Ssp DnaB蛋白介导的精氨酸激酶N末端和C末端结构域的表达与纯化
Smad蛋白调控角膜新生血管发生发展的研究进展
欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式：曾澳，闫语，王淑荣，张妍，何宇茜．Ｓｍａｄ蛋白调控角膜新生血管发生发展的研究进展［Ｊ］．眼科新进展，２０２２，４２（１）：７５ ７８．ｄｏｉ：１０．１３３８９／ｊ．ｃｎｋｉ．ｒａｏ．２０２２．００１７【文献综述】Ｓｍａｄ蛋白调控角膜新生血管发生发展的研究进展△曾 澳 闫 语 王淑荣 张 妍 何宇茜欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者简介：曾澳（ＯＲＣＩＤ：００００ ０００１６２６８ ６９５８），男，１９９９年１１月出生，湖南娄底人。
主要研究方向：角膜病。
Ｅ ｍａｉｌ：１０１８７７５０２９＠ｑｑ．ｃｏｍ通信作者：何宇茜（ＯＲＣＩＤ：００００ ０００１ ５８０２ ８０６３），女，１９８９年７月出生，吉林松原人，博士。
主要研究方向：角膜病。
Ｅ ｍａｉｌ：ｈｅｙｕｘｉｈｏｔ＠１６３．ｃｏｍ收稿日期：２０２１ ０１ ２２修回日期：２０２１ ０９ ３０本文编辑：盛丽娜△基金项目：吉林省科技厅国际科技合作项目（编号：２０２００８０１０１６ＧＨ）；吉林省科技厅自然科学基金（编号：２０１８０１０１１４６ＪＣ）作者单位：１３００４１ 吉林省长春市，吉林大学第二医院眼科中心（曾澳，闫语，王淑荣，张妍，何宇茜）；１３００２１ 吉林省长春市，吉林大学白求恩医学部（曾澳，闫语）【摘要】 角膜新生血管（ＣＮＶ）是一种严重的致盲性病理改变，与多种眼表疾病的发生发展密切相关。
在ＣＮＶ发生发展过程中，多种蛋白参与调控。
研究表明，Ｓｍａｄ蛋白可通过多种信号通路影响ＣＮＶ的发生发展。
本文就近年来Ｓｍａｄ蛋白调控ＣＮＶ发生发展的研究进展作一综述。
【关键词】 Ｓｍａｄ蛋白；角膜新生血管；转化生长因子 β；骨形态发生蛋白；茎细胞；尖细胞【中图分类号】 Ｒ７７２．２角膜受到不利因素的刺激时，可通过产生角膜新生血管（ＣＮＶ）来加强角膜的免疫防御功能，并且促进角膜的愈合。
细胞周期调控的研究进展(精)
细胞周期调控的研究进展高燕,林莉萍,丁健 *(中国科学院上海生命科学研究院药物研究所,国家新药研究重点实验室,中国科学院研究生院,上海 201203摘要 :细胞周期是一种非常复杂和精细的调节过程,有大量调节蛋白参与其中。
此过程的核心是细胞周期依赖性蛋白激酶 (CDKs。
CDKs 的激活又依赖于另一类呈细胞周期特异性或时相性表达的细胞周期蛋白 (cyclins,而 CDKs 调节的关键步骤是细胞周期检查点。
PLKs 是多种细胞周期检查点的主要调节因子, Aurora 蛋白激酶主要在细胞有丝分裂期起作用。
本文就上述因素在细胞周期进程中的作用作一综述。
关键词 :细胞周期;调控;细胞周期检查点中图分类号:Q253文献标识码:AA review: cell cycle regulationGAO Yan, LIN Li-Ping, DING Jian*(State Key Laboratory of Drug Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Shanghai Instituesfor Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Graduate School of the ChineseAcademy of Sciences, Shanghai 201203, ChinaAbstract: The cell cycle is a complex and elaborate process involving numerous regulatory proteins as directors.Central to this process are the cyclin-dependent kinases (CDKs, which are activated in a cyclin-dependentmanner at special points of the cell cycle. Cyclin protein levels rise and fall during the cell cycle and in the waythey periodically activate CDKs. Furthermore, the cell cycle checkpoint is also discussed as a key process inthe regulation of CDKs. PLKs are important mediators for various cell cycle checkpoints, while Aurora kinaseshave emerged as essential regulators of cell division. Here, we reviewed the effects of above factors on cellcycle regulation.Key words: cell cycle; regulation; cell cycle checkpoint收稿日期 :2005-01-22; 修回日期 :2005-03-09作者简介 :高燕 (1974— ,女,博士研究生;林莉萍 (1962— ,女,博士,副研究员;丁健 (1953— ,男, 研究员,博士生导师, *通讯作者。
.蛋白质的结构与功能
三、蛋白质的三级结构（tertiary structure）
（二）氨基酸的分类
1．按R基的化学结构分为脂肪族、芳香族、杂环、杂环亚氨基酸四类 。
2．按R基的极性和在中性溶液的解离状态分为非极性氨基酸、极性不 带电荷、极性带负电荷或带正电荷的四类。 带有非极性R（烃基、甲硫基、吲哚环等，共9种）：甘（Gly）、丙 （Ala）、缬（Val）、亮（Leu）、异亮（Ile）、苯丙（Phe）、甲硫 （Met）、脯（Pro）、色（Trp） 带有不可解离的极性R（羟基、巯基、酰胺基等，共6种）：丝（Ser） 、苏（Thr）、天胺（Asn）、谷胺（Gln）、酪（Tyr）、半（Cys） 带有可解离的极性R基（共5种）：天（Asp）、谷（Glu）、赖（Lys ）、精（Arg）、组（His），前两个为酸性氨基酸，后三个是碱性氨 基酸。
（一）氨基酸的结构通式
组成蛋白质的20种氨基酸有共同的结构特点 ：
1．氨基连接在α- C上，属于α-氨基酸（脯氨 酸为α-亚氨基酸）。
2．R是側链，除甘氨酸外都含手性C，有D型和L-型两种立体异构体。天然蛋白质中的 氨基酸都是L-型。
注意：构型是指分子中各原子的特定空间排布，其变化要 求共价键的断裂和重新形成。旋光性是异构体的光学活性 ，是使偏振光平面向左或向右旋转的性质，（-）表示左 旋，（+）表示右旋。构型与旋光性没有直接对应关系。
20世纪30年代末，L.Panling 和R.B.Corey应用X射线衍射分 析测定了一些氨基酸和寡肽的晶体结构，获得了一组标准 键长和键角，提出了肽单元（peptide unit）的概念, 还提出 了两种主链原子的局部空间排列的分子模型（α-螺旋）和 （β-折叠）。
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测徐岚;肖斌;陈慧芹;李晓荣;郝文波【摘要】The objective of this work is to construct a eukaryotic expression vector for the C-Src tyrosine kinase(Csk)gene from human. Total RNA was extracted from HeLa cells. The full-length cDNA sequence of Csk gene was isolated and amplified via RT-PCR,and cloned into a eukaryotic expression vector pENTER,the recombinant pENTER-Csk-his plasmid was constructed. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells,after 48 hours,the expression levels of Csk protein were determined by SDS-PAGE and Western blot. The localization of Csk protein was detected via indirect immunofluorescence,and the protein Csk was purified by nickel chelate beads;in addition,the activity of the protein was measured via his-pulldown and CO-IP. Results showed that:Double digestion and sequencing reveled that recombinant plasmid pENTER-Csk-his was constructed properly without mutation. Both SDS-PAGE and Western blot detected a 51 kD protein,indicating that Csk protein was expressed successfully in the 239T cells. The indirect immunofluorescence confirmed the expression of Csk protein in cytoplasm. Finally,the purified protein Csk by nickel chelate beads interacted with the IGF1R and SHC1 by his-pulldown and CO-IP. Conclusively,this study successfully acquired the full-length sequence of Csk,the eukaryotic expression vector pENTER-Csk-his was constructed,and the gene was expressed efficiently in 293T cells,moreover,the expressed protein presented bioactivity.%旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表达系统。
氨基酸残基的侧链修饰
生化课件整理之——氨基酸残基的侧链修饰（~~by luckyboy）一.精氨酸Arginine甲基化Methylation精氨酸的三个甲基化衍生物（Nω-methyl- Nω, N ω-dimethyl-, and Nω, Nω`,-dimethyl-）常出现于一些蛋白质当中，主要是核苷酸结合蛋白，例如：组蛋白，核仁蛋白，髓磷脂碱性蛋白，甲基化的功能还没有完全研究清楚磷酸化PhosphorylationN?-磷酸精氨酸也常出现在髓磷脂碱蛋白中，一种鼠肝DNA结合的精氨酸特异性蛋白激酶，它磷酸化它自身和一个11-kDa的染色体结合蛋白ADP-核糖基化ADP-ribosylation（有一种催化ADP 核糖基化的酶）1. Nω-ADP-核糖基化精氨酸(? and ?异头物) 常出现在细菌肠毒素、霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素等蛋白质的修饰中2. 脊椎动物的精氨酸特异核糖基转移酶是常见的ADP-核糖基化水解酶3. 第三类精氨酸特异的核糖基转移酶是由噬菌体编码的瓜氨酸Citrulline由精氨酸残基衍生化而成，多见于头发和皮肤蛋白中。
鸟氨酸Ornithine可能也是有精氨酸衍生而来，被发现于一种洋芋中的不常见的富羟脯氨酸糖蛋白凝集素中戊糖素PentosidinePentosidine是由精氨酸残基的侧链和被氧化的糖基化的赖氨酸衍生物结合形成的二.天冬酰胺Asparagine一、糖基化Glycosylation（一）结构：其中一种最常见的细胞膜胞外区域、分泌体和溶酶体蛋白的翻译后修饰是天门冬酰胺侧链糖基化（N-连接糖基化），?-N-乙酰葡糖胺作为连接单元连接到N原子上绝大多数聚糖的结构都已经被确定，它们大多数都存在于三种结构类型：高甘露糖型、复杂型和杂合型。
在糖蛋白中发现的常见单糖部分在下图中列出：1、真核生物中A.a.移多萜酰连接的前体糖基的转移：Glc3-Man9-GlcNAc2-到序列-Asn-Xaa-（Ser或Thr）-的天冬酰胺侧链上，其中Xaa可以是除脯氨酸外的其它任何一种氨基酸b.聚糖链的依次添加成熟的过程包括去除葡萄糖单元和在大多数情况下除去甘露糖残基，紧接着添加岩藻糖、半乳糖，N-乙酰葡萄糖胺和铝硅脂酸，有时也加入其它糖类化合物、磷酸盐和硫酸盐B.，具体怎样产生特异性的精确聚糖链结构还不是很清楚：a.不是所有的胞外的Asn-Xaa-(Ser or Thr)的天门冬酰胺残基都被糖基化b.在许多糖蛋白中是不均一性的，由于一些分子携带了比其它分子更多的糖基侧链；糖基结构上一般也有微不专一性，但是一个特异性位点主要携带单一种类糖基侧链。
极光激酶A在肿瘤形成中的机制研究进展
极光激酶A在肿瘤形成中的机制研究进展翁泽安【摘要】Aurora-A(极光激酶A)是一种高度进化保守蛋白激酶,在肿瘤细胞形成过程中发挥重要的调控作用.人体多种实体肿瘤均发现Aurora-A的过表达,高表达的Aurora-A通过多种分子机制参与肿瘤的生存、增殖,而且Auro-ra-A的表达水平与肿瘤患者的药物抵抗和不良预后呈正相关.本文介绍了Aurora-A的结构和亚细胞定位、活化和降解的具体途径,本文着重阐述Aurora-A促进肿瘤形成的分子机制,从而为肿瘤的药物治疗提供新的治疗靶点.【期刊名称】《湖北民族学院学报（医学版）》【年(卷),期】2017(034)004【总页数】5页(P65-68,71)【关键词】Aurora-A;蛋白激酶;肿瘤形成【作者】翁泽安【作者单位】三峡大学人民医院宜昌市第一人民医院湖北宜昌443000【正文语种】中文【中图分类】R737.33极光激酶A(Aurora-A)是高度进化保守的丝/ 苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，在细胞有丝分裂和肿瘤形成过程中发挥重要的调控作用。
Aurora激酶是在研究果蝇过程中首次被发现[1]，目前研究证实，在哺乳动物的细胞中，至少存在Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C三种Aurora激酶[2]。
前期研究证实，Aurora-A在细胞有丝分裂过程中发挥关键的作用。
Aurora-A主要调控中心体和微管的功能，主要涉及中心体的复制和分离，纺锤体的组装，染色质的凝聚，G2-M期的转换以及细胞质的分裂[3]。
下调Aurora-A的表达可导致纺锤体组装和染色体分离的障碍，最终导致基因的不稳定和肿瘤形成[4]。
在机体多种肿瘤中均发现Aurora-A的过表达，如乳腺癌，胃癌，卵巢癌，食管癌，结肠直肠癌等，这暗示Aurora-A可能在肿瘤形成中发挥重要作用。
Aurora-A的过表达可能和肿瘤患者的不良预后有关，因此有可能成为新的治疗靶点[5]。
本文从Aurora-A的结构和亚细胞定位，Aurora-A活化和降解的调节等方面就Aurora-A在肿瘤细胞的表达和促进肿瘤形成的途径进行综述。
备课素材：组蛋白修饰-高一下学期生物人教版必修2
组蛋白修饰2019版高中生物学必修二说，DNA组蛋白修饰也会影响基因的表达：那么，什么是组蛋白修饰？如何影响基因的表达？天然的DNA分子很长，尤其是在真核生物中，例如人类的DNA长度为2m（Bloom et al., 2010）。
将如此庞大的遗传信息放入7μm 左右的细胞核中，就需要将长DNA分子包装成更紧凑、更致密的高度压缩结构。
这个结构叫做染色体，染色体是染色质高度螺旋后的形态。
染色质的基本组成结构单位是核小体，因此参与核小体装配的组蛋白是决定染色质包装程度的重要因素之一。
图1 核小体结构。
简单来说，核小体由H2B、H2A、H3、H4四种组蛋白（Histone）亚基各两个拷贝形成的八聚体和缠绕在外约146bp的DNA组成（图1）。
其中组蛋白N端（尾部）的氨基酸残基易受到翻译后修饰（PTM），包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等组蛋白修饰（图2）(Kouzarides et al., 2007)。
近年来随着检测技术的进一步成熟，发现组蛋白的中间肽段位置以及C端也会被特异性修饰。
这些修饰以不同的方式影响染色质的紧密度和可及性，从而影响基因的表达，最终影响生物各方面的生理和发育过程，是真核生物调节基因表达最重要的表观遗传调控方式之一(Lawrence et al., 2016)。
由于组蛋白修饰的类型众多，回顾一下组蛋白修饰的描述规则：组蛋白结构+氨基酸名称+氨基酸位置+修饰类型。
例如：H3K4ac代表H3组蛋白的第4位赖氨酸的乙酰化；H2AK119ub1代表H2A组蛋白的第199位赖氨酸的单泛素化。
图2 显示组蛋白尾部翻译后修饰的示意图(Lawrence et al., 2016)。
数字显示每个修饰的位置，字母表示每个修饰位点的氨基酸（K=赖氨酸，R=精氨酸，S=丝氨酸，T=苏氨酸）。
颜色展示了每个氨基酸残基具体的修饰类型（绿色=甲基化，粉色=乙酰化，绿松石=磷酸化，米色=泛素化）。
组蛋白修饰是目前生命科学研究的热点。
焦亡在肿瘤治疗中作用的研究进展
在乳腺 癌 （ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ，ＢＣ）中，ＧＳＤＭＥ表 达 水 平 与 雌 激素受体（ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＲ）状态密切相关，ＥＲ阳性的乳 腺癌细胞往往表现为 ＧＳＤＭＥ基因的高甲基化并且与 ＢＣ淋 巴结转移正相关［１８－１９］。但最近有研究报道，ＥＲ阳性的ＭＣＦ－７ 乳腺癌细胞中仍具有较高水平的 ＧＳＤＭＥ表达，敲减 ＧＳＤＭＥ 可以显著抑 制 ＭＣＦ－７细 胞 焦 亡 并 降 低 其 对 ＰＴＸ的 敏 感 性［２０］。二十二碳六烯酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃａｃｉｄ，ＤＨＡ）是一种
超过 ９０％的宫颈癌（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ，ＣＣ）与人类乳头瘤 病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）感染有关。在感染 ＨＰＶ的 ＣＣ细胞中，ＡＩＭ２通 过 促 进 焦 亡 来 发 挥 抑 癌 作 用［２４］。 丹 参 酮ⅡＡ是激活 ＨｅＬａ细胞焦亡的重要因子。经丹参酮ⅡＡ处 理后，ＨｅＬａ细胞中 ＧＳＤＭＤ、ｍｉＲ－１４５、ＩＬ－１８及 ＩＬ－１β的 表达均增加，敲减 ｍｉＲ－１４５后，丹参酮ⅡＡ诱导的 ＨｅＬａ细 胞焦亡减少，表明在 ＨｅＬａ细胞中，丹参酮ⅡＡ可通过调节 ｍｉＲ－１４５／ＧＳＤＭＤ信号通路促进细胞焦亡 。 ［２５］ ３．４ 焦亡与消化系统肿瘤
此外，其他一些 Ｃａｓｐａｓｅｓ也可以诱导焦亡。在鼠巨噬细 胞中，致病性耶尔森氏菌通过 ＹｏｐＪ途径抑制有丝分裂原激 活的蛋白 激 酶 （ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ，ＭＡＰＫ）和 转化生长因子激酶 １（ＴＧＦ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｎａｓｅ１，ＴＡＫ１），活化 的 Ｃａｓｐａｓｅ－８可切割 ＧＳＤＭＤ和 ＧＳＤＭＥ，从而诱导焦亡。人 外周血单核细胞来源的巨噬细胞中，５ｚ７可抑制 ＴＡＫ１的表 达，阻断 ＬＰＳ诱导的 ＩＬ－１β活化，使得 Ｃａｓｐａｓｅ－８活化并切 割 ＧＳＤＭＥ诱导 细 胞 死 亡，这 个 过 程 没 有 ＧＳＤＭＤ的 参 与。 表明人巨噬细胞中的生存因子能绕过 ＴＡＫ１抑制，诱导的细 胞死亡比鼠巨噬细胞中少［４］。 ３ 焦亡在肿瘤治疗中的意义
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图8 融合蛋白经 PH6.0-7.5,25℃ 处理后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
结果分析 实验结果表明： 1. 通过图1至图5可知，精氨酸激酶N末端 和C末端结构域基因已经位于pET-28a 载体质粒上，等待测序结果，载体的 构建工作已经基本完成。 2. 通过图6测序结果可知，精氨酸激酶N 端结构域载体已确定构建完成。 3. 通过图7至图8可知，虽然获得了N端结 构域，但是浓度较低，需要进一步摸 索条件，以获得浓度较高的N端结构域。 C端结构域载体构建工作还未完成。
1.3 研究意义
蛋白质折叠问题的研究具有重要的生物学意义: 一是可以大大加快对蛋白质空间结构的认识；二是能对恢 复无活性蛋白质的活性起到很好的指导作用；三是能指导 新药物、新蛋白的研制；四是能帮助认识相关疾病的治病 机理，并为寻找有效的治病方法提供理论指导。 精氨酸激酶的折叠机制还尚未完全阐明，本课题通过对精 氨酸激酶两个结构域的折叠机制进行研究，进一步阐明精 氨酸激酶的整个折叠过程，有利于更深刻地掌握精氨酸激 酶结构、性质以及功能之间的相互关系，对了解一般蛋白 质折叠机制具有重要的借鉴意义。
From Genfa Zhou
AK的N端结构域与C端结构域在折叠的过程中的相互 关系到目前还没有明确的论述，两个结构域在各自折 叠时折叠的先后顺序，有无相互作用，以及作用的机 制，是本文的研究目标。
1.2 蛋白质内含子简介 1.2 Ssp DnaB 蛋白质内含子简介
蛋白质内含子(intein)是一类具有自我剪切功能的 多肽，它能将自身从前体蛋白中切出并催化其两 侧的肽链之间形成肽键。 Ssp DnaB是一种小型蛋白质内含子。近年来越来 越多地被应用于多肽融合标签技术以获取小肽药 物（如 人脑纳素、抗病毒多肽、抗肿瘤多肽）。 该方法成本低、效率高，无需采用蛋白水解酶或 化学水解试剂就可得到传统方法难以获得的小型 蛋白质或多肽。
4.后续实验展望
1.优化纯化条件，获取较纯的N-domain和C-domain。 2.研究两个结构域可能的折叠机制，利用内源荧光、 ANS荧光以及紫外差谱等的检测，观察精氨酸激酶N 末端结构域和C末端结构域单独在脲溶液处理下的变 性与复性过程，以及同时变性与复性的过程。 3.提出可能的相互作用的折叠机制。
M 1 2 3
1：质粒pTWIN1 2：质粒pTWIN1经 SapI/PstI 双酶切 3：质粒pTWIN1经 SapI/BamHI 双酶切
1 2 3
图 2 载体质粒pTWIN1经双酶切后的的琼脂糖凝胶电泳
AK-N UP ：GGTGCTCTTCCAACATGGCTGACGCTGCTGTTA SapI AK-N Down：GGTCTGCAGTTAGGTCTGCTTGAAGCCAACATG PstI AK-C UP ：GGTGCTCTTCCAACGACAAGCACCCCAACAA SapI AK-C Down：CGCGGATCCTTACATCTCCTTCTCAATCTTGATG BamHI
Ssp DnaB蛋白介导的精氨酸激酶N末端 和C末端结构域的表达与纯化
主要内容
1. 背景介绍
2. 实验设计思路 3. 实验结果与分析
4. 后续实验展望
1.1 精氨酸激酶简介
From Genfa Zhou
精氨酸激酶（AK）是无脊椎动物能量代谢中的一种重要磷酸激 酶，它能够催化ATP的产生，是由一个小的α-螺旋组成的N端结构 域和一个大的C端结构域组成。C端结构域为8股反平行β-折叠被7 个α-螺旋包绕着。精氨酸激酶的结合部位主要位于C端结构域， 活性催化部位则全部位于C端结构域。
1000bp
500bp
1:载体质粒pET-28a 2:质粒pTWIN1/N-terminus 3:质粒pTWIN1/C-terminus 图4 质粒pET-28a、pTWIN1/N-terminus和 pTWIN1/C-terminus经过NdeI/BamHI双酶切后 的琼脂糖凝胶电泳
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1
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500bp 300bp
3. 实验结果与分析
AK-N UP ：GGTGCTCTTCCAACATGGCTGACGCTGCTGTTA SapI AK-N Down：GGTCTGCAGTTAGGTCTGCTTGAAGCCAACATG PstI AK-C UP ：GGTGCTCTTCCAACGACAAGCACCCCAACAA SapI AK-C Down：CGCGGATCCTTACATCTCCTTCTCAATCTTGATG BamHI
N端PCR条件： C端PCR条件： 变性：94℃ 变性：94 ℃ 退火：57℃ 退火：60 ℃ 延伸：72℃ 延伸：72 ℃ 循环次数：35 循环次数： 35
900bp 700bp 500bp 300bp
1：以AK基因为模板经PCR扩增得到的N端产物 2：以AK基因为模板经PCR扩增得到的C端产物 3：水对照 图 1 以AK基因为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
LOGO
衷心感谢潘继承老师、汪劲 松老师对本小组的精心指导！ 衷心感谢石玉林师兄对本小 组的大力支持！
2.实验设计思路
由于AK的两个结构域尤其是N端多肽难以用常规的 诱导表达方法得到，并且疏水性较强，因此本课题 采用融合蛋白表达的方法获得目的蛋白，利用蛋白 质内含子自我剪切的特性，可以不借助任何内切酶 而得到AK的N端和C端，进而分别研究N端和C端的 独立折叠以及相互作用的机制。
整 体 思 路 图 解
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1
2
图5 以质粒pET-28a/N-terminus为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
图6 测序结果
116.0KD
66.2KD
45.0KD 35.0KD
25.0KD
18.4KD 14.4KD
图7 经过Ni亲和层析柱纯化得到的融合蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图
43KD 31KD
Hale Waihona Puke 10KD900bp 700bp 500bp 300bp
1：以 pTWIN1/N-terminus为模板 2：以 pTWIN1/C-terminus为模板 3：水对照
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3
图3 以质粒pTWIN1/N-terminus和质粒pTWIN1/C-terminus 为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
8000bp 6000bp 5000bp 3000bp