体积，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4℃静置2h，取出15000rpm离心30min，弃沉淀。
3）定性滤纸过滤4）上清中加入1/10V的PBS（大约1.5ml），用1N NaOH（400-800μl）调pH至7.2。
4℃条件下（冰上）加入饱和硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%（即15ml）搅拌30min，静置1h，10000rpm离心30min后弃上清。
5）沉淀用PBS（10-15ml）溶解，重复4步操作（不加NaOH）。
例：一般加入22mlPBS 溶解，再加18ml饱和硫酸铵，即终浓度为45%。
6）沉淀用（2ml）PBS溶解，4℃透析过夜（PBS），次日离心后对上清测定OD280后，加NaN3（1-5‰）。
后续可制备抗体亲和柱（详见英文protocol）测定蛋白浓度：将透析后的溶液离心后取上清，做10倍（或20倍）稀释，以所用的PBS透析液为空白和稀释液。
测定OD280（不可信区间：OD＞2；或OD＜0.05）遇到不可信区间应选择继续稀释测定或测定原液。
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小鼠单抗腹水纯化
一、初纯——辛酸—硫酸铵法
【原理】
在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】
1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml
取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.
0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）
2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml
取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.
0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）
0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）
3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml
称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.
【步骤】
1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
4、12000r/min，4℃，30min，收集上清。
5、上清液经普通滤纸过滤1次，加入1/10体积的10*PBS（0.1M pH7.4）用1M NaOH 调至7.4，冰浴至4℃。
6、根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵（0℃条件下，45%饱和硫酸铵为0.291g/ml），冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，不可一次全部加入，而以小分量分多次慢慢溶入，并不时搅拌，以免造成局部浓度过高。
缓慢加入时为了避免局部的浓度一下子很高，因为硫酸铵不同的浓度是沉淀不同的蛋白为主，这样就可能将不想沉淀的蛋白沉淀下来。
冰浴条件是为了保证蛋白的活性，因为硫酸铵加入到辛酸溶液后会产热。
7、硫酸铵全加入后，再搅拌10-30min，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心。
一般采取4℃搅拌30min后，继续静置至少60min（一般过夜）。
再13000r/min，4℃离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。
但如果进行下面的亲和层析，可直接将沉淀溶解于1.5ml结合缓冲液中。
二、亲和层析
【HiTrap Protein AG HP 1ml（Amersham Bioscience）特性】
柱床体积：1ml
柱子大小：0.7*2.5cm
耐受压：0.3mPa
最大流速：4ml/min
建议流速：1ml/min
【protein G】
G组链球菌的表面蛋白，属于III型Fc受体，能以非免疫机制的方式结合IgG Fc区域。
protein G和IgG在pH7.0时有很强的结合能力，而其结合产物的洗脱一般在pH2.5-3是进行。
由于IgG对段敏感，会破坏其生物学活性，故一般在收集管种种加入60-200μl的1M Tris-HCl （pH9.0），一般用100μl/ml洗脱液，这样纯化的IgG最终会中和成中性。
注意：经pH洗脱后在收集管内欲置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
小鼠IgG单克隆抗体溶液在280nm时。
1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。
【缓冲液准备】
1、结合缓冲液：20mM sodium phosphate。
pH7.0 定容至1000ml
称取7.6024g Na3PO4·2H2O（MW380.12），定容置1000ml，调pH至7.0.
2、洗脱缓冲液：0.1M Glycine-HCl，pH2.7 1000ml
称取7.507g Glycine（MW75.07），定容至1000ml，调pH至2.7.
【样品准备】
样品最好用结合缓冲液稀释，上柱前样品过滤（0.22μm滤膜）或离心。
【操作步骤】
1、在收集管中加入100μl的1 MTris-HCl（pH9.0），用于收集1ml的洗脱液。
2、将注射器或泵管充满结合缓冲液。
移去柱子上接口的塞子，用适配的接头子将其连接到注射器或者泵管，一“滴对滴“的方式充满柱子后方可以连接，避免空气进入主子。
3、移去柱子下接口的塞子，扭断即可。
4、用10ml（10个柱床体积）结合缓冲液洗柱子，流速为1ml/min
5、上样：用2ml上样环上样。
6、用5-10ml（5-10个柱床体积）结合缓冲液冲洗柱子，直到流出液中没有杂物质。
7、用2-5ml（5-10个柱床体积）洗脱液进行洗脱。
8、纯化产物可以利用Hi Trap Desalting 或PD-10柱交换缓冲液。
9、纯化结束后，用20%乙醇保存柱子，防止微生物的生长。
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