核酸探针标记

硷基
OOO
H H(OH)
2、放射性标记物的优缺点
优点：灵敏度高：0。01pg
半衰期短，不能长期保存
二）非放射性标记物
1、优缺点
优点：无放射性污染
成本低、操作简单
缺点：敏感性、特异性均低于放射性核
素
2、常用的标记物
1）生物素：1-2pg
生物素化核苷酸：bio-16-dUTP
（一）缺口翻译法或切口平移 （nick translation）
5‘ 3‘
5’
3’ 5’
3‘ 限量DNA酶I 5‘
5’-3外切酶和5’-3 内切酶
5’ 3’
DNA聚合酶I+ 32P-dNTP
变性
32P部分标记的 单连DNA片段
缺口翻译法的原理
限量DNase I在待标记的双连DNA的每一 条连上产生若干个单连缺口
酶的全酶 4）DNA酶I的浓度一定要适宜
（二）随机引物法（random priming )
随机寡核苷酸引物（random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段 的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用
E。coli DNA聚合酶I的Klenow大片段 （仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶 的活性）
产生射线的核素：32P、3H、35S
产生射线的核素：125I
1、常用的放射性核素
1） 32P：产生射线，灵敏度高，分辨率强，是最 常用的放射性标记物，但半衰期短（14。3天）： 位和位标记。
2）35S：分辨率高、半衰期长（87。1天）。敏感 度底
O(S) O(S) O(S)
OH- P-O-P-O-P-O-CH2 O
生物素化的核苷酸和 光敏生物素
生物素 光敏基团
2）地高辛甙元
Dig-dUTP-----通过酶触反应掺入到DNA 中去制成探针----杂交----加抗地高辛-酶 的复合物—加底物—显色
灵敏度较高：0.1pg 特异性较生物素高 是较理想的非放射性标记物
三、探针的标记方法
（一）缺口翻译法或切口平移法 （二）随机引物法 (三）末端标记法 （四）cDNA探针的标记 （五）RNA探针的标记
bio-11-dUTP
生物素化核苷酸----通过酶触反应掺入到DNA 中去制成探针----杂交----抗生物素蛋白-生物素酶的复合物—加底物—显色
光敏生物素：生物素与光敏基团结合----光敏生 物素-----光敏生物素与核酸探针混合----在强光 的作用下----光敏基团与核酸共价结合---生物素 标记的 探针
连cDNA探针）
（五）RNA探针的标记（体外转录的方 法）
第10章 核酸分子杂交
(nucleic acid hybridization)
基本原理：具有一定同原性的两条核酸单 连在一定条件下（适当的温度、离子强 度等），按硷基互补的原则，重新形成 双连DNA的过程。
杂交的类型：
液相杂交：核酸电镜
固相杂交：膜固相印记杂交、组织细胞原
3’——————5’OH +32P-P-PA(ATP）
T4多核苷酸激酶
————————5’32P+PPA
三、探针的标记方法
（一）缺口翻译法或切口平移（nick translation）
（二）随机引物法（random priming )
(三）末端标记法
（四）cDNA探针的标记（反转录制备单
极易降解，不宜操作。
二、探针的标记物
理想的标记物：敏感度高；特异性强； 不影响探针分子的主要理化特性；标记、 检测方法简单、探针保存时间长；对环 境无污染、对人体无损害；价格低廉。
一）放射性标记物 二）非放射性标记物
（一） 放射性标记物
----放射性核素
利用放射性核素能产生射线的特性将核 素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP 上，通过一定方法掺入到DNA 或RNA 中 去制成探针，与待测的核酸杂交后，核 素产生的或射线可使底片感光的特性， 通过放射自显影的方法进行检测。
随机引物法标记的原理
变性后的探针DNA或RNA与随机引物混 合
随机引物按碱基互补的原则与模板DNA 的相应区域结合
DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物 3’-OH端开始合成互补DNA连
反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记 的DNA探针
5‘
3‘
双连
变性
DNA
3‘
随机引物
3‘
Klenow大片段 32P-dNTP
位杂交、菌落原位杂交
一、膜固相印记杂交
（一）固相支持物的选择 １、硝酸纤维素膜： 在高离子强度下，具有较强的吸附单
连DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2 ２、尼龙膜：在低离子强度下，很强的
利用E.coli DNA多聚酶I的5’-3’外切酶的 活性和5‘-3’多聚酶的活性，在缺口处5’末 端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加 一个核苷酸，以修补缺口。
随着缺口在5’末端的移动修饰的核苷酸 就掺入到新合成的DNA连中
缺口翻译法的特点
1）快速、简便、标记的探针均一、特异 性高
2）仅适用于较长的双连DNA 3）DNA多聚酶必须是E。Coli DNA多聚
5‘
变性
随机引物标记法
随机引物法的特点
1）不但可用于双连DNA的标记，而且 可用于单连DNA和RNA的标记
2）操作简单 3）标记率高
(三）末端标记法
末端脱氧核苷酸转移酶法（terminal deoxynucleotide transferase)
5’——DNA——3’OH+-32 p-dNTP
第9章 核酸探针标记 （label of nuclei acid probe ）
一、探针的类型
核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物 标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作 用的DNA或RNA片段。
1． 基因组DNA探针：病毒DNA等 2． cDNA探针；最常用 3． 寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变 4． RNA探针：稳定性高、特异性强，但RNA
末端转移酶
5’________DNA___________3’(pdN)n +nPPi (焦磷酸） T4多核苷酸激酶法（method of T4
polynucleotide kinase)
(三）末端标记法
T多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase)