PCR HPV-DNA荧光定量检测标准操作程序
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
HPV荧光PCR
人乳头状瘤病毒（HPV）实时荧光定量PCR 培训大纲一、实时荧光定量PCR技术所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。
与常规PCR相比，它具有特异性更强，有效解决PCR产物污染、自动化程度高，同时能对起始模板进行准确定量等特点。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。
这是DNA定量技术的一次飞跃。
1、实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR 反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。
在探针完好的状态下，5′端报告荧光基团的激发光被3′端的淬灭荧光基团所抑制。
PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，发挥它的5′→3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一个模板，一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。
通过定量PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期。
软件通过标准品的待测品的对数期比较，得到每一样品模板DNA的起始拷贝数。
1.1 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定1.2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SD cycle 6-151.3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
荧光定量PCR仪操作流程资料
荧光定量PCR仪操作流程1、开启电脑，并打开Smart Cycler开关,启动Smart软件，系统用户名为Smart，密码为Cycler。
若Create Run 图标非灰色，表明机器已与电脑连接，否则应重新连接，直至Create Run 图标变亮。
2、定义一个程序⑴. 点击Define Protocols 图标。
⑵. 点击New Protocols 图标。
⑶. 输入一个独特的程序名。
⑷. 输入热循环参数。
⑸.点击Save Protocol按钮。
3、创建运行⑴. 点击Create Run 图标。
⑵. 输入一个Run Name。
⑶. 选择Dye Set。
⑷. 点击Add/Remove Site按钮⑷a. 突出一个程序名。
⑷b. 突出位点。
⑷c.点击右箭头。
⑷d.重复⑷a-⑷c步骤直到所有程序和点都被选定。
⑸.点击OK。
⑹.点击Start Run按钮。
4、实时监控反应过程（这一步可省）5、实验完毕，分析实验结果运行开始后，程序会自动切换到View Results栏。
在运行过程中，用户能实时监控温度和光学数据，选择图表，分析设置和样品类型信息。
在运行完成前后及运行期间，分析设置、图表和样品类型信息可以改变。
运行过程中，可以查看存在电脑中的以前的运行。
6、保存并输出实验数据⑴点击View Results显示栏的Export按钮。
⑵检查输出数据类型。
⑶点击Export Data根目录里的Export按钮。
⑷从Look In下拉菜单里选择一个文件夹。
程序默认为Smart Cycler文件夹里的Export文件夹。
⑸.输入一个文件名或接受一个默认的文件名，点击Save。
生物技术中心仪器管理人：李红兵2006年10月15日。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
PCR法检测HPV
PCR法检测HPV引言PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可以在短时间内扩增DNA分子。
本文将介绍PCR法在检测人状瘤病毒（HPV）中的应用。
HPV简介HPV是一类寄生病毒，可以感染人类的皮肤和黏膜，特别是性传播器官，其感染与许多疾病如人类状瘤、宫颈癌等密切相关。
因此，及早检测和诊断HPV感染对预防和治疗相关疾病具有重要意义。
PCR法在检测HPV中的应用PCR法可以通过扩增和检测HPV的DNA片段来确认HPV感染。
以下是PCR法检测HPV的步骤：1. 样本采集：从患者的皮肤或黏膜中采集病毒样本，例如宫颈脱落细胞样本。
2. DNA提取：使用化学方法将样本中的DNA提取出来，以便后续的PCR扩增。
3. PCR扩增：利用特定的引物和酶，将HPV DNA片段扩增为大量复制物。
4. 凝胶电泳：将PCR产物与DNA标准分子进行凝胶电泳分析，以确认是否存在HPV DNA。
PCR法检测HPV的疗效和限制PCR法具有以下优点：- 灵敏度高：可以检测到极低浓度的HPV DNA，即使在感染早期也能够准确诊断。
- 特异性强：由于引物的特异性，PCR法可以准确区分不同类型的HPV DNA。
- 结果快速：PCR法能够在几个小时内获得检测结果。
然而，PCR法也存在一些限制：- 假阳性结果：由于实验室操作和污染等因素的影响，有时可能出现假阳性结果。
- 无法区分活动感染和残留病毒：PCR法只能检测到HPV DNA的存在，无法确定感染是否处于活跃状态。
- 资源需求高：PCR法需要专业实验室和设备支持，对设备、试剂等资源有一定要求。
结论PCR法是一种常用、灵敏和可靠的方法来检测HPV感染。
该方法在早期诊断、预防和治疗相关疾病中具有重要作用。
然而，为了提高检测准确性，减少假阳性结果的发生，操作者应严格控制实验条件，并采取相应的对照试验和质量控制措施。
人乳头瘤病毒型核酸检测标准操作规程(PCR-荧光探针法)_重复
人乳头瘤病毒6,11型核酸检测标准操作规程（PCR－荧光探针法）1.目的：规范人乳头瘤病毒(HPV)6,11型核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围：PCR实验室。
3.职责：3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：4.1《中山大学达安基因股份有限公司人乳头瘤病毒（6,11型）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书》4.2《中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册》5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。
5.2 实验原理：采用一对特异性引物和一条特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测人乳头瘤病毒（HPV）6,11型DNA。
5.3 性能参数：5.3.1 检测下限： 5.0×102基因拷贝/ml。
5.3.2 线性范围：5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.4.1 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本等。
5.4.1.1 男性尿道分泌物：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检（采集分泌物前2小时禁小便）。
5.4.1.2 女性生殖道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌试管中，密封送检。
5.4.1.3 女性尿道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检。
02 HPV病原体(流式荧光法)测定标准操作规程
人乳头状瘤病毒病原体检测(流式荧光法)标准操作规程一、检验目的人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)病原体检测用于临床尖锐湿疣体表面脱落细胞，妇女宫颈细胞及宫颈粘液标本中26种HPV病毒DNA的分型检测。
可作为HPV感染的辅助诊断。
二、适用范围1. 适用于下生殖道分泌物、宫颈脱落细胞等样本的采集，接受，处理，检测及报告。
2. 适用仪器：ABI7000 PCR扩增仪、LIFE EXPRESS基因扩增仪、Luminex200流式分析仪。
三、方法原理本试剂盒系由人乳头状瘤病毒(HPV)核酸提取试剂、HPV杂交检测试剂等组成。
用Chelex-100树脂法抽提宫颈脱落细胞基因后，采用多重PCR技术对DNA进行扩增，并以流式荧光杂交法对扩增产物进行检测分析，判定样品中是否存在HPV。
多重PCR可有效扩增HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66共13种高危亚型，此外还可以有效扩增HPV6、11、40、42、44、53、54、55、56、61、68、73、83等亚型。
微球杂交液中包含多种荧光编码微球，每种荧光编码微球的表面都共价交联有寡核苷酸探针，在杂交过程中探针特异性识别并结合PCR产物中的靶序列，再经过和荧光素反应后形成微球－探针－扩增产物－荧光素的复合物，经Luminex流式分析仪阅读时，可获得该复合物的微球编码及荧光强弱信号，最后经过透景HPV专用的分析软件判定相应的检测结果。
四、性能指标1. 检测灵敏度：本试剂盒的最低检测限为10-20拷贝(0.02ng/ml)2. 检测特异性：阳性参比品符合率：试剂盒对26种HPV亚型的阳性参比品进行2次平行坚持测，结果均为阳性。
阴性参比品符合率：试剂盒对正常人基因组参比品进行2次平行检测，结果均为阴性。
3. 检测重复性：分别对HPV16、HPV18、HPV31、HPV45和 HPV33共5种高危亚型阳性参比品进行10次平行检测，结果一致且准确。
PCR-HPV-DNA荧光定量检测标准操作程序
P C R-H P V-D N A荧光定量检测标准操作程序(总4页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除1.目的：明确高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行巨细胞病毒核酸定量的检测。
2.适用范围：适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。
适合仪器：LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术样品要求：宫颈脱落细胞3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂盒。
5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒6.标准操作：试剂准备（在试剂准备区操作）将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱，反复冻融不可超过三次），取出PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000转/分钟10s从试剂盒中取出DVA聚合酶，8000转/分钟lOs。
根据当次实验标本量，取出相应试剂（1管= MIX + DVA聚合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1空白管对照+1管阳性对照) 取PCR反应管转移至样本制备区。
样本处理(在样本处理区进行)取宫颈脱落细胞样本0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到2m1)13000转/分钟离心1分钟弃上清，加入细胞保存液重悬细胞13000转/分钟离心1分钟，尽量弃干净上清每样本加入50ul细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸10分钟。
13000转/分钟离心10分钟，保留上清备用(上清中为释放的DNA)。
取上清作为PCR扩增的模板，其余保存于一20℃在对应的PCR反应管中分别加入2ul处理好的样本DVA,空白对照、阳性对照，盖紧管盖，稍做离心(反应总体积为2o u 1/人份，每次反应需要设置一个阳性对照以及一个空白对照)。
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进行巨细胞病毒核酸定量的检测。
2.适用范围：
2.1适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。
2.2适合仪器：LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪
2.3方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术
2.4样品要求：宫颈脱落细胞
3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂盒。
5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒
6.标准操作：
6.1 试剂准备（在试剂准备区操作）
6.1.1将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱，反复冻融不可超过三次），取出PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000转/分钟10s从试剂盒中取出DVA聚合酶，8000转/分钟lOs。
6.1.2根据当次实验标本量，取出相应试剂（1管=1
7.5ulPCR MIX +0.5ul DVA 聚合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1空白管对照+1管阳性对照) 取PCR反应管转移至样本制备区。
6.2样本处理(在样本处理区进行)
6.2.1.取宫颈脱落细胞样本0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到2m1)
6.2.2. 13000转/分钟离心1分钟
6.2.3.弃上清，加入0.5m1细胞保存液重悬细胞
6.2.4. 13000转/分钟离心1分钟，尽量弃干净上清
6.2.5.每样本加入50ul细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸10分钟。
6.2.6. 13000转/分钟离心10分钟，保留上清备用(上清中为释放的DNA)。
6.2.7取上清2.0ul作为PCR扩增的模板，其余保存于一20℃
6.2.8在对应的PCR反应管中分别加入2ul处理好的样本DV A,空白对照、阳性对照，盖
紧管盖，稍做离心(反应总体积为2o u 1/人份，每次反应需要设置一个阳性对照以及一个空白对照)。
转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序
6.3 PCR扩增（在扩增区操作）
6.3.1打开稳压器电源，再打开计算机电源。
6.3.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
6.3.3设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光;Passive Reference选择none(见表1)
表1: 设置四种荧光检测通道
6.3.4将循环条件设定为
6.3.5检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
6.3.6将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中设定好样孔位置。
6.3.7按仪器操作规程开始循环。
6.3.8扩增结束后取出PCR反应管，关闭扩增仪电源，反应管直接放入焚烧垃圾桶内。
6.3.9分析数据，在Analysis Notes窗口中注明检测基线值、试剂批号、阳参批号
等相关信息，进行结果分析。
6.3.10关闭计算机。
6.4检验结果判断：
6.4.1基线，阂值的设定:基线的确定为:取3-15个循环的荧光信号:阈值设定:使阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值为Under
6.4.2质控对照
1阴性对照Ct值均应显示为Undet
2阳性对照Ct值≤36
3内对照β-globin在Cy5通道Ct值≤40
符合以上三个条件，此反应是为有效
6.4.3结果判断
1样本在FAM、HEX、ROX通道Ct值显示为Undet，内对照β-globin在Cy5通道Ct值≤40,判断为阴性
2样本在FAM、HEX、ROX通道Ct值≤40, 内对照β-globin在Cy5通道Ct值≤40判断为阳性
3若样本在FAM、HEX、ROX通道40<Ct值<45的样本建议重做，重做结果Ct值<40者为阳性，否则为阴性
7.支持性文件：
7.1 《高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒(PCR一荧光探针法)》说明书（潮州凯普生物化学有限公司）
7.2 检测结果报告程序。
7.3 LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪说明书
8.此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。