人脐静脉内皮细胞的体外培养
人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定
本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。
方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。
结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。
内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。
结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。
[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。
当归水煎液对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及胶原合成的影响
当归水煎液对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及胶原合成的影响[摘要]目的：探讨当归水煎液对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡和胶原合成的影响。
方法：体外培养人脐静脉内皮细胞，用噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性，用流式细胞术分析细胞周期及凋亡，用放射免疫法测定胶原合成。
结果：当归水煎液能促进人脐静脉内皮细胞的增殖，且随浓度增大促增殖作用愈大。
当归水煎液使s期和g2/m 期细胞增多，g0/g1期细胞减少（p<0.05)，凋亡率逐渐减小（p<0.05)。
当归水煎液呈剂量和时间依赖性抑制人脐静脉内皮细胞合成胶原 (p<0.05)。
结论：当归水煎液呈剂量依赖性促进人脐静脉内皮细胞的增殖，抑制其凋亡，减少胶原合成。
[关键词]当归水煎液；内皮细胞；增殖；凋亡；胶原合成[中图分类号]q813.1 [文献标识码]a [文章编号]1008-6455（2012）05-0782-03effect of angelic decoction on proliferation, apoptosis, collagen synthesis of human umbilical vein endothelial cells liu kai,zhang xuan-fen,zhang jin,qin yong-hong,zhong lin (plastic surgery,the second hospital of lanzhou university,lanzhou 730030,gansu,china)abstract objective to investigate the effects of angelic decoction on proliferation, cell cycle, apoptosis, andcollagen synthesis of human umbilical vein endothelial cells (huvec). methods huvec was cultured and passaged in dulbecco’s modified eagle’s medium(dmem) and treated with angelicanaphtha 1mg/l, 4mg/l, and 16mg/l at 1, 3, 5, and 7day respectively. the proliferation was measured with mtt method. the cell cycle and apoptosis were analyzed with flow cytometry and collagen synthesis was determined with radioimmunoassay. results the huvec proliferation was accelerated by angelic decoction in concentration-dependent manner (p<0.05). s phase cells and g2/m phase cells were increased and g0/g1 phase cells and apoptosis was gradually reduced by angelic decoction (p<0.05). the collagen synthesis of huvec was also inhibited by angelic decoction in concentration-dependent manner (p<0.05). conclusion the huvec proliferation was accelerated and the apoptosis was reduced and the collagen synthesis was reduced by angelic decoction.key words:angelic decoction; endothelial cells; proliferation; apoptosis; collagen synthesis创面愈合和瘢痕形成是新血管形成的结果[1]，内皮细胞增殖和合成细胞外基质是血管形成的基础, 脐静脉内皮细胞是调控血管形成的最佳靶点之一[2-3]。
huvec小管生成实验方法
huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验方法引言：HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的体外模型系统，用于研究血管生成和血管内皮细胞功能。
HUVEC小管生成实验是一种常见的方法，用于评估血管形成的能力和细胞迁移的能力。
本文将介绍一种常用的HUVEC小管生成实验方法及其步骤。
材料与试剂：1. HUVEC细胞系：通过细胞培养技术获得。
2. 培养基：使用适合HUVEC细胞培养的培养基，如DMEM/F12。
3. 培养皿：使用96孔板或24孔板。
4. 载玻片：用于观察和分析小管生成。
5. Matrigel：一种基质蛋白，用于模拟细胞外基质环境。
实验步骤：1. HUVEC细胞的培养a. 将HUVEC细胞解冻并在培养基中孵育。
b. 细胞密度达到80-90%时，用PBS洗涤细胞。
c. 使用细胞消化酶（如胰酶）消化细胞。
d. 将细胞重新悬浮在培养基中，并计数细胞数目。
2. Matrigel涂层a. 在载玻片上滴加2-3滴Matrigel。
b. 使用移液器均匀涂覆整个载玻片表面。
c. 在37摄氏度下孵育30分钟至凝胶化。
3. 细胞接种a. 将预定细胞数目的HUVEC细胞悬浮在培养基中。
b. 将细胞悬浮液加入预先涂有Matrigel的孔板孔中。
c. 将培养皿放置在37摄氏度的细胞培养箱中，孵育24-48小时。
4. 观察和图像获取a. 使用显微镜观察HUVEC细胞在Matrigel上的小管生成。
b. 使用图像采集系统捕获并保存小管生成的图像。
5. 分析小管生成a. 使用图像处理软件对图像进行分析，包括测量小管长度、分支点数目等。
b. 统计和比较不同处理组的小管生成结果。
结果与讨论：通过HUVEC小管生成实验，可以评估细胞的血管生成能力。
实验结果显示，HUVEC细胞在Matrigel上能够形成分支的管状结构，模拟血管形成的过程。
小管长度和分支点数目可以作为评估血管生成能力的指标。
此外，通过比较不同处理组的结果，可以进一步研究各种因素对血管生成的影响。
人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术
２ １ ４月 ０ ０年
第１ ４卷
第 ４期
一
５ｌ 一 Ｉ
文 章 编 号 ：０７— ２７２ １）４ ５ １ ３ １０ ４ ８ （００ ０ —０ １ —０
人 脐 静 脉 内皮 细 胞 分 离 培 养 及 鉴 定 技 术
吴金 义 张 ， 蕾 ， 张秀英 曲丽梅 ，
（． １吉林大学 中 日联谊 医院 心内科 ， 吉林 长 春 １０ ３ ； ． ３０３ ２ 一医院 病理科 ） 摘要： 目的 探讨人脐静脉 内皮 细胞 （ Ｖ Ｃ 体外 分离 原代 培养 的方法 ， ￣ＪＥ ） 并总结对培养 的细胞 鉴定 方法。方法
通过胰酶灌注法从人脐带获取 内皮 细胞 进行分离培养 ， 并采用免疫组 化法及 光镜和透射 电镜观察 超微结构 鉴定所获
得 的细胞系 。结果
分离 的 Ｈ Ｖ Ｃ在体外 ７ ０天左右可长成单层 ， ＵＥ —１ 光镜下 胞体 为单层铺 路石状排列 。第 ＶＩ 因子 Ｉ Ｉ
用胰酶灌 注法是获
相关抗原 的检测 为阳性 。透射 电镜下 观察培养的内皮细胞胞浆内可见 Ｗｅ ｅ—ａ ｄ 小体 。结论 ｉｌ ｌｅ ｂ Ｐａ 得脐静脉 内皮细胞 的有效 方法 。本 方法 为血 管内皮细胞的研究提供 了实验模型 。
（ ’ Ｌ ｂＤ ａ ｎ ２ １ ，４ ０ １ ） Ｃ Ｊ ａ ／ ， ０ １ ： １ ｇ ０ ５
ｃｅ ａ ｎ ｔｅ ｃ ｉ ｐ ａ ｍ ｕ ｄ ｒｅｅ ｔ ｎ—ｍ ｃｏ ｃ ｐ ｈ ｃ ｅ ｅ ｉｅ ｔ ｅ Ｃ ． ｎ ｌ ｓ ｎ Ｔ ｅｄ ｇ ｓ ｏ ｆ ａ ｃ ｅ ｔ ｅ ＿ ｌ ｓｗ ｓ ｉ ｅｌ ｌ ｅ ｌｃｒ ｈ ｓ ｎ ｏ ｉ ｒｓ ｏ ｙｗ ｉｈ ｗ ｒ ｄ ｎｉ ｄ ａ Ｅ ｓ Ｃｏ ｃ ｉ ｈ ｉ ｔ ｎ ｏ ｎ ｒａｉ ｐ ｄ — ｉ ｆ ｓ ｕ ｏ ｅｉ ｐ ｎ ｕ ｓ ｎ ｉ ａ ｆ ｃ ｖ ｔ ｏ ｏ ｇ ｉ Ｃ ， ｄ ｔｉ ｍｅ ｏ ｒ ｖｄ ｓｅ ｐ ｒ ｎａ ｄ ｌｆｒＶ Ｃｌ Ｃ ｅ ｅ ｒ ｈ ｉ ｅ ｅ ｔ ｅ ｍｅｈ ｄ ｔ ａｎ Ｅ ｓ ａ ｈｓ ｔ ｄ ｐ ｏ ｉｅ ｘ ｅ ｉ ｔ ｍｏ ｅ ｏ ａ ｌａ Ｅ ｓｒ ｓ ａｃ ． ｏ ｓｎ ｉ ｎ ｈ ｍｅ ｌ ｓ ｌ ｒ Ｋｅ ｒ ｓ ｈ ｍａ ａ ｃ ｌｒ ｎ ｏｈ ｌ ｅｌｉ ｍｂｌ ａ ｖ ｉ ｃ ｌ ｃ ｔｒ ；ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ ： ｕ ｎ ｖ ｓ ｕ ａ ｄ ｔｅｉ ｃ ｌ ｎ ｕ ｉ ｃ ｅｎ； ｅ ｕ ｕ ｅ ｉ ｅ ｔ ａｉ ｅ ｌ ａ ｉｌ ｌ ｉ ｆ ｏ
人脐静脉内皮细胞体外培养_鉴定与形态学特征观察
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两种人脐静脉内皮细胞培养方法的比较
两种人脐静脉内皮细胞培养方法的比较目的：用两种不同的方法培养人脐静脉内皮细胞，比较两种方法的优缺点。
方法：（1）方法1，用0.125%胰酶加0.02%的EDTA消化液消化、方离脐静脉内皮细胞，用含20%的胎牛血清的DMEM完全培养液，于37 ℃、5% CO2条件下培养。
（2）方法2，用胶原酶Ⅱ消化脐静脉内皮细胞，用含20%胎牛血清+细胞生长因子+明胶铺板，于37 ℃、5% CO2条件下培养。
比较两种方法对细胞活力、培养细胞数量等方面的影响。
结果：以改良方法培养的内皮细胞4 h贴壁生长，细胞数量达到整瓶的80%～90%，48～72 h生长最快，细胞融合，内皮细胞呈单层铺路石样外观。
传统方法培养的内皮细胞24 h后细胞数量只达到整瓶的20%～30%，细胞融合较慢。
结论：用0.125%胰酶加0.02%的EDTA灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法，更加简便、经济，是建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的好方法。
标签：人脐静脉内皮细胞；消化液；培养方法人脐静脉内皮细胞为位于血管内壁与血液直接接触的单层细胞。
内皮功能失常可破坏血管壁凝血和循环功能障碍，与多种疾病发生密切相关，血管细胞的研究因此成为动脉粥样硬化以及其他血管疾病研究的重要方向[1-2]。
人们常用脐静脉作为获取血管内皮细胞的来源。
本研究利用健康婴儿脐带，分别采用改良方法和传统方法来获取内皮细胞，结果发现细胞数量和细胞活力都出现不同的效果。
1 材料与方法1.1 实验材料及主要试剂、仪器1.1.1 材料足月健康出生的新生儿脐带由太和医院妇产科提供，产妇及其家属签署知情同意书。
1.1.2 主要试剂M199培养基，胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶，EDTA （国产，武汉天源生物技术有限公司），胶原酶Ⅱ（Amresco公司）1.1.3 仪器倒置显微镜（Olympus公司，日本），恒温恒湿培养箱（Thermo 公司，美国）1.2 实验方法HUVECs的原代培养：无菌条件下取新生儿脐带两根（离体时间6 h以内），长度至少15～20 cm，在超净工作台内剪去脐带两端易污染及血肿部分，找到脐静脉后，净尖端已磨平的50 ml注射器针头插入脐静脉一端的管腔中，用止血钳夹闭固定针头，用37 ℃预热的PBS冲洗脐静脉管腔2遍，将脐静脉内的血液冲洗至无色。
原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结
原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结刘文;陈瑞云;王志伟【摘要】目的建立分离培养原代人脐静脉内皮细胞的方法.方法采用0.125％胰酶+0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)消化液灌注法,获得原代人脐静脉内皮细胞,用免疫组织化学方法进行细胞鉴定.结果原代培养的脐静脉内皮细胞呈典型的铺路石样排列;细胞鉴定可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论 0.125％胰酶+0.01％EDTA消化法能够获取大量且纯度高的原代人脐静脉内皮细胞,为体外实验提供可靠的细胞模型.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2016(024)008【总页数】3页(P11-13)【关键词】原代人脐静脉内皮细胞;分离;细胞培养【作者】刘文;陈瑞云;王志伟【作者单位】山东省青岛科技大学校医院内科,山东青岛266044;山东省青岛大学第二附属医院胃肠外科,山东青岛266042;山东省青岛大学第二附属医院肛肠外科,山东青岛266042【正文语种】中文【中图分类】Q813.11血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是血管内表面的单层扁平上皮，构成了血管壁与血液之间的机械屏障，EC能吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，能分泌很多生物活性物质以调节血管通透性、参与凝血和动脉粥样硬化过程，还能通过调节血管的收缩和舒张以调节血压等。
为研究人体大血管内皮功能需要体外建立人血管内皮细胞模型，而内皮细胞株ECV304,在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞存在明显差异[1]，因此，体外分离培养原代人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）是获取内皮细胞的重要途径。
本实验总结了体外培养HUVECs的方法，应用消化酶灌注法,成功分离了人脐静脉内皮细胞，获取了大量的HUVECs，创建了研究内皮细胞的模型。
1 材料与方法1.1 标本来源脐带均来自于剖宫产的新生儿脐带，于无菌条件下获取，迅速转移至细胞室超净台中，进行分离培养。
实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养
实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。
注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。
3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。
4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml 无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。
5.将收集液离心（2000转/分）3分钟。
6.倒去上清，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。
注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。
）7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。
9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。
10.倒掉造就基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，插手2-3ml消化液（0.25%胰酶0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下窥察，一旦细胞变圆，即插手2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。
11.用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中。
2000转/分，离心3分钟。
12.倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。
内皮实验报告
实验目的：本研究旨在通过体外实验，探讨内皮细胞在不同条件下的生物学特性，包括细胞增殖、凋亡、迁移和血管生成能力，以期为内皮细胞在疾病发生发展中的作用提供实验依据。
实验材料：1. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）2. DMEM培养基（高糖）3. 胎牛血清（FBS）4. 0.25%胰蛋白酶5. 细胞培养箱6. 倒置显微镜7. 流式细胞仪8. 实验试剂（如Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、血管内皮生长因子（VEGF）检测试剂盒等）实验方法：一、细胞培养与鉴定1. 将HUVECs接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 每2-3天更换一次培养基。
3. 利用免疫荧光染色法鉴定内皮细胞，观察细胞形态和内皮细胞标记物（如VE-cadherin）的表达。
二、细胞增殖实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 在不同时间点收集细胞，利用CCK-8法检测细胞增殖情况。
三、细胞凋亡实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理，对照组给予等量DMEM 培养基。
3. 利用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡情况。
四、细胞迁移实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的细胞外基质（ECM）蛋白处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用Transwell小室检测细胞迁移能力。
五、血管生成实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用血管生成实验试剂盒检测细胞血管生成能力。
实验结果：一、细胞培养与鉴定成功培养出HUVECs，细胞形态为长梭形，细胞表面表达VE-cadherin。
二、细胞增殖实验VEGF处理组细胞增殖能力明显增强，与对照组相比，增殖率显著提高。
三、细胞凋亡实验TNF-α处理组细胞凋亡率显著升高，与对照组相比，凋亡率显著增加。
人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定
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人 脐 静 脉 内皮胞 细体 外 培 养及 鉴 定
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确把握消融终点。
对于心脏手术后尤其是心脏结构异常的病人,若出现心律失常,必要时需行电生理检查以明确诊断。
需要射频消融时,则要求术者一定具有扎实的心脏电生理理论知识,同时还要准确地把握病人的心脏结构。
病人在术后出现的心律失常与心脏手术是否有关,尚待进一步论证。
参考文献:[1] Bake J H,Plumb VJ,Epstein AE,et al.Predictors of recurrent atrioven2tricular nodal reentry after selective slow pathway ablation[J].Am J Cordial,1994,73:765-769.[2] Manolis AS,Estes NAM.Supraventricular tachycardia:Mechanismand therapy[J].Arch Intern Med,1987,147:1706-1716.[3] Langberg JJ,Harvey M,Calkins H,et al.Titration of power outputduring radiofrequency catheter ablation of atrioventricular nodal reen2 trant tachycardia[J].Pace,1993,16:465-470.[4] Lai WT,Wu J C,Wu SN,et al.Differential effect of adenosine on an2tegrade fast,antegrade slow,and retrograde fast pathways in patients with atrioventricular nodal reentrant tachycardia[J].Circulation, 1996,94:284.作者简介:相晓军(1974—),男,毕业于山西医科大学,主治医师,医学硕士,现工作于山西省运城市急救中心(邮编:044000);李学文,工作于山西医科大学第一医院;叶新龙,工作于山西省运城市急救中心。
(收稿日期:2007-12-27)(本文编辑王雅洁)人脐静脉内皮细胞的体外培养王 皓,张静生中图分类号:R329.3 文献标识码:C 文章编号:1672-1349(2008)03-0368-02 内皮细胞位于血管内壁,现在认为它是一个活跃的“内分泌器官”,参与了机体许多生理病理变化过程,是许多疾病(如动脉粥样硬化等)发生的始动机制。
因此研究内皮细胞的功能及在疾病中的作用,可以从分子细胞角度进一步探讨疾病发生的本质,为治疗和预防疾病提供新的思路。
为此,体外培养人体内皮细胞已成为完成科研任务的一个重要手段。
新生儿脐带来源丰富,取材方便,目前已成为血管内皮细胞体外实验的的重要材料。
在实验中,逐步摸索人脐静脉内皮细胞在体外培养的适宜条件,以确定内皮细胞体外生长繁殖的最佳环境,为进一步的研究提供重要手段。
1 试剂与设备1.1 试剂 胎牛血清(G ibco),胰蛋白酶(G ibco),M199培养液(G ibco),青霉素和链霉素(华北制药有限公司),第Ⅷ因子相关抗原(北京中杉金桥公司)。
1.2 设备 超净工作台(苏州净化设备有限公司),CO2孵育箱(Thermo),倒置显微镜(OL YMPUS),恒温水浴箱(上海医疗器械七厂)。
2 方 法2.1 人脐静脉内皮细胞的原代培养 取足月新生儿脐带(约25cm),4h内进行脐静脉内皮细胞的原代培养。
将脐带取出,用平头针头插入脐静脉一端,无菌手术线固定;然后抽取PBS液,注入脐静脉灌洗,直至脐静脉内残血全部冲净。
结扎脐静脉另一端,向脐静脉内注入预热的0.25%胰蛋白酶,灌满后,置于37℃水浴中消化8min。
期间翻动揉捏脐带,使胰蛋白酶能够充分与内皮接触。
取出脐带后,抽取消化液,并用PBS液冲洗脐带,收集冲洗液;将消化液与冲洗液混合,收集注入离心管中,1000r/min离心10min。
然后弃掉上清液,加入M199全营养液(含20%胎牛血清),并用吸管轻轻吹打,重悬细胞,移入25mL培养瓶中置37℃、5%CO2培养箱中静止培养。
18h后观察细胞,见细胞生长状态良好,已贴壁,换液。
以后每2d换1次液,第5天细胞80%～90%融合呈铺路石样,消化传代。
2.2 人脐静脉内皮细胞的传代 待原代培养细胞生长至80%～90%融合后进行传代培养。
弃掉培养液,加入2mL PBS液冲洗细胞一次,再加入约3mL0.25%胰蛋白酶。
镜下观察,待所有细胞形态完全变圆后,加入含20%胎牛血清的M1995mL终止消化。
收集消化液,离心,1000r/min,5min。
然后弃上清液,加入2mL含10%胎牛血清的M199,充分吹打至细胞完全分散,将细胞悬液按1×105/mL接种于培养瓶中继续培养。
2.3 人脐静脉内皮细胞的鉴定2.3.1 人Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测 在6孔培养板内放置无菌的0.5cm×0.6cm盖玻片,每孔中种植浓度为1×105/m L 的HUV EC悬液2mL。
待细胞生长至近融合状态时,取出玻片,PBS冲洗3次放入乙醇-丙酮混合液(1∶1)中固定10min 后,自然晾干。
滴加兔抗人Ⅷ因子相关抗原多抗工作液,37℃孵育60min。
然后用PBS冲洗浸泡10min,晾干。
加入羊抗兔荧光抗体,37℃孵育40min,PBS冲洗浸泡15min,晾干,用缓冲甘油封片,置于荧光显微镜下观察。
2.3.2 结果 荧光显微镜下可见内皮细胞胞质呈较强的黄绿色荧光,胞核尤为明显。
3 讨 论目前人静脉内皮细胞已成为研究内皮细胞功能体外实验的主要来源,脐静脉内皮细胞原代培养的关键为细胞的分离和培养液的成分。
细胞分离方法有机械刮取、组织块法和酶消化法3种。
机械法[1]即是用小刮匙轻轻地在静脉内壁上刮取内皮细胞,但其缺点是机械力度不容易控制,容易损伤内皮细胞,且易混入纤维细胞,现在应用较少。
组织块法也因易混入血细胞和纤维组织,而不在广泛使用。
酶消化法简便可靠,应用最广。
消化酶主要是胰蛋白酶、胶原酶和混合酶3种;胶原酶的作用温和,不易损伤内皮,但价格较昂贵[2]。
胰蛋白酶作用较强,虽对・863・CHINESE JOURNAL OF IN TEGRA TIVE MEDICINE ON CARDIO-/CEREBROVASCULAR DISEASE March 2008 Vo1.6 No.3细胞有毒性作用,但其价廉,因此仍为内皮细胞培养常用的消化酶。
也有人认为,以混合酶消化法为优,获得的细胞活力高,生长及贴壁情况佳。
在本实验中选用胰蛋白酶,证明只要掌握好消化时间,就可以成功获得足够的内皮细胞。
不论应用何种消化酶,都要根据其酶的活力,调整消化时间。
另外由于消化酶配制时间长短的不同,消化的时间也应不同。
一般新配制的消化液消化时间要相对短一些,反之则要适当延长消化时间。
总之,掌握最佳消化时间是实验成功的关键一步。
培养内皮细胞常用的有PRMI1640、M199、DMEM等,根据实验室条件可以选用不同的培养基,一般培养基都需要加抗生素,我们实验室在选用的培养基(M199)中加双抗,终浓度为青霉素100U/mL,链霉素100U/mL。
并且在M199培养液中加入胎牛血清、ECGS、肝素、L-谷氨酰胺等,以利于内皮细胞的贴壁和增殖[3]。
由于L-谷氨酰胺易降解,其确切的降解率目前还没有最终确定,降解后的氨产物对细胞还有一定的毒性作用,因此最好在应用前加,可以保存2周。
Martin等[4]提出,内皮细胞内具有两个特征性标志,即Ⅷ因子相关抗原和Weible-Palade小体。
但并非每个细胞都能观察到Weibel-palade小体,而且电镜标本制作较困难。
Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-Rag)存在于内皮细胞、巨核细胞及血小板中,是目前最可靠的鉴定内皮细胞的手段,因此在本实验中采用人第Ⅷ因子相关抗原免疫组化法检测,证明所获得的是内皮细胞。
本研究所采用的人脐静脉内皮细胞的分离、培养方法简便,而且能够防止污染,成功率较高,能够获得大量的内皮细胞,为进一步研究内皮功能提供了充足的物质基础。
参考文献:[1] Quattrone S,Chiappini L,Scapagnini G,et al.Relaxin potentiatesthe exp ression of inducible nitric oxide synthase by endothelial cells from human umbilical vein in in vitro culture[J].Mol Hum Reprod,2004,10(5):325-330.[2] 张小燕,梁朝,赵林,等.人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定[J].中华医学研究杂志,2005,5(6):386.[3] Valerie Marin,G illes Kaplanski,Sandra Gres,et al.Endothelial cellculture:Protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelialcells[J].J Immunol Methods,2001,254(122):183.[4] Martin GM.Tissue and orginic culture of blood vesels[M].NewY ork:Acadenic Press,1987:13-21.作者简介:王皓(1971—),女,毕业于辽宁中医药大学,硕士学位,现为辽宁中医药大学在读博士(邮编:110032);张静生,工作于辽宁中医药大学。
(收稿日期:2008-01-07)(本文编辑王雅洁)疑诊病毒性脑炎的脑静脉窦血栓1例报道史潍卿,史潍华,王全利中图分类号:R512.3 文献标识码:C 文章编号:1672-1349(2008)03-0369-021 资 料病人,男性,47岁,因头痛1d于2007年2月6日就诊,为持续性全头胀痛,晨起后感恶心,无呕吐。
此前半月常感全身发冷,无发热。
出现症状前日饮酒(折合纯酒精200mL)。
体温37.2℃,咽红,扁桃体Ⅱ度肿大,神经系统查体未见异常。
脑电图背景正常,各区较多5Hz～7Hz中高波幅θ波,白细胞计数正常。
予左旋氧氟沙星治疗,次日头痛减轻,无恶心,下午头痛消失,但咽痛,左侧显著。
体温37℃,白细胞计数、淋巴细胞稍高,凝血指标:血浆凝血酶原时间(PT)9.25s,部分凝血活酶时间(APTT)43.9s,纤维蛋白原34g/L。
此后体温波动在37.5℃～38.0℃,无明显头痛。