腹水抗体制备一般流程

合集下载

细胞冻存复苏及腹水制备-LM

2013-5-23
三，贴壁细胞的消化：
1，吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。 2，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。 3，显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打
下来，此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的培养液终止胰酶（竞争
抑制），吹打下细胞，即可直接用于后续实验。 4，如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。
5，如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接
从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来， 1000-2000r离心1min，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完
的首选方法，一般用于生产科研或诊断用的单克隆抗体。
三，腹水产生的原因：
1，杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，大量肿瘤细胞在腹腔
中生长，分泌很多刺激性的因子，胶体渗透压升高，导致腹水产生。 2，杂交瘤细胞的生长对腹膜是个刺激，引起炎症反应导致腹膜上的毛细血管通透性增加，体液漏出，形成腹水。
四，液体石蜡的作用：
1，饲养细胞有污染却没有发现。 2，细胞在水浴锅中时间过长或水进入冻存管。 3，操作过程存在污染。 4，没有更换枪头，导致交叉污染。 5，没有记录细胞的名称及其编号或者有重号现象。
四，细胞复苏的注意事项：
1，所用器材经过高压处理，培养基和血清是新的。
2，整个过程保证无菌操作。
3，复苏的关键是速融，一般在1min内。
接种小鼠腹腔抽取腹水
腹水纯化标记
单抗鉴定
项目组进行评价
我们主要制备的腹水有三类：

单抗腹水制备过程中遇到的问题及对策

单抗腹水制备过程中遇到的问题及对策
1，腹水少或者无腹水产生
①致敏不正确，不正确的使用致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久，一般是7-14天，具体看小鼠的腹部情况。

②杂交瘤细胞或者致敏剂的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。

③接种的杂交瘤细胞数量太少，太多或者细胞状态不好。

一般不50万个细胞左右为宜。

④建议使用母鼠或者生育过的母鼠制备腹水。

2，腹水没有效价
①制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。

②致敏小鼠时采用了错误的致敏剂。

③接种的杂交瘤细胞数量太少，或者细胞状态不好。

④由于注射方式和部位错误，形成了实体瘤。

杂交瘤腹水纯化方法

杂交瘤腹水纯化方法
腹水纯化是获得高纯度单克隆抗体的重要步骤。

以下是一种常见的杂交瘤腹水纯化方法：
1. 离心：将收集的腹水离心，去除细胞和固体杂质。

2. 过滤：使用0.22 微米的过滤器过滤腹水，以去除微小的颗粒和悬浮物。

3. 亲和层析：使用针对单克隆抗体的亲和层析柱进行纯化。

将腹水加载到层析柱上，使抗体与层析柱上的配体结合，而其他杂质则流过柱子。

4. 洗脱：使用适当的洗脱缓冲液将结合在层析柱上的单克隆抗体洗脱下来。

洗脱缓冲液可以是具有竞争结合能力的物质，或者是改变pH 值或离子强度来打破抗体与配体的结合。

5. 浓缩和透析：将洗脱下来的抗体溶液进行浓缩，可以使用超滤或透析的方法去除多余的盐分和缓冲液，同时调整抗体的浓度。

6. 保存：将纯化后的单克隆抗体保存于适当的条件下，如低温冰箱或加入防腐剂。

需要注意的是，腹水纯化的方法可能因实验需求和设备条件而有所不同。

在进行腹水纯化之前，建议参考相关的实验手册和文献，以选择适合的纯化方法，并确保操作的正确性和安全性。

腹水的制备

这里还有一个获得腹水经验性步骤，不知道能否帮的了你1) 选用雌性Balb/c小鼠，小鼠一定要健康。

2) 腹腔注射0.5ml石蜡油/鼠，1-2周后（我一般选用注射10天后的小鼠，不过注射3-4周后的小鼠仍可用）腹腔注射细胞。

3) 打腹水时，细胞要处于对数生长期，细胞数量过多过少都不好，我一般是注射10^6/鼠，每株杂交瘤打3只。

4) 约7天后，触摸小鼠腹部有肿胀感时，即可用16号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心。

我每次可采集4-5ml 腹水/鼠，有时甚至可达6ml，隔天后再次采集，一般可采集三次左右，每只小鼠可采集十多ml腹水。

有时一只小鼠采到20多ml腹水后仍然活得很好（这也很烦）。

还有一点，采集用的针头要事先灭菌！小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同，有的注射后一周即死亡，有的会出现血性腹水，有的可以反复收取腹水2-3次。

我做过2种类别10株细胞的腹水，以下供参考：1、每组细胞准备2只小鼠，8-10周龄，最好与制备单抗的小鼠同系；接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂，可以用石蜡油（提前一周）或不完全弗氏佐剂（提前三天）；2、第一只接种细胞数可以控制在10的6次方，如果出现腹水少、死得快的现象，则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*10的5次方；注射细胞少腹水形成慢但效价会更高；3、待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况，如果活力佳，有明显移动性腹水，可以放腹水2次左右；一旦发现小鼠活动受限，要立即处死放腹水；4、一般每次可以收取2-3ml。

制备小鼠腹水细节剪刀剃毛，酒精消毒止血钳、镊子夹提腹部皮毛小号针头，越细越好，减少损伤eppendorf管或玻璃试管装均可，但要高压灭菌刺入针头时注意先提起腹部皮毛，在腹部中线旁刺入空隙，勿扎住内脏腹水采集分成两类：1：活着是抽取腹水2: 处死抽取腹水活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器（2-5ml）以及灭后菌的eppendorf管(因为腹水还要分离所以用这个最好，便于离心）。

制备分泌单克隆抗体杂交瘤细胞小鼠腹水的方法

2007年6月第45卷第5期制备分泌单克隆抗体杂交瘤细胞小鼠腹水的方法孙广瑞李小兵王哲吉林大学长春130062?论著?摘要探讨利用从小鼠腹水中分离获得的分泌单克隆抗体杂交瘤细胞大量制备含有小鼠单克隆抗体腹水的方法
维普资讯
２０年６月第４卷第５＿０７５期＿－ ——
［关键词］抗体；单克隆抗来自；腹水；鼠小【图分类号】Ｒ９【献标识码】Ａ【章编号】１７ — ７１Ｏ７０ — ３０中３２文文６３９０（０）５０ — ２２
ＴｈｅＭｅｈｆＰｒｐａｅｉｅＡｓｉｅｔ－ｂｒｄｍａＣｅｌＷｈｉｈＳｅｅｉｔｏｄｏｅｒｄＭｃｅｔｓｗｉｈＩｙｉｏＩｌｃｅｒｔｎｇＭｏｅｏｌＡｎｔｂｏｙＳｐｒｔｄｆｏｉｅＡｓｉｅｎｏｌｎａｉｄｅａａｅｒｍＭｃｅｔｓ
ａｌｔｆａｂｍｉｅａｅ￣ｓＡｓｉｓｆｃｏｕａｅｉａｂｈｂｏｅｓｒｏｅｔｄａｄｔｅＭｃｙｆｏｅｌｒｏａｅｙｏｏＭｃｃｓｉ．ｅｔｅｉｅｌｔｄｗｔＭｃｙ￣ｄｍａｅＵｅｅＵｅｅ。ｎａｂｈｂｄｍａｃｌｗｅｅｉｌｔｄｂｅｏｍｉｎｈｗｅｈｉｓｓ
３９ｍＬａｅｔｓｎａｅａｅＴｉｔｏｏｌｅｕｅｒｐｒｃｓｉｓｉｎｅｏａｎｉｏｙｗｈｃｔｆｉｈｔｅ．．７ｓｉｖｒｇ．ｈｓｅＯｍｅｈｄｃｕｄｂｓｄｔｐｅａｅｍｉｅａｅｔｔｍｏｏｌｎｌｔｄｉｈｉａｌｇｔｒｏｅｗｈａｂｓｏｏｈｉ

小鼠单抗腹水纯化步骤

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

一种制备单克隆腹水抗体的方法[发明专利]

专利名称：一种制备单克隆腹水抗体的方法专利类型：发明专利
发明人：李川江
申请号：CN201610327059.0
申请日：20160517
公开号：CN105925539A
公开日：
20160907
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种制备单克隆腹水抗体的方法，该方法为将远交系小鼠腹腔注射降脂烷后，接种骨髓瘤杂交瘤细胞，3~7天开始每天采集腹水；采集的腹水立即用离心机离心，放置4℃，次日取出再离心和用虑紙过滤，即可用硫酸氨沉淀、柱层析纯化，获得抗体。

本发明采用远交系小白鼠代替BALB/c小白鼠，用于制备单克隆腹水抗体，该品系小白鼠的优点是繁殖能力强，对饲养条件要求低，价格很便宜，仅为BALB/c小鼠的1/5左右；而且体型较大，对实验耐受性好，因此腹水产量大，是BALB/c小鼠的数倍，抗体效价不低于BALB/c小鼠，而且抗体对温度的稳定性远高于BALB/c 小鼠。

申请人：广东华银医药科技有限公司
地址：510663 广东省广州市经济技术开发区广州科学城揽月路80号广州科技创新大厦创新基地C 区第三层
国籍：CN
代理机构：广州嘉权专利商标事务所有限公司
更多信息请下载全文后查看。

小鼠单抗腹水纯化步骤

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

腹水抗体制备一般流程 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】
腹水抗体制备(实验室级别)
2012-8-27
一、实验原理：
将稳定分泌单抗的，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。

二、实验材料：
药品：血清培养基、液体石蜡、生理盐水
仪器：电热恒温水浴箱、CO2培养厢、超净工作台、低速自动平衡离心机
三、制备步骤：
1.打石蜡
在细胞培养前两周，取8周-10周的Balb/C小鼠，按每个细胞株注射3只，1ml/只，以促进小鼠肠道蠕动，进行分笼，写好标记，十天后准备注射细胞；
2.杂交瘤细胞复苏与扩大培养
(1)12孔细胞培养板，每孔中加入的细胞培养液约2ml。

(2)按冻存细胞的液氮罐位置，取出冻存的细胞管，在37℃水浴箱中搅动1min
左右，快速融化冷冻的杂交瘤细胞。

(3)将融化的细胞吸入5mL的细胞培养液中，尽量收集细胞，装入EP管，然后
平衡EP管，800rpm，8min，进行离心。

(4)将离心好的细胞上清液吸除，吸取3mL细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细
胞液吸出，按1ml/孔混匀到相应培养板孔中，显微镜下观察复苏后的细胞数量，生长形态和背景是否有污染及杂质，然后放入细胞培养厢中进行孵育。

3.杂交瘤细胞收集与注射
(1)待细胞处于对数生长期，即可收集。

吸取上清1ml后，吹打细胞，使贴壁
细胞脱落，然后收集到15ml离心管中，800rpm，8min离心，
(2)吸取离心上清液(冻存备用)，然后每管加入4ml生理盐水，混匀后，同样
条件再次离心，弃去上清液，每管再加人2-3ml生理盐水，混匀后吸入5ml 注射器，按约1ml-0.5ml/只，注射小鼠腹腔。

从注射后起一周后，每天注意观察小鼠腹腔隆起程度和小鼠生命状态，防止小鼠死亡。

4.腹水收集
(1)取经过免疫的腹部隆起的小鼠，颈部处死，用消毒酒精浸泡，用剪刀剪开
腹部上皮，撕开腹部皮肤，挑起腹腔膜，剪开，注意不要全部剪开，将吸管插进去，挤压腹水后，再吸取腹水到15ml离心管中，800rpm，30min离心，收集油脂层一下淡黄液体，即为腹水抗体。

(2)正常情况下，每只小鼠可收集2-3ml腹水。

抗体浓度0.5-5mg/ml。

按1ml/
管，用1.5mlEP管分装后放-80℃冻存。

5.抗体纯化
(1)ProteinG亲和层析柱准备:填料（1ml）装柱后，超纯水流洗3-5个柱床体
积以洗掉乙醇，用平衡缓冲液洗5-10个柱床体积平衡柱子。

(2)上样：将样品上柱，上柱前需将样品超滤浓缩至1ml上柱。

(3)洗涤：平衡缓冲液洗5-10个柱床体积，直至洗涤液用检测液检测无明显显
色反应为止。

(4)洗脱：洗脱缓冲液洗脱吸附在填料上的目标抗体，收集洗脱峰(1-6管)，洗
脱液立即用中和缓冲液中和到中性。

(5)平衡层析柱：立即用5-10个柱床体积平衡缓冲液平衡柱子到中性。

(6)再生：再生缓冲液流洗2-3个柱床体积。

(7)保存：先后用平衡缓冲液、20%乙醇分别流洗3-5个柱床体积。

层析柱内保
留适当体积的20%乙醇，置于4~8℃保存。