新型莽草酸检测方法
莽草酸
莽草酸可用于出口鸡场【产品简介】莽草酸存在于大量高等植物或微生物中。
众所周知的抗流感新宠“达菲”就是通过莽草酸进一步衍生化得到的。
因其口服吸收好，生物利用度高，抗病毒效果可靠，使其在流感流行期间，全球掀起了抢购的热潮。
【分子结构】化学式：3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸分子式：C7H10O5分子量：174.15【性状】类白色精细粉末，易溶于水，在水中的溶解度为18g/100mL，难溶于氯仿、苯和石油醚，气味辛酸。
【药理作用】莽草酸可以直接通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓形成发挥作用，莽草酸还具有抗炎、镇痛作用。
莽草酸可以作为抗病毒和抗癌药物中间体，在体内莽草酸还可转化为多种对病毒、细菌和癌细胞有抑杀作用的物质。
抗菌抗肿瘤作用，1987年有报道中提到日本学者发现莽草酸的一种化合物对海拉细胞株（HeLacells）和埃希利腹水癌（Ehrlichascitescarcinoma）有明显的抑制作用，并能延长接种白血病细胞L1210的小鼠的存活时间，而且毒性相对较低，其抑制作用主要与硫氢化物反应有关。
流感病毒在宿主细胞内复制表达和组装之后，会以出芽的形式突出宿主细胞，但与宿主细胞以凝血酶-唾液酸相连接，神经氨酸酶以唾液酸为作用底物，可催化唾液酸水解，解除成熟病毒颗粒与宿主细胞之间的联系，使之可以自由移动侵袭其他健康的宿主细胞。
如果抑制神经氨酸酶的活性可以阻止病毒颗粒的释放，切断病毒的扩散链，从而抑制病毒的复制。
在发病后24小时内使用，病程会减短20%-30%，病情会减轻25%，作为预防用药，对流感病毒暴露者的保护率在60%-80%之间。
另外还可以通过阻断病毒的糖蛋白合成及抑制病毒成熟后从细胞的释放达到抗病毒效果。
口服迅速被吸收，进入血液循环，2～3小时后达血药峰浓度，其在体内可以定向分布至肺部、支气管、鼻窦等部位。
【特点】药效更持久：本品在体内发挥药效的同时，其体内衍生化产物同样具有抗病毒作用，因而药效稳定时间更长。
莽草酸含量的测定方法---马尾松松针中莽草酸的提取工艺研究_周文美
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江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 11 期
度过高时，原料中的杂质也会相应增加，考虑到时间效率和操 作成本因素，在实际的工业生产中采用 85 ℃ 左右为宜。
2． 2． 4 原料粒度对莽草酸提取率的影响 准确称取干燥的 马尾松松针粉末 2 g 左右，料液比 1 g ∶ 25 mL，1 次提取，时间 固定为 120 min，温度固定为 75 ℃ ，马尾松松针粉末的粒度分 别过 20、40、60、80、100、120 目筛，提取液过滤、离心、浓缩后 稀释 100 倍待测。从图 5 可以看出，原料粉碎得越细，莽草酸 提取率越高。但粒度在 40 目以上时，提取率增大的幅度很 小，而原料粒度过小，物料就会容易黏结在一起，导致过滤困 难和提取液浑浊不清。综合考虑，原料粒度以 40 目为宜。
1 材料与方法
收稿日期： 2013 － 04 － 24
1． 1 仪器
基金项目： 贵州省科技厅重大专项（ 编号： 黔科合重大专项字［2012］
UV － 6100S 双光束紫外分光光度计（ 上海美谱达仪器有
6015 号） 。
限公司） ； ＲE － 52 旋转蒸发器（ 上海亚荣生化仪器厂） ； 电子
作者简介： 周文美（ 1964—） ，女，河南南阳人，硕士，教授，主要从事生 天平 FA2004N（ 上海菁海仪器有限公司） ； SHZ － Ⅲ循环水式
目前，莽 草 酸 的 提 取 方 法 有 热 回 流 法［4］、超 声 波 萃 取 法［5］、水蒸气蒸馏浸提法［6］、微波辅助萃取法［7］，研究较多的 是微波及超声等辅助手段提取方法。但是对于天然植物最传 统的提取手段———热回流提取，尤其是用该方法对松针中莽 草酸的提取，却很少有人报道。本研究以马尾松松针为原料， 在热回流提取的条件下，考察各种因素对松针中莽草酸提取 率的影响，通过单因素试验和正交试验优选最佳提取条件，为 马尾松松针中莽草酸提取的产业化提供理论依据。
云南松中莽草酸含量的高效液相色谱法测定
云 南松 中莽 草 酸含 量 的 高效 液 相 色 谱 法 测 定
夏从 龙 ， 浓 ， 周 刘光 明 张海珠 ， ， 张
（ 大理 学 院药学 院 ， 云南 大理
烨
６ １０ ） ７００
摘要 ： 目的 建立云南松 中莽草酸的高效液相 色谱测定方 法， 以分别考察云 南松 的不同部 位 中莽草酸的含量 。方法 色谱
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｏ ｊｃｉｅ Ｔ ｎ ｅｔ ａ ｅｃ ｎｅ ｔ ｆ ｈｋ ｃａ ｉ ｉｅｅ ｔ ａ ｓｏ Ｐ ｎ ｓ ｕ ｎ ｎｎ ｉ ｂ ｓ ｂｉ ｉ ｅ ｈｇ ｓｒ ｃ ： ｂ ｅ ｔ ｏｉｖ ｓ ｇ ｔ ｔ ｏ ｔｎ ｏ ｓ ｉｉ ｃ ｉ ｄｆ ｒｎ ｐ ｎ ｆ ｉｕ ｙ ｎ ａ ｅｓ ｙｅｔ ｌ ｈｎ ｔ ｉ ｖ ｉ ｅｈ ｍｉ ｄ ｎ ｆ ｓ ａ ｓ ｇｈ ｈ
ｐｒ ｒ ｎｅｌ ｕｄＣ ｒｍ ｔ ｒｐ ｉ ｍ ｔｏ ． ｔｏ ｓＡ ｉ ｎ Ｚ ｒａ Ｄ Ｃ８ ｏ ｍ （ ． ｍ ｘ１０ｍ ５ ｍ）ｗ ｓａｏｔ ｅｏ ｆ ｍａｃ ｑ ｉ ｈｏ ａ ｇａｈｃ ｅｈｄ Ｍｅｈ ｄ ｇｌ ｔ ｏｂｘＸ Ｂ— １ｃｌ ｎ ４ ６ｍ ｍ， ｉ ｏ ｅ ｕ ５ ａ ｄ ｐ—
图 ３ 不 同 来 源样 品 指 纹 图 谱 比较
参考 文献 ：
［ 国家药 典 委员 会．中国药 典 ，Ｉ部 ［ ． 京 ： 学 工 业 出版 社 ， １］ Ｓ］ 北 化
２ ０ ５ ２． ０ ５： ７
３ 讨 论
高效 毛细管 电泳是 近年来 发展较快的一种高效分析技术 ， 在
中药研究 中应用 ， 越来越受到人们的重视 。它具有高效 、 快速 、 进 ［ ２］ 王光忠 ， 李 桥， 宋 恬 ， Ｄ一１ １树脂 富集复 方脑 得生 中总黄 等． ０ 样体积小 、 溶剂消耗少和抗 污染 能力强等 特点 ； 分析 中药样 品时 酮 的工艺研究 ［ ］ 中国中医药信息杂志 ，０ ９ １ （ ）：０ Ｊ． ２ ０ ，６ ７ ５ ． 前处理过程简 单 ， 时甚至 无需 处理 ， 有 因此 ， 中药 有效 成 分分 ［ 国家食品药 品监督管理 局． 在 ３］ 中药 注射剂指 纹图谱研 究 的技术要 求 析、 指纹图谱研究 等方 面已显示出显著的优势 。本研究采用高效
高效液相法测定八角属部分植物果实中莽草酸的含量-精选资料
高效液相法测定八角属部分植物果实中莽草酸的含量1 药品与试剂莽草酸对照品为本室自制，熔点184～186℃，其IR，EI-MS，13CNMR及lHNMR与文献一致，色谱归一化法测得含量为98.22%；乙腈为色谱纯；H3PO4为色谱纯。
2 仪器及色谱条件惠普HP1050液相色谱仪，二极管阵列检测器；化学工作站。
H66025型超声清洗仪（无锡市超声电子设备厂）。
色谱柱：ZORBAX NH2（5μm，4.6 mm×150mm）；流动相：乙-2%H3PO4（95：5）；流速：1ml?min-1；测定波长213 nm，带宽4nm；参比波长300 nm，带宽80 nm。
衰减9；柱温：室温；柱效以莽草酸计，理论塔板数应不低于5400。
3 方法学考察3.1 样品提取条件优化精密称取干燥的红茴香果实粉末（过40目筛）约0.3 g，分别精密加入30 ml（1～5号）、40 ml（6号）甲醇，精密称重，按下述条件超声提取（250W）。
提取完毕后再精密称重，以甲醇补足至原重量。
取5ml上清液，以0.45μm微孔滤膜滤过，滤液进样，外标一点法测定含量，并对测定结果进行q检验。
检验结果表明各条件间无显著性差异，样品供试液的制备采用以下条件。
样品供试液的制备：精密称取干燥的八角属植物果实粉末（过40目筛）约0.2 g，精密加入20 ml甲醇，称重，超声提取（250 W）20 min，提取完毕后再精密称定，以甲醇补足至原重量，取5ml上清液，以0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为样品供试液。
3.2 标准曲线制备：精密称取莽草酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.3 mg的溶液，作为对照品溶液。
精密吸取对照品溶液2.5，5.0，10.0，15.0，17.5μl进样，测定色谱峰峰面积，并以色谱峰峰面积对对照品的量回归（包括原点），得回归方程为A=147.83+3285.56m，r=0.9995，其线性范围为0.61～4.27μg，可用外标一点法测定。
莽草酸含量测定方法综述
Industry Review 行业综述
莽草酸含量测定方法综述
A Review of the Quantitative Methods of Shikimic Acid Content
◎ 罗 威，高冬丽 （云南师范大学云南省马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明 650500）
Luo Wei, Gao Dongli (Key Lab for Potato Biology of Yunnan Province, Yunnan Normal University, Kunming 650500, China)
摘 要：莽草酸在植物和微生物体内的酚类合成代谢途径中发挥着承上启下的作用。本文从供试品制备和 检测方法两个角度综述了莽草酸含量测定的方法，以期为不同食品中莽草酸及其他有机酸的含量测定提供参考。
XIANDAISHIPIN 现代食品 / 59
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行业综述 Industry Review
样品进行提取，提取液经大孔吸附树脂层析柱水洗分 离进一步纯化。Zelaya 等 [13] 在样品粉末中加入盐酸后， 采取回流提取——超声处理——回流提取的策略，同 时设计“简略提取法”，对二者进行比较，认为前者 提取步骤繁琐耗时长，污染概率大。此外，索氏提取 器也被用于供试品制取 。 [14]
针对“简略提取法”耗时长的缺点，常用微波处 理和超声处理两类辅助手段。Matallo 等 [8] 进行了针对 植物组织中莽草酸的微波辅助提取（MWAE）。将粉 末样品与酸化的蒸馏水混合，均质化后微波处理 10 s， 冷 却 后 过 滤 得 到 供 试 品 溶 液。 林 海 禄 等 [9] 比 较 了 MWAE 和传统提取方法，MWAE 提取时间短、提取 剂用量少并且提取效率高。
HPLC―ELSD法测定八角茴香中莽草酸的含量4页word
HPLC―ELSD法测定八角茴香中莽草酸的含量八角茴香，常绿乔木，高达20 m。
其聚合果含大量莽草酸，常由8个骨突果生在中轴呈星状，外表面红棕色，有不规则皱纹，顶端呈鸟喙状，上侧多开裂[1]。
主产广西、广东、云南等地[2]。
莽草酸是从中药八角茴香中提取的一种单体化合物，有抗炎、镇痛作用，是抗癌药物中间体。
有明显抗血栓形成作用，可抑制动、静脉血栓及脑血栓形成[3]。
莽草酸是世界上对付禽流感的唯一武器，莽草酸是可有效对付致命的H5N1禽流感病毒的药物“达菲”的重要成分。
莽草酸（shikimic acid）为三萜酸，结构式见图1。
它是有机弱酸，在水溶液中易解离。
现有的HPLC分析检测方法主要有以下几种：①直接用ODS柱测定，结果发现莽草酸不经吸附就可直接出峰。
为了在常规的ODS 柱上延长莽草酸的保留时间，一般要加入磷酸缓冲盐溶液[4]，或强酸溶液（HClO4，pH=2.5）[5-6]，或离子对试剂[7]。
但是，磷酸盐缓冲液系统和强酸溶液会增加对反相色谱柱损坏的程度。
②采用氨基键合相硅胶柱[8]，不需要加入强酸做流动相，即可获得令人满意的分离效果。
③在检测波长的选择方面，现有文献均用213 nm左右的波长进行测定，但是该吸收峰接近末端吸收，易受杂质干扰。
相比之下，蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector，ELSD）由于其独特的检测原理却可以克服紫外检测器的不足，这是因为ELSD检测器适用于分析没有紫外吸收或者只有末端吸收的成分，其响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测。
ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。
因此，为了提高莽草酸含量测定的准确性，本文选择了氨基键合相硅胶柱和蒸发光散射检测器进行含量测定研究。
1 仪器与试药Agilent 1100 HPLC，Alltech 2000型蒸发光散射检测器；色谱柱：Hypersil NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），大连伊利特。
莽草酸质量标准
莽草酸质量标准shikimic acidOHOHOH OHOC 7H10O5174.15本品为3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-甲酸，主要成分为莽草酸，含C7H10O5应不少于98.5%。
【性状】类白色粉末，易溶于水，难溶于氯仿、苯等有机溶剂，气味辛酸。
熔点本品的熔点（中国兽药典2005附录45）为210～220 ℃，熔解时同时分解。
【检查】pH值本品应为6.0～8.0（中国兽药典2005附录51）溶液的澄清度与颜色取本品五份，各1.0 g，分别加水10mL溶解后，溶液应该澄清无色，如显浑浊，与0.5号浑度标准液比较（中国兽药典2005附录45页），均不得更浑。
干燥失重取本品在恒温减压干燥器，干燥剂为五氧化磷，常温干燥2小时，减重不得过10%（中国兽药典2005附录69页）。
【含量测定】高效液相——质谱法色谱条件：色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相甲醇-水(50∶50)；柱温25 ℃；流速0.7 mL/min，进样量10 μL。
质谱条件：离子源API-ESI源；喷雾电压4000 V；雾化气压0.4 MPa；辅助气压力0.03 MPa；加热毛细管温度350 ℃；碰撞气压力0.5 Pa；碰撞诱导解离CID电压均为25 eV；选择性反应离子检测(SIM)；m/z174.1→174.1。
测定法取样品适量，加水适量溶解并定容，配置成每100 mL溶液中含莽草酸20 mg 的溶液，取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取莽草酸对照品，同法测定。
按外标法，以峰面积计算，即得。
【包装】25 kg/桶【储存】阴凉干燥处，密闭保存。
【有效期】两年。
高效液相色谱法测定华山松中莽草酸的含量
２ ％。 ５ 结果 ： 莽草酸在００ １ － ． １ ｐ － ． ０５ ，￣峰面积 线性关系 良好 （＝ ． ９ ）平均加样 回收率为９ ． ％， Ｓ ￣０７ ％（： ） 华山 ４ ５ ８ Ｏｇ ｒ０９ ， ９９ ８７ Ｒ Ｄ ． ４ ４ ｎ９ 。
松 不 同部 位 均 含 有莽 草酸 成 分 ， 含 量 差异 较 大 。 结 论 ： 山松 中的莽 草酸 可 以作 为 新 的莽 草酸 资 源 加 以开 发利 用 。 且 华
ｌ ｅｒ ｅ ｔ ｎｈｐｂ ｔｅｎｔｅｐａ ｒａａ ｄｃｎｅｔ ｆ ｈｋｍ ｃ ｃｄｗ ｓｏｓｒｅ ｅｒｎｅｏ ． １５ ０ ８ ｒＯ９ ９９ ； ｉ ａ ｌ ｉ ｓｉ ｅ ｅ ｅｋａｅ ｎ ｏｔｎ ｏ ｉｉ ｉ ａｉ ａ ｂｅｖｄｉ ｔ ｇ ｆ ０ － ． １ ｇ（＝ ． ） ｎ ｒａｏ ｗ ｈ ｓ ｎｈ ａ ０４ ５ ０ ９
【 ｅ ｏ ｄ Ｈ Ｌ ； ／ｕ ｒ ａ ｄ； ｈｋｍ ｃａ ｉ； ｅ ｒ ｎ ｔ ｎ Ｋ ｙ ｗ ｒ ｓ Ｐ Ｃ Ｐ ｎ ｓａｍ ｎ ｉ ｓ ｉｉ ｉ ｃ ｄ ｔ ｍｉａ ｏ Ｊ ｄ ｅ ｉ
（ ＝ ．Ａ１ ｐ ｒ ｆＰ ｒ ｎ ｉｃ ｎａｎ ｄ ｓ ｉｉ ｃａ ｉ．ｂ ｔｔｅｃ ｎｅ ｔ ｎ ９） ｌ ａｔ ｏ ａｍａ ｄ ｏ ｔｉｅ ｈｋｍｉ ｃｄ ｕ ｈ ｏ ｔｎｓ ｓ
ａ ｍ ａ ｄｉｃ ｎ ｂｅ ａ ｎ ｗ ｅ ｏ ｃ ｆｓ ｋ ｍｉ ｉ ｏ ｘ ｏ ｔｔｏ ｎ ｔｌｚ ｔｏ ｒ ｎ ａ ｅ ｒ ｓ ｕｒ ｅｏ ｈｉｉ ｃａｃｄ ｆｒｅ ｐｌｉａｉ ｎ ａ ｄ ｕｉｉａ ｉｎ．
ｔｅ ａ ｅａ ｅ ｒｃｖ ｒ ｓ９ ．４ ｈ ｖ ｒｇ ｅ ｏ ｅｙ ｗａ ８７ ％，ａ ｄ ＲＳ ｓ０７ ％ ｎ Ｄ ｗａ ．４
ｓｇ ｉ ｃ ｎｔｙ ｖ ｒｅ ｒ ｍ ａ ｔｔ ａ ｔ ｉｎ ｆ ａ ｌ ａｉ ｄ ｆｏ ｐ ｒ ｏ ｐ ｒ．Ｃｏ ｌ ｓ ｏ ｉ ｎｃ ｕ ｉ ｎ：
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本产品的比色法测定
含量测定：以新型莽草酸计
1．对照品溶液的制备取经105℃干燥至恒重的新型莽草酸对照品（含量99.8%）10g，精密称定，置1000ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
2 待测品溶液的制备取本品，加水制成每1000ml含新型莽草酸10克的溶液,作为供试品溶液。
3 测定法精密量取对照品溶液与供试品溶液各20ml，分别置具塞试管中，各加2.5％苯酚溶液1ml，摇匀，置冰浴中缓缓滴加硫酸10ml，摇匀，置沸水浴中煮沸3分钟，取出，置冰浴中冷却3～5min，取出，在10～40min内，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录ⅣA)，在490nm的波长处分别测定吸收度。
（附：722型分光光度计的使用
一 1、将灵敏度旋钮调至“1”档（信号放大倍率最小）。
2、开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调至到测试用波长。
仪器预热20分钟。
3、打开试样室（光门自动关闭），调节透光率零点旋钮，使数字显示为000.0。
（调节100%T旋钮），盖上试样室盖，将比色皿
架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透光率100%旋钮使数字显示100.0。
如显示不到100.0，则可适当增加微电流放大的倍数。
（增加灵敏度
的档数同时应重复（3）调节仪器透光率的“0”位）但尽量使倍率置于低档使用。
这样仪器会有更高的稳定性。
4、预热后，按（3）连续几次调整透光率的“0”位和“100%”的位置，待稳定后仪器可进行测定工作。
二吸光度“A”的测量
将选择开关置于A 。
调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为零，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。
三浓度c的测量
将选择开关由“A”旋至“C”将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路即可读出被测样品的浓度值。
注意事项：
1、测量完毕，速将暗盒盖打开，关闭电源开关，将灵敏度旋钮调至最低档，取出比色皿，将装有硅胶
的干燥剂袋放入暗盒内，关上盖子，将比色皿中的溶液倒入烧杯中，用蒸馏水洗净后放回比色皿盒内。
2、每台仪器所配套的比色皿不可与其它仪器上的表面皿单个调换。
）
4 计算Y=3.74
5 8X-0.037 7 (Y为吸收度,X为对照品毫克数) 。
附：分光光度计测定物质含量的工作原理
物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应
地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同
的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光
谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光
光度定性和定量分析的基础。
分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间
相互作用的有效手段。
紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。
即物质在一定浓度的吸
光度与它的吸收介质的厚度呈正比。
实验数据注这次检测的数据可能和原来的不一样，按你们这次检测的数据就可以，检测三次看一下
三次的最终数据的数字结果是否一样就可以。
按公式 Y=3.7458x-0.0377（mg/g）计算（公式不确定）
1 33 33 33 33 33 33 28 28 28
2 3
3 33 33 33 33 33 28 28 28
3 33 33 33 33 33 33 28 28 28。