脂代谢紊乱导致脂肪肝与及高脂血症发生的机制

脂代谢紊乱导致脂肪肝与及高脂血症发生的机制

一、关键科学问题及研究内容

根据我国高脂血症和NAFLD的特点，我们围绕高脂血症和NAFLD的诱因、重要发病环节以及生物标记物的发现这几个方面，凝炼出6个有特色、有创新性的科学问题：

●NAFLD和高脂血症发生、发展及转归的易感基因和表观

遗传特征？

●我国居民膳食营养和生活方式（运动）与NAFLD和高脂

血症发生、发展的关系？

●代谢性炎症在NAFLD和血脂紊乱发生、发展中的作用？

●肝脏营养感应调控及脂代谢稳态失衡与NAFLD发生和

发展的关系？

●外周脂质向肝脏异位以及肝细胞内脂肪重分布在

NAFLD发生、发展中的作用？

●NAFLD和高脂血症不同疾病阶段及转归的生物标记物

是什么？

主要研究内容包括：

1.脂肪肝和高脂血症的遗传学研究：易感基因及表观遗传

利用我们项目组人群队列及病人活检样本资源、部分中国

人群的SNPs数据和国内外脂代谢通路相关基因的研究成果，重点研究：1）NAFLD和高脂血症的易感基因以及表观遗传因素：利用代谢基因数据库（WIT）和本项目组研究获得的SNPs数据，通过外显子深度测序筛查进一步确定中国汉族人群NAFLD和高脂血症的易感基因位点，并在长期大样本人群队列研究和肝组织活检标本的基础上验证其与不同阶段NAFLD（SS和NASH）以及不同预后转归（肝硬化、糖尿病、心脑血管疾病、恶性肿瘤）的相关性；在NAFLD动物模型的不同阶段进行全基因组启动子甲基化位点扫描、microRNA 表达谱分析；并利用上述平台进行高脂血症和/或NAFLD患者肝组织活检样本检测，从而识别并明确与高脂血症和NAFLD相关的表观遗传学因素；我们也将特别关注两个极端人群，即“吃水也胖”和高脂饮食而不发生脂肪肝和高脂血症人群，并通过上述手段研究其易感/保护基因（位点）（注：综审专家建议）；2）易感基因及表观遗传因素的作用机制研究：针对获得的NAFLD和高脂血症相关性易感基因/易感位点，应用EMSA、super EMSA和Chip技术“挖掘”与之相结合的转录因子，验证易感基因突变或多态性对基因转录/翻译、信号通路活性、细胞生理功能的影响；结合筛选获得以及前期工作发现（SREBP1c、FoxO1、PGC1 、SIRT1基因甲基化）的表观遗传学因素，在原代肝脏细胞和动物模型水平验证其对基因表达、信号通路活性、细胞糖脂代谢功能的

影响,并利用SIRT1基因缺陷小鼠研究乙酰化表观遗传修饰在NAFLD和高脂血症中的作用和机制；3）婴幼儿期环境因素对NAFLD和高脂血症的远期影响：在年龄、性别等因素匹配的条件下，对婴幼儿的肥胖程度、喂养方式与饮食结构及其母亲怀孕和哺乳期饮食与运动状况进行回顾性调查和长期随访观察，收集被研究儿童、青少年的血液标本和肝脏超声检查结果，分析母亲和家庭因素以及婴幼儿时期饮食运动等环境因素与儿童、青少年高脂血症和NAFLD的发生及发展的关系，并探讨其易感基因和表观遗传改变；4）遗传、环境因素与NAFLD和高脂血症发病相互作用并建立数学模型：分析队列人群营养、运动状况的背景资料，尤其是脂（饱和/单不饱和/多不饱和脂肪酸、甘油三酯、胆固醇）摄入，以及其构成比例（饱和/不饱和脂肪酸，单不饱和/多不饱和，ω3/ω6脂肪酸的比例），不同数量与类型的糖（葡萄糖、果糖等）等含量；动态监测患者的血脂变化；调查职业、锻炼、睡眠、进食规律等生活方式因素，结合上述遗传研究的资料，评价遗传变异与环境因素及其交互作用对NAFLD和高脂血症发生、发展的影响；采用CART、MARS、MDR、贝叶斯网络、随机森林等模型，构建遗传因素及环境因素诱导NAFLD和高脂血症及其不同转归的预测模型。

2．营养、生活方式(运动)与脂肪肝和高脂血症发生、发展的关系

本课题将利用前期已建立的人群队列、高脂血症和NAFLD患者样本资源以及动物模型，重点研究：1）我国人群的饮食营养结构与NAFLD的关系，重点关注饱和/单不饱和/多不饱和脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量，饱和/不饱和脂肪酸、单不饱和/多不饱和、ω3/ω6脂肪酸的比例，果糖的含量以及运动等；探寻影响NAFLD和高脂血症发生、发展的我国国民营养膳食特点；2）“极端”人群饮食营养结构与NAFLD的关系：对两种“极端”表现人群，即“吃水也胖”的人群，及高脂饮食但不发生脂肪肝和高脂血症的人群中，分析影响NAFLD和高脂血症发生、发展的膳食营养成分与易感基因的相关性，与课题1合作重点探讨对高脂血症和脂肪肝具有致病性和保护性的基因位点和表观遗传修饰，为高脂血症和NAFLD个体化营养干预提供依据（注：综审专家建议）；3）高脂肪酸和果糖诱导NAFLD和高脂血症的分子机制：在细胞和动物模型（ω-3/ω-6 PUFAs代谢酶基因敲除小鼠如COX-1-/-、COX-2-/-、mPGES-1-/-、cyp4a10-/-、cyp4a14-/-、sEH-/-等）中探讨不同比例饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸、ω-3/ω-6 PUFAs、果糖含量在高脂血症和NAFLD发生、发展及预防中的作用及分子基础；4）营养膳食预测NAFLD和高脂血症的模型和膳食质量评分体系：通过分析营养素(尤其是脂质含量，脂肪酸类型和比例、果糖含量)等的摄入量（外暴露量）和血尿样本中营养素或其代谢产物含量（内暴露量），

结合检测血脂谱、代谢性炎症与氧化应激指标以及临床相关指标，探讨营养膳食与高脂血症及NAFLD生物标志物和临床表型的关系，建立有效的营养膳食预测高脂血症和NAFLD的模型和膳食质量评分体系；5）NAFLD和高脂血症个体化营养膳食防治研究：分析营养膳食与易感基因的相互作用对高脂血症和NAFLD的影响，为高脂血症和NAFLD 个体化营养干预提供依据；6）运动对NAFLD的影响：分析我国人群运动量对高脂血症和NAFLD发生、发展的影响，并在动物模型中探讨其作用机制。

3. 代谢性炎症在脂肪肝和高脂血症发生中的作用机制

我们拟利用细胞、模式动物和部分NAFLD患者的肝活检样本，重点探讨：1）PRR在代谢性炎症产生中的作用，主要运用转基因和基因敲除小鼠研究清道夫受体Ａ，清道夫受体B，TLR3，TLR4，CIITA在调控代谢性炎症反应的发生中的作用；2）膳食因子在代谢性炎症中的作用：探讨如不同浓度ω-3、ω-6脂肪酸、胆固醇、果糖等因素对PRR介导的代谢性炎症的影响及其相关机制；3）PRR和脂质共同激活代谢性炎症的信号通路：论证PRR-清道夫受体-GRP78-JNK/NF-κB在代谢性炎症产生和放大中的作用；同时通过基因和蛋白Array技术，发现新的脂质和炎症通路共同的‘sensor’; 3）代谢性炎症的干预：根据上述信号通路的研究和我们前期的工作基础，我们将进一步论证小分子多肽

（如H11肽、resveratrol等）是否能阻断或降低代谢性炎症和NAFLD及高脂血症的发生，为治疗代谢性炎症提供新方法和新靶点。本研究的平台和技术与子课题4和子课题5密切相关，即代谢性炎症是影响肝脏脂代谢稳态和外周脂肪向肝脏的异常转运的重要机制。

4.肝脏营养感应调控及脂代谢稳态失衡与脂肪肝和高脂血症的发生和发展

我们拟利用细胞模型、模式动物和部分NAFLD患者肝脏活检样本，展开以下几个方面的研究：1）代谢性核受体网络与肝脏脂代谢：探讨代谢性核受体（如PPARs、LXRs、FXR、SHR、PXR、CAR和TR等）参与脂肪酸代谢（合成、摄取、氧化、储存和分泌）调节的分子网络及其作用机制；利用已经具备的PPARα、PPARβ、PPARγ、LXRα、LXRβ、FXR和PXR等基因敲除小鼠研究其在高脂血症和NAFLD 发生中的作用。在野生型和核受体基因敲除小鼠上诱导SS 或NASH模型，测定肝组织脂肪酸含量和种类、甘油三酯和胆固醇水平，在mRNA和蛋白水平检测与脂肪酸（甘油三酯）摄取(FAT/CD36、caveolins、FATPS、FABPpm等)、合成（SREBP1c、FAS、DGAT等）、β-氧化(ACO、CPT1、HMGCS2、CYP4A等)、储存和分泌(Cide家族蛋白、perilipin、seipin等)等基因表达改变，核受体(PPAR、PGC1α、LXR、FXR和PXR等)、重要脂代谢调节转录因子和信号分子

(SREBPs、ChREBP、FOXO、AMPK、Sirt、mTOR等)、以及炎症通路分子（JNK、TLRs和NFkB等）的表达或/和磷酸化水平，和肝脏纤维化（TGFβ/Smad蛋白、胶原、fibronectin 等）的指标；2）脂肪组织-肝脏调节轴：研究脂肪组织源性信号分子（游离脂肪酸、脂肪因子、脂滴包被蛋白等）对肝脏营养感应信号通路的影响及作用机理；3）胰腺-肝脏调节轴：验证核受体和胰源性信号分子（PANDER和FAM3A）对肝细胞脂代谢以及炎症及纤维化的影响。4）脂代谢调节新基因的发现：利用基因组学和蛋白组学技术在NAFLD动物模型上研究可能参与肝脏脂肪酸代谢稳态调控的新基因。

5. 脂质的异位沉积在脂肪肝和高脂血症发生、发展中的作用

我们拟利用细胞模型、模式动物（Seipin-/-小鼠，Perilipin-/-小鼠，肝脏或脂肪组织特异性的FAT/CD36-/-小鼠，肝脏特异的FAT/CD36转基因小鼠等）和部分NAFLD患者的活检样本，重点进行以下方面的研究：1）脂肪组织、细胞中脂滴的分解机制及在NAFLD中的作用：在培养的脂肪细胞水平和模式动物研究不同游离脂肪酸对脂滴包被蛋白（如Perilipin和Seipin等）表达以及磷酸化的影响，和脂肪分解代谢（脂肪酶ATGL和HSL）的改变；2）脂肪细胞与肝细胞脂肪酸的转运机制：利用脂肪细胞和肝细胞共培养模型和模式动物，观察脂肪酸在代谢性炎症因子的作用下，在胞浆、细胞膜和亚细胞器（ER）的分布和细胞间转移机制；3）肝脏脂肪酸转

运蛋白FAT/CD36在脂肪酸二次转运中的作用及分子机制：使用分子生物学和质谱技术检测肝脏脂肪酸转运蛋白FAT/CD36的表达调控以及糖基化、棕榈酰化和磷酸化修饰的水平，并研究这些修饰与肝细胞脂肪酸摄取及亚细胞定位的关系；在动物和人群，拟利用氢质子磁共振波谱，研究高脂和炎症对脂肪酸异常分布的影响；4）脂肪酸在肝脏聚集与肝脏损害的机制：研究脂肪组织游离脂肪酸的代谢、肝脏对循环游离脂肪酸的摄取改变、肝细胞损害（氧化应激，ER应激，细胞凋亡，和肝纤维化）及血脂种类和水平的改变。本项目的开展将验证我们提出的NAFLD发生的“脂肪酸二次异常转运假说”；也对课题四研究的器官间对话（肝脏-脂肪组织轴）共同控制机体整体和局部组织脂代谢稳态的推测提供进一步的实验基础。

注:我们项目组已经通过高脂饮食和皮下注射10% 酪蛋白，在模式动物上成功建立了代谢性炎症模型，具体方法见Ruan X,et al.Hepatology 2009。

6. 与NAFLD和高脂血症疾病分期和转归相关的生物标志物发现和应用

我们将利用在课题1和课题2中已经建立的大规模NAFLD以及高脂血症的人群研究队列、和课题4、课题5中建立的NAFLD /高脂血症模式动物，重点进行以下方面的研究：1）利用生物化学、蛋白组学、代谢组学等生物学的

方法研究NAFLD相关生物标志物，包括血脂、肝脏脂肪含量、肝脏酶学、氧化应激指标、炎症因子、脂肪细胞因子、血小板数量和活性、血浆CK-18等，以及未知的小分子代谢产物标志物，分析上述生物标志物与不同阶段肝脏脂肪变性发生和发展的相关性，筛选出更加准确、敏感和有预测价值的NAFLD生物标志物；我们也将特别关注两个极端人群，即“吃水也胖”和高脂饮食而不发生脂肪肝和高脂血症人群的生物标志物的变化（注：综审专家建议）；2)建立无创性NAFLD评分诊断系统：结合人体肝脏组织活检标本、生物标志物（特别是小分子代谢产物）、营养膳食内外暴露以及超声等检查，利用生物信息学分析提出NAFLD综合评分诊断体系，并在较大的规模人群进一步加以验证，最终建立无创性评分诊断系统，用于NAFLD预测和防治。

二、预期目标

总体目标：

本项目将根据我国脂代谢紊乱的主要表型为高甘油三酯血症和NAFLD这一重要特征，围绕参与NAFLD发病的肝脏营养感应信号网络调控异常和外周组织脂肪向肝脏异常转运这两大关键环节，从易感基因及其表观遗传修饰、易感基因与环境因素（膳食营养和生活方式）的相互作用和代谢性炎症等三大诱因入手，探讨高脂血症NAFLD发生、发展与转归的危险因素及其作用机制，并寻找可用于准确识别NAFLD不同病理阶段和转归的代谢性小分子生物标志物，为制定适合我国国情的NAFLD和高脂血症预防、诊断、治疗的策略提供科学依据。

五年预期目标：

我们预计在5年中达到以下目标：

1.基本阐明我国特有的NAFLD和高脂血症的遗传背景，并

确定一些对特定高危人群具有预警意义的遗传学指标;发现与我国NAFLD和高脂血症发病密切相关的营养和生活方式因素，并明确其表观遗传学基础，为应对我国青少年NAFLD和高脂血症高发的严峻形势，提出有效的预防策略；

2.明确不同膳食因素和生活方式促发NAFLD和高脂血症

的分子机制；建立有效的基于营养膳食预测NAFLD和高脂血症的模型和膳食质量评分体系，为在群体和个体层面制定NAFLD和高脂血症的营养膳食防治措施提供科学依据和技术支持；

3.阐明模式识别受体SR-A，SR-B、TLR3，TLR4 及CIITA

调控代谢性炎症的分子机制以及在NAFLD和高脂血症形成中的作用，明确是否可以通过调控这些受体的表达和功能达到限制代谢性炎症反应，进而改善NAFLD和高脂血症的目的；

4.研究代谢性核受体在肝脏糖脂代谢调控网络中的作用；

发现一批新的参与肝脏脂代谢调节的重要基因；明确肝外组织通过器官间对话途径调节肝脏糖脂代谢的机制；5.证明我们课题组原创性的“游离脂肪酸二次异常转运假

说”，提供代谢性炎症通过加强脂肪组织甘油三酯水解、引发高脂肪酸血症，继而增加肝脏对游离脂肪酸的摄取导致单纯性NAFLD发生（第一次异常转移)；继而通过增加肝细胞内游离脂肪酸向线粒体和内质网上转运（第二次异常转移），从而导致NAFLD向脂肪性肝炎和肝硬化发展的实验依据；

6.获得并验证与NAFLD不同病理阶段高度相关的新的代

谢分子生物标志物，建立无创伤性评估和诊断NAFLD不同病理阶段的方法和评价量表。

本项目的实施也将为我国NAFLD和高脂血症的大规模早防、早诊、早治提供了科学依据；将培养一支有国际竞争力的优秀中青年研究队伍（博士生100名、硕士生80名）；预计将在NAFLD和高脂血症防治领域实现数个原创性突破，产生一系列创新性研究成果，获得3-5个国际专利，发表IF>5的学术论文100篇，IF>10的论文10篇，顶级科学论文3-5篇。

三、研究方案

（一）总体学术思路

本课题紧紧围绕NAFLD和高脂血症的发生和发展的分子机制这个中心问题，对病因/诱因（遗传因素、环境因素、代谢性炎症）和重大发病环节（肝脏脂代谢稳态失衡和肝外脂质向肝脏的异常转运），从分子、细胞、模式动物、人群队列和病人样本四个层面，系统地进行研究和论证。设计的6个子课题既相互独立又彼此相关，这些子课题的开展将为阐明高脂血症和NAFLD发生和发展的机制、识别高危人群和危险因素、发现有效的膳食营养干预方法、和制定新的诊疗策略做出重要贡献（图2）。

（二）主要技术路线和各课题预期目标

在上述总体学术思想框架下，本项目的6个子课题将按以下的技术路线实现各自预期目标。

课题1：NAFLD和高脂血症的易感基因及表观遗传研究本课题将综合我们课题组已有的人群队列样本、部分中国人群SNPs数据和国内外脂代谢通路相关基因的研究成果，重点阐明：1）NAFLD和高脂血症的易感基因，明确重要易感基因突变/多态性对基因转录/翻译、信号通路活性、细胞生理功能的影响，以及与高脂血症和NAFLD 的相关性；2）NAFLD和高脂血症的表观遗传特点，特别是前期工作发现的SREBP1c、FoxO1、PGC1 基因甲基化和SIRT去乙酰化酶家族在高脂血症和NAFLD中的作用；3）婴幼儿期环境因素与表观遗传改变以及与NAFLD和高脂血症的关系；4）遗传-环境因素-表观遗传与NAFLD和高脂血症发病相互作用及其数学模型。

课题2：环境因素与NAFLD和高脂血症发生、发展的关系本课题将利用前期已建立的人群队列、高脂血症和NAFLD患者样本资源以及基因敲除动物模型，重点明确：1）我国人群的饮食营养结构与NAFLD的关系，并建立有效的营养膳食评分体系和预测NAFLD和高脂血症的模型；2）高脂肪酸（饱和脂肪酸、ω-3/6 PUFAs）和果糖诱导NAFLD和