高效液相色谱柱发展史
高效液相色谱( high performance liquid chromatography, HPLC
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。
是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。
又因分析速度快而称为高速液相色谱。
高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。
HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。
HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。
使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。
高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
发展历史：1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。
什么是高效液相色谱(HPLC)
（高效液相色谱）？
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 2004年，液相色谱的仪器和 色谱柱技术取得了进一步发 展，在分离度、速度和灵敏 度方面实现了显著提升。需 要具有更小颗粒[1.7微米]的 色谱柱和具有专门功能的仪 器，提供15,000 psi [1,000 bar]的流动相，以达到更高 的性能水平。必须从整体上 创建一套新系统来执行超高 效液相色谱（现在称为 UPLC技术）。
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简史和一些定义
• 液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初 定义的概念。他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶 剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先 驱性研究。
• Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。他发现粉状白垩[碳酸钙] 和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。他将样品[均质化植物 叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。然后使纯 溶剂通过。当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样 品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快 于其他组分。
• 高效液相色谱法现在是分析化学领域的一种强大的工具。它能够 分离、鉴定和定量存在于任何可溶于液体的样品中的化合物。目 前，可以轻松鉴定出浓度低至万亿分之一[ppt]级的痕量化合物。 HPLC可以并且已经应用于几乎任何样品，例如药品、食品、保健 品、化妆品、环境基质、法医学样品和工业化学品。
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 目前，科学家们正在使用颗粒直径甚至 小于1微米的色谱柱以及能够在100,000 psi [6,800 bar]下运行的仪器来从事 基础研究。这让我们可以一窥这项技术 的未来。
• 图：HPLC色谱柱
液相色谱：1-色谱发展历史和分类
高效液相色谱法的应用范围及局限性
• 应用范围
• 高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定 易分解的、分子量大的、不同极性的有机化合物；生物活 性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等 。
• 涉及到是有化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及 环境污染物等领域，约占全部有机化合物的70-80%，其 余20-30%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸 点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。
同位素 1944年，美国橡树岭实验室和衣阿华州大学分
离和鉴定了稀土元素。 1941年，Martin和Synge发展了分配色谱。
色谱发展历史
• 1944年，Martin发展了纸色谱 • 1952年，Martin和 James发展了气-液分配色
谱，气相色谱问世。
• 1956年，Van Deemter等发表了速率理论。 • 1957年，制作了离子色谱交换氨基酸分析仪。 • 1959年，凝胶过滤色谱。 • Giddings 于1963年奠定色谱理论。 • 1969年，现代液相色谱，1975年，离子色谱法。 • 1981年，毛细管电泳。
• 高效液相色谱法的特点（三高一快） • a.分析效率高-液相色谱柱的柱效可以达到
5×103-----3×104块/m，而原来的经典色谱柱的柱 效只有2-50块/m。
3-HPLC 色谱柱介绍
色谱柱使用保养知识
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内容
色谱柱应用基础 HPLC色谱柱介绍
色谱柱使用保知识
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高效液相色谱柱简介
色谱柱是一根填满填料的管子
柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长短)不尽相同
Waters HPLC色谱柱
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Waters 色谱柱发展历史
ACQUITY UPLC® BEH Amide ACQUITY UPLC® BEH Glycan XBridge Amide XSelect HSS HPLC Columns ACQUITY UPLC® HSS Cyano & PFP columns XSelectTM HSS Cyano & PFP columns XP 2.5 µm Columns
管内的填料更是种类繁多,主要分为三大类 – 硅胶基质 – 聚合物基质 – 无机和有机硅胶杂化基质 色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术
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硅胶颗粒的形状
不规则形状 (Irregular)
– 大硅胶颗粒研磨，筛分
– 不粒尺寸和表面积限制
有机基质 (高聚物)
杂化颗粒技术(具硅-碳键机制)
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第一代杂化颗粒的合成过程
Waters 专利技术 荣获2000年全球 R&D 100 大奖
硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
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高效液相色谱法的发展
高效液相色谱法的发展在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。
到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。
特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。
具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。
从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。
气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。
现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。
高效液相色谱的类型广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。
不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。
通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。
其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。
表8-1列举了一些液相色谱方法。
按分离机理，有的相同或部分重叠。
但这些方法或是在应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。
表8-1 HPLC按分离机理的分类现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来。
最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。
此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。
液相色谱仪填料的发展史
液相色谱仪填料的发展史高效液相色谱(HPLC)不仅是一种有效的分析分离手段,也是一种重要的高效制备分离技术。
色谱柱是HPLC系统的核心,不同性能的填料是HPLC广泛应用的基础。
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。
正相柱：多以硅胶为柱填料。
根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10 µm的范围内。
另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。
也有无定型和球型之分。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 µm之间。
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath）、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。
高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在医`学教育网搜集整理有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。
高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。
1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。
科克兰、荷瓦斯制备成功薄壳型固定相，这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳，实现了高速传质，为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。
高效液相色谱柱
高效液相色谱柱高效液相色谱柱是一种在分析化学领域中广泛使用的技术。
它的原理是通过溶液在色谱柱中的流动过程中，对溶质进行分离和纯化。
高效液相色谱柱的优点是分析速度快、分离效果好、操作简便等。
本文将介绍高效液相色谱柱的原理、种类、应用以及未来的发展趋势等内容。
高效液相色谱柱的原理主要包括固定相和移动相两个基本要素。
固定相负责分离溶质，常用的固定相有疏水相、离子相、亲合相等。
移动相则是将溶质带动在柱子中流动的溶剂，通常是有机溶剂和水的混合物。
这样，在溶液在色谱柱中流动过程中，不同溶质会在固定相的作用下发生分离，从而实现对混合物的分析和纯化。
高效液相色谱柱根据固定相的不同可以分为几种不同的类型。
例如，疏水相色谱柱广泛应用于有机物的分离和分析，它的固定相表面通常具有疏水性，可以对有机物进行选择性的吸附和分离。
离子相色谱柱则适用于进行离子化合物的分离和分析，例如酸和碱等。
亲合相色谱柱主要是基于生物大分子与其他化合物之间的生物亲和性进行分析。
高效液相色谱柱在实际应用中有着广泛的用途。
在生命科学研究领域，高效液相色谱柱可以用于对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在药物分析领域，高效液相色谱柱经常被用于药物的纯化和质量控制。
在环境监测方面，高效液相色谱柱可以用于对环境污染物的检测和分析。
此外，高效液相色谱柱还被广泛应用于食品安全、农药残留检测、天然产物分析等领域。
随着科学技术的不断进步，高效液相色谱柱也在不断发展和完善。
目前，研究人员正在努力提高高效液相色谱柱的分离效率和分离速度，使其更加适用于复杂物质的分离和分析。
同时，也在研发新的固定相和移动相，以满足不同类型化合物的分析需求。
此外，一些新的检测技术和装置也被引入到高效液相色谱柱中，提高对溶质的灵敏度和准确性。
总之，高效液相色谱柱是一种重要的分析技术，具有广泛的应用前景和发展空间。
它在生命科学、药物分析、环境监测等领域都有着重要的作用。
随着科学技术的不断进步，相信高效液相色谱柱在未来会发展出更多的新技术和新应用，为我们的科研和生产提供更多的支持和帮助。
色谱的发展史
色谱的发展史色谱的发展史可以追溯到20世纪初。
以下是色谱发展的里程碑事件：1.气相色谱（GC）：在1952年，A.J.P. Martin和R.L.M. Synge发明了气相色谱（GC）技术，这是一种以气体为载体的色谱方法。
GC通过将混合物分离成其组成部分，并根据其在固定相中的相互作用来分析样品。
2.液相色谱（LC）：在1906年，Mikhail Semyonovich Tsvet发明了液相色谱（LC）技术。
这是一种以液体为载体的色谱方法，样品溶解在流动相中通过固定相进行分离。
3.纸层析：在1944年，Archer John Porter Martin和Richard Laurence Millington Synge开发了纸层析技术，这是一种使用纸作为固定相的液相色谱方法。
纸层析是一种简单、便宜且易于使用的色谱方法，广泛应用于初级分析。
4.薄层色谱（TLC）：在1956年，Egon Stahl和Erwin Halpaap 发明了薄层色谱（TLC）技术。
TLC是在平板上进行的一种液相色谱方法，样品溶解在流动相中，通过薄层固定相进行分离分析。
5.高效液相色谱（HPLC）：在1970年代初，Ivar G. Horváth、Janos J. Sólyom和Csaba Horváth等人开发了高效液相色谱（HPLC）技术。
HPLC是一种在较高压力下使用液相分离方法，通过高压泵将样品溶解在移动相中，并通过固定相进行分离。
6.毛细管电泳（CE）：在1981年，Allen J. Bard和Mark S. Wrighton等人发明了毛细管电泳（CE）技术。
CE是一种使用带电粒子在电场中进行分离的色谱方法，也被认为是一种电动色谱技术。
随着科学技术的不断发展，色谱方法得到了不断改进和创新，包括新的柱填充材料、检测器和分析软件的引入，使得色谱技术在分析化学中得到了广泛的应用。
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★容量因子(capacity factor，k)--化合物在两相间达到分配平衡时，
在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。 容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t‘R）是
不保留组分保留时间（t0）的几倍。k＝0时， 化合物全部存在于流动相 中，在固定相中不保留，t‘R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越 大，出柱慢，保留时间越长。
2．定性参数（保留值）
★死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）
通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
★死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定
相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定 相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池 体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为 防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）
分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布 等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质 。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的 峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更 为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。 N与 柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明， 则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用 调整保留时间(t‘R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效)。
★理论塔板高度(theoretical plate height，H)---每单位柱长的方差。
实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。
4．相平衡参数
★分配系数(distribution coefficient，K)--在一定温度下，化合物在两相间
达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。
第三节 高效液相色谱 (high performance liquid chromat图和峰参数
★色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时
间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
★基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出
★保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现
浓度极大值的时间。
★保留体积(retention volume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现
浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR
3．柱效参数
★理论塔板数(theoretical plate number，N)---用于定量表示色谱柱的
在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换 色谱法为选择性系数(或称交换系数)， 凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可 用分配系数来表示。
在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时，K只取决于 组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得 到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为 拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只 有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性 质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、 Vm有关。由于t‘R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用 更广泛。
★色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线
上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线） 不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。 前者少见。
色谱图
★拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称
在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱 柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相 差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动 相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分 离的目的。
一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
★噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测
器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
★漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、
流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也 会产生漂移。
因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》 规定T应为0.95～1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。 ★峰底-基线上峰的起点至终点的距离。 ★峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 ★峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间 的距离。W＝4σ ★半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。 Wh/2＝2.355σ ★标准偏差（standard deviation，σ )-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的 峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分 在流出色谱柱过程中的分散程度。σ 小，分散程度小、极点浓度高、峰形 瘦、柱效高；反之，σ 大，峰形胖、柱效低。 ★峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。