流式微球技术检测血小板膜糖蛋白自身抗体的方法建立及临床价值
流式细胞技术在血小板研究中的应用
流式细胞技术在血小板研究中的应用血小板在各种诱导剂作用下释放其颗粒内容物，产生生物学效应，在初期止血过程中发生粘附-变形-释放-聚集等反应，这些血小板的基本反应，统称为血小板活化反应。
血小板活化的检测对血小板相关疾病的诊断有重要价值。
然而，检测的方法常常是有争议的，通常是由于方法本身不完善或应用不当导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。
这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板活化的方法。
近几年来，随着流式细胞技术（Flow cytometry，FCM）的发展，FCM已广泛应用于基础与临床研究，并逐渐成为检测血小板活化的重要手段。
现就FCM检测血小板活化的方法及临床应用作一综述。
一、活化血小板标记物活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物。
主要包括三类：1、第一类是血小板质膜表面糖蛋白（1）GPⅡb/Ⅲa（CD41-CD61）它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来，因此，使用其荧光单抗，就能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。
（2）GPIb-IX-V （CD42）则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低。
可以作为活化血小板的分子标志。
（3）GPIV （CD36）虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高，也可以作为血小板活化标志。
（4）另外还有GPⅠc/Ⅱa（CD49e-CD29）、GPⅠa/Ⅱa（CD49b-CD29）等与血小板活化有关。
2、第二类是血小板颗粒膜糖蛋白主要包括血小板α-颗粒膜蛋白（GMP-140，CD62）和溶酶体完整膜蛋白（LIMP，CD63）。
血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。
3、第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原包括纤维蛋白原，Xa因子等，这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。
流式细胞术在血小板检测中的应用于方法介绍
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Flow Cytometry
June 2000
血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析
前言 血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细 胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和 反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及 治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。 使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是： 检测血小板的反应性。 了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到 血小板外。 同时检测多种血小板表面标志。 高度灵敏。 直接检测血小板的多种标志。 使用全血，标本量少。 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。
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Flow Cytometry
June 2000
附：BDIS 血小板活化试剂
BD 抗体： CD PAC-1 CD62P CD61 Isotype 1 CaliBRITE 3 Ig Subclass IgM IgG1 IgG1 Form FITC PE PerCP PE Unlabeled,FITC,PE,PerCP Catalog No. 340507 348107 340506 340013 340486 Tests 50 100 50 25g 25
流式细胞仪检测全血中血小板功能状态 全血中血小板更接近生理状态 操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变（如血小板活化试验） 同时检测血小板的多个标志物，结合 FSC 和 SSC，评估多个参数，进行定量分析 多采用血小板特异抗体 CD41 或 CD61 画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰 检测血小板亚群灵敏度高 用血量少 无放射性污染
急性脑梗死患者血小板膜糖蛋白及血小板激活复合物的检测及临床价值 卢春晟 李勇琴
急性脑梗死患者血小板膜糖蛋白及血小板激活复合物的检测及临床价值卢春晟李勇琴摘要】目的：探讨急性脑梗死(ACI)患者血小板膜糖蛋白CD62p、CD63、PAC-1测定的临床价值。
方法：用流式细胞术，以单克隆抗体为分子探针，对30例急性脑梗死患者和30例健康对照者外周血血小板膜糖蛋CD62p、CD63、PAC-1的表达量进行检测。
结果：ACI患者CD62p、CD63、PAC-1的表达水平明显高于正常对照组，均P<0.01有统计学意义，CD62p、CD63、PAC-1的表达水平与ACI密切相关。
结论：CD62p、CD63、PAC-1作为血小板活化的分子标志物，为ACI的诊断及预测病情发展提供重要参考依据。
【关键词】急性脑梗死 CD62p CD63 PAC-1【中图分类号】R543 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）11-0170-01脑梗死是由于栓子阻塞了脑的血液供应，致脑组织缺血缺氧坏死，失去了正常的神经功能。
其病理基础是血栓形成，血小板的活化、黏附和聚集在病理的血栓形成过程中起着重要作用[1]。
为了解急性脑梗死患者血小板膜糖蛋白及血小板激活复合物表达水平变化，本文分析研究30例急性脑梗死住院患者的CD62p、CD63、PAC-1，并探讨其临床价值。
1 资料与方法1.1 一般资料为本院神经内科2011年12月至2012年12月收治的脑梗死患者共30例，其中男19例，女11例，年龄46-77岁。
均于发病72小时内入院，入院前2周内均未服用影响血小板功能的药物，患者均有神经功能缺损的临床体征，并均经头颅计算机体层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)证实。
对照组为30名为健康体检者，其中男21名，女9名，年龄45-79岁，无心、脑血管病、糖尿病及血液病。
1.2 检测方法应用美国Becton-Dickinson公司生产的Calibur流式细胞仪，试剂为PE标记的人CD62p、CD63抗体及FITC标PAC-1。
应用流式细胞术检测血小板抗体的临床研究
Ｌ ｂＭｅ ｌ ， ｃｍｂ ｒ ０ ０ Ｖｏ． ， ｏ ２ ａ ｄＣｉ Ｄｅｅ ｅ １ ， １７ Ｎ ． ３ ｎ ２
应 用 流 式 细 胞 术 检 测 血 小 板 抗 体 的 临 床 研 究
颉晓玲 ， 晓芸 ， 杜 张 炜 ， 晓薇 ， 张 赵 丽△（ 兰州 大学 第一 医院 中心 实验 室 ７ ０ ０ ） ３ ０ ０
ａ — ｉ ＺＨＡＯ ． ｅ ｔａ ｂ ｒ ｔｒ Ｆｉｓ Ｈｏｐｉａ ｆ ａ ｚ ｏ ｉｅｓｔ Ｌ ｎ ｈ ｕ７ ０ ０ ， ｈ ｎ ｏｗｅ ， Ｌｉ Ｃ ｎｒ ｌ Ｌａ ｏ ａ ｏｙ， ｒｔ ｓ ｔｌｏ Ｌ ｎ ｈ ｕ Ｕｎｖ ｒｉ ｙ， ａ ｚ ｏ ３ ０ ０ Ｃ ｉａ ［ ｓｒ ｃ］ ０ｂｅ ｔ ｅ Ｔｏｉｖ ｓｉａｅｔ ｅｃ ａ ｇ ｆｐａｅｅ—ａ ｓ ｃａｅ ｇ Ｐ ｇ Ａｂ ｔａ ｔ ｊｃｉ ｖ ｅ ｔ ｔ ｈ ｈ ｎ ｅｏ ｌｔｌｔ ｓｏ ｉｔｄＩ Ｇ（ ＡＩ Ｇ）ｉ ｄｏ ａｈｃｔ ｒ ｍｂ ｃ ｔ — ｎ ｇ 。 ｎ ｉｉｐ ｔ ｉ ｈ ｏ ｏ ｙｏ－
【 键 词 】 血 小板 自身 抗体 ； 特 发 性 血 小板 减 少性 紫癜 ； 流 式 细 胞 术 关
Ｄ０Ｉ １ ． ９ ９ Ｊ ｉｓ ． ６ ２９ ５ ． ０ ０ ２ ． ０ ： ０ ３ ６ ／．ｓｎ １ ７ — ４ ５ ２ １ ． ３ ０ ６
中图分类号 ：４６１３ Ｒ ４ ． １
ｐ ｎｅｐ ｒ ｕ ａ Ｉ ｅ ｉ ｕ ｐ ｒ （ ＴＰ）ａ ｄ ｉｓ ｓｇ ｉ ｃ ｎ ｅ ｉ ｈ ｉｇ ｏ ｉ ａ ｄ ｔ ｅ ｔ ｅ ｔ Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｔｈ ｌ ｗ ｙ ｏ ｔｙ（ ＣＭ ） ａ ｄ ｎ ｔ ｉ ｎｆ ａ ｃ ｎ ｔ ｅ ｄ ａ ｎ ｓｓ ｎ ｒ ａ ｍ ｎ ． ｉ ｔｏ ｓ ｅｆ ｏ ｃ ｔ ｍｅ ｒ Ｆ ｎ
应用流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白
应用流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白
徐杰
【期刊名称】《中国小儿血液与肿瘤杂志》
【年(卷),期】1997(002)005
【摘要】为检测血小板膜糖蛋白，本文建立了用流式细胞仪检测血小板膜表面糖
蛋白ＧＰＩ６－Ⅸ，ＧＰⅡ６－Ⅲａ及活化血小板颗粒膜蛋白（ＧＭＰ－１４０）的方法，并用于诊断１例血小板无力症。
结果表明：流式细胞仪是一种快速、简便、灵敏检测血小板膜糖蛋白的方法，为临床诊断血小板功能缺陷性疾病及血小板膜糖蛋白功能的研究提供了一种新的方法。
【总页数】4页(P216-219)
【作者】徐杰
【作者单位】苏州医学院附属儿童医院;苏州医学院血栓与止血研究室
【正文语种】中文
【中图分类】R558.04
【相关文献】
1.流式细胞仪检测HLA-B27抗原在强直性脊柱炎诊断中的应用效果 [J], 王妍;
2.流式细胞仪检测HLA-B27在强直性脊柱炎筛查中的应用及分析 [J], 卢峰;上官
莉娟;陈涛;王钢;李甫罡;罗志刚;郭晓兰
3.应用流式细胞仪检测强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原的表达及临床应用价值[J], 赵建强;李世荣;马金栋;王云增;毛有彦
4.流式细胞仪检测HLA-B27抗原在强直性脊柱炎诊断中的应用效果 [J], 王妍
5.流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白 [J], 徐杰;王爱青
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流式细胞术筛查血小板抗体方法的建立及应用
流式细胞术筛查血小板抗体方法的建立及应用目的建立一种用流式细胞术筛查血小板抗体的方法，并将其应用于临床治疗中。
方法将78例需进行血小板抗体检测的患者进行AB两组试验，分别用常规处理法和流式细胞术来进行检测，观察两组的检测结果。
结果A组的检出率为25.65%，而B组的检出率为35.90%，相比而言，B组的检出率明显高于A组，而且检测的时间也要短于A组，但是两者的阳性率无明显差异。
经检测，B组中还发现有10例含抗HLA抗体，有1例含抗HPA-5b抗体，有9例为自身抗体。
结论对于筛查血小板的抗体，流式细胞术的建立以及应用为临床治疗提供了很大的便利，该方法不仅检测速度快，操作简单，还实现了标准化，非常适用于临床检测。
标签：流式细胞术；血小板抗体；方法建立；临床应用通过对常规处理法和流式细胞术的比较来具体探讨流式细胞术在临床检测中的应用与效果，并作如下分析。
1 资料与方法1.1 一般资料选择2016年本市医院的共100例血小板患者的资料，对不同年龄，不同症状的患者进行检查，针对血小板来进行针对性检查。
患者均无其他相关疾病，并且满足了患者检测的相关标准，保证了医院数据处理中的准确性。
且并未注射激素或进行免疫性抑制等治疗。
将患者进行AB两组不同的检测试验。
1.2 方法所有患者均在本省同一家医院内进行治疗，A组采用常规处理法，即经典酶联免疫吸附试验（ELISA），B组采用流式细胞术（FCM）。
（1）制备样本：采取的静脉血应该在15毫升以上，然后放入抗凝试管中，防止血液凝固。
15 ml血液中13 ml用于血小板自身抗体检测试验盒检测，即ELISA，用离心法分离血小板，之后进行冷却。
剩余的2 ml用于流式细胞术（FCM）检测。
（2）经典酶联免疫吸附试验（ELISA）技术检测：按照使用说明书来进行检测。
（3）流式细胞术（FCM）技术检测：将2 ml周血600转离心，得1 ml上清，加入1 ml多聚甲醛（2%）混匀，2000转离心，弃上清，加入2 mlPBS洗涤，2000转离心，弃上清，加入2 mlPBS重悬备用，取100 ul重悬液与20 ulCD41-PE（北京旷博生物技术股份有限公司）混匀，孵育20分钟后上机检测。
流式细胞术检测血小板相关抗体诊断原发免疫性血小板减少症的价值
流式细胞术检测血小板相关抗体诊断原发免疫性血小板减少症的价值肖平;吴祖常【摘要】Objective To investigate the clinical significance of platelet-associated immunoglobulin(PAIg) detected by flow cytometry(FCM) in the diagnosis of primary idiopathic thrombocytopenia(ITP).Methods The expressing level of PAIg (PAIgG,PAIgM,PAIgA) was detected by FCM in 50 newly diagnosed patients with primary ITP,92 patients with secondary immune thrombocytopenia(sITP) and 31 healthy controls.Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis was used to determine the optimal cutoff value .Results The expressing levels of PAIgG ,PAIgM and PAIgA in newly diagnosed ITP patients were significantly higher than those in sITP group and health controls (P<0.01).The expressing levels of PAIgM and PAIgA in sITP group were significantly higher than health controls (P<0.05),but there was no significant difference in PAIgG(P>0.05).The optimal cutoff values of positivity of PAIgG,PAIgM and PAIgA for the discrimination of ITP and non-ITP were 5%,7%and 4%,respectively ,and the sensitivity and specificity of a positive PAIgM individual test for ITP were 72.0%and 73.2%,respectively,which were higher than those of PAIgG (60.0%,67.5%).There were the highest specificity(88.6%) and the lowest sensitivity(48.0%) in PAIgA.The sensitivity of PAIgG plus PAIgM test was 78.0%, higher than that of PAIgM or PAIgG test alone .The specificity of PAIgM plus PAIgG test was 66.7%,lower than that of PAIgM or PAIgG testalone .Conclusion PAIg detection is valuable in differential diagnosis ofITP .The diagnostic value of PAIgM combined with PAIgG is better thanthat of PAIgM or PAIgG alone .%目的：探讨流式细胞术（FCM）检测血小板相关抗体（PAIg）在诊断原发免疫性血小板减少症（ITP）的价值。
血小板自身抗体的流式细胞检测与意义
ｔａ ｔｂｏ ｏ ｎ ｉ ｄｙ， ｎｄ ｈａ ｅ ｔｒｐ ｔ ｎｉｌｔ ａ ａ ｓ ｂ ｔｅ ｏ ｅ ｔａ ｈ ｎ ＥＬＩ Ａ． Ｓ
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医 研 杂 ２ ８ １ 第３卷 第１期 学 究 志 ０ 年１月 ０ ７ １
・ 论
善 ・
血 小 板 自身 抗体 的流 式 细 胞 检 测 与 意义
吴蓓 倩 朱 萍 牛 强 陈 字 谢
摘
值 。方 法
毅
要 目 的
应 用 流 式 细 胞 仪 （ Ｃ 检 测 血 小 板 抗 体 ， 究 其 正 常 参 考 值 及 对 特 发 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 （Ｔ ） 断 的 价 Ｆ Ｍ） 研 ＩＰ 诊
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pr og no stic parameter s fo r chronic myelomonocy tic leukemia[ J] .Blo od , 2002 , 100 :731 -733. [ 7] K R GER N , ZA BELIN A T , G U A RD IO LA P , et al.
Key words pur pura thr ombocyto penia ;idiopathic ;cy tometry bead ar ray ;autoantibody
特发性血小板减少性紫癜(IT P)是一种常见的 血液系统疾病 , 是由机体免疫机制尤其是体液免疫 紊乱引起的以血小板减少为主的出血性 疾病 。 研 究表明 , 血小板自身抗体主要是针对血小板膜表面 糖蛋白 Ⅱb ～ Ⅲa(GP Ⅱb ～ Ⅲa)、膜糖蛋白 Ⅰ b(GP Ⅰb)、膜糖蛋白 Ⅸ (GP Ⅸ )抗原 产生相应的血小板 抗体〔1〕 , 相应血小板抗体结合到血小板表面 , 引起 血小板致敏 , 从而被单核-巨 噬系统破坏 。 同时血 小板相关抗体也可与巨核细胞结合 , 影响其发育和 分化 , 抑制血小板产生 , 使血小板减少 , 引起患者出 血 。 检测血小板膜糖蛋白特异性自身抗体的方法 主要有单 克 隆抗 体 俘获 血 小板 抗原 技 术(MA IP A)、放射免疫微球法等 , 此类方法虽然阳性率高 , 但敏感性较低 , 检测方法繁琐 , 耗时长 , 限制了临床 上的广泛应用〔2〕 。 流式微球技术(cy t omet ri c bead array , CBA)是在流式细胞术的基础上发展起来的 新技术〔3〕 。 它以聚苯乙烯微球为反应界面 , 特异性 单克隆抗体包被微球后即可俘获一些小分子物质 , 使检测信号得以放大 , 通过对微球进行检测 , 即可 检测相应的小分子物质〔4〕 。近年来 , CBA 正越来越 多地应用于血清 、血浆和培养细胞上清等各种液相 中可溶性蛋白及细胞因子的检测〔5〕 。
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Journal of Clinical H emat ology , M ay 2010 , V ol 23 N o 5
g ro up ;1.20 o n G P Ⅱ b/ Ⅲ a (rang e 0 .32～ 3 .04), 1.302 on G P Ⅰ b/ IX (range 0.33 ～ 3.56)in non-immune thro mbo cyto penic g roup ;0 .96 o n GP Ⅱ b/ Ⅲ a (r ang e 0 .23 ～ 2.28), 0 .97 o n GP Ⅰ b/ IX (range 0.22 ～ 2.13)in the health contr ols.T he mea n r atio o f two kinds of autoantibodies in I T P g roup w as significantly higher than tho se of the non-immune thrombocy tope nic g roup o r the no rmal contr ol g roup (P <0.01).If the up limit of health co ntr ols w ere set a s cutoff , G P Ⅱ b/ Ⅲ a ra tio ov er 2.025, G P Ⅰ b/ I X ratio ove r 2 .12 w ere conside red positive .Cy to metric bead ar ray had a sensitiv ity o f 97.0%, specificity w as 81.5%, and positive pr edic tive value was 84.4% fo r the diagno sis o f IT P .Conclusion:T he w ay o f flow cy tometric bead to de tect platele t-associate autoantibodies can be cha racterized a s simplity , g ood reproducibility and hig h stability , which has high sensitiv ity , specificity and po sitive predictiv e value in IT P diagnosis.
[ 4] X U Y , M CK EN NA R W , K A RA ND IKA R N J, et a l.
F low cy tometric analy sis of monocy tes a s a too l for
distinguishing chronic myelomonocy tic leukemia from reactive monocy tosis[ J] .A m J Clin Pathol , 2005, 124 : 799-806 . [ 5] K OJIM A H , BAI A , M U K AI H Y , et al.Chro nic myelomo no cytic leukemia derived f rom a possible co m-
临床血液学杂志 2010 年 5 月第 23 卷第 5 期
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流式微球技术检测血小板膜糖蛋白自身 抗体的方法建立及临床价值 ＊
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[ 摘要] 目的 :建立流式微球技术检测血小板 膜表面 糖蛋白(G P Ⅱ b/ Ⅲ a 和 GP Ⅰ b/ IX)特异 性自身 抗体的 方法 , 并评价 其对特 发性血 小板减 少性紫 癜(IT P)的诊断价 值及临 床意义 。 方 法 :应用抗 人血小 板 G P Ⅱ b/ Ⅲ a (CD41a)、G P Ⅰ b/ IX(CD42b)单抗包被微球 , 将 血小板从待测血液样 本中分离 并裂解 , 血 小板裂解 后与包 被好的 微球共同孵育 , 加入 P E 标 记的羊抗人 IgG 多克隆抗体 , 上机检测 , 流式 细胞仪分 析 I T P 组和非免 疫性血 小板减 少组患者自身抗体表达情况 。 将所测样本的平均荧光强度 值(M F I)与正常 对照(3 个不同正常 人血样)M F I 的均 值进行比较 , 计算其比率 。 结果 :IT P 组 该比 率均 值及 范围 :G P Ⅱ b/ Ⅲ a :6 .52(0.22 ～ 30 .20), G P Ⅰ b/ IX :6.13 (0.56～ 22.00);非免疫性血小板减少组为 :G P Ⅱ b/ Ⅲ a :1.20(0 .32 ～ 3.04), GP Ⅰ b/ IX :1 .302(0 .33 ～ 3.56);正常 对照组比率均值及范围为 :GP Ⅱ b/ Ⅲ a :0 .96(0.23～ 2 .28), G P Ⅰ b/ IX :0.97(0 .22～ 2 .13)。 IT P 组 2 种 自身抗体 荧光强度比率明显高于非免疫性血小板 减少组和正常对照组(均 P <0.01)。 以正 常对照组 上限作为界 值 , G P Ⅱ b/ Ⅲ a 比率大于 2.025 、G P Ⅰ b/ I X 比率大于 2 .12 定为 阳性 , 则该方 法对 IT P 诊断 的敏感 性为 97.0 %, 特 异性为 81.5 %, 阳性预测值为 84 .4 %。 结论 :应用流式微球技术对多种血小板膜 糖蛋白自身 抗体联合 进行检测 , 方法操 作简单 , 重复性好 , 稳定性高 , 对 I T P 的敏感性 、特异性较高 , 可应用于 IT P 患者血小板膜糖 蛋白自身抗 体的实验 室检测 , 对 IT P 的诊断具有重要的临床应用价值 。
A llo geneic stem cell transplantatio n of adult ch ronic my elo monocytic leukaemia.A repo r t o n beha lf of the