高中生物新课标人教版课件PCR技术
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PCR技术教程PPT课件
Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
第4页/共71页
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
第8页/共71页
第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
第4页/共71页
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
第8页/共71页
第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
第二章-PCR技术ppt课件
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
高中生物PCR 技术的动画过程课件新人教版选修3
（多选）科学家将含人的α一抗胰蛋白酶 基因的DNA片段，注射到羊的受精卵中，该 受精卵发育成的羊能分泌含α一抗胰蛋酶 的奶。这一过程涉及 A．DNA按照碱基互补配对原则自我复制 B．DNA以其一条链为模板合成RNA C．RNA以自身为模板自我复制 D．按照RNA密码子的排列顺序合成蛋白质
ABD
（多选）科学家将控制某药物蛋白合成的 基因转移到白色来亨鸡胚胎细胞的DNA中， 发育后的雌鸡就能产出含该药物蛋白的鸡蛋， 在每一只鸡蛋的蛋清中都含有大量的药物蛋 白，而且用这些鸡蛋孵出的鸡，仍能产出含 该药物蛋白的鸡蛋。据此分析 A．该过程运用了胚胎移植技术 B．这些鸡是转基因工程的产物 C．该种变异属于定向变异 D．这种变异属于可遗传的变异 BCD
单子叶植物中常用的一种基因转化方法 是 A．农杆菌转化法 B．基因枪法 C．花粉管通道法 D．显微注射法
D
（浙江）下列关于基因工程的叙述，错 误的是 A.目的基因和受体细胞均可来自动、 或微生物 B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两 类常用的工具酶 C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达 的胰岛素原无生物活性 D.载体上的抗性基因有利于筛选含重 组DNA的细胞和促进目的基因的表达 D
第39讲 基因工程
第39讲 基因工程
一、DNA重组技术的基本工具 由图可知， DNA重组技
术的工具有 哪些？
抗虫棉
第39讲 基因工程
一、DNA重组技术的基本工具 限制酶
由图你可想 到限制酶的 特点吗？
黏性末端 平末端
第39讲 基因工程
一、DNA重组技术的基本工具 限制酶 DNA连接酶
阅读教材回答： 1、连接酶的种类？ 2、两者的差别？ 3、连接的化学键？
第39讲 基因工程
一、DNA重组技术的基本工具 限制酶 DNA连接酶 运载体
pcr ppt课件教程
引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。
pcr技术课件ppt简短
通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
实验PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳课件高二下学期生物人教版选择性必修3
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下 被检测出来。
DNA分子电泳
琼脂糖凝 胶电泳
二、材料用具
（一）仪器：
PCR仪
自动控温， 实现DNA 的扩增
微量离心管
实际上是进 行PCR反应 的场所
微量移液器
用于向微量离 心管转移PCR 配方中的液体
电泳装置
包括电泳仪、 电泳槽等
二、材料用具
PCR 的产物一般通 过琼脂糖凝胶电泳
来鉴定。
PCR仪
一、实验原理 （二）DNA片段电泳鉴定原理：
电泳鉴 定原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带 上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它 所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小 和构象等有关。
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离 心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离 心管的底部（提高反应速率）
扩增
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有 反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性
复性
延伸
预变性 94℃,5min
/
/
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
注意事项
探究.实验 DNA片段的扩增及电泳鉴定
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头 和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
3.2.3实验PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳课件-高二下学期生物人教版选择性必修3
D.两种限制酶在载体上识别的序列可能相同
跟踪训练
根据图示可知，200 bp的DNA分子量小， 800 bp的DNA分子量较大，200 bp的 DNA移动速度快，所以在电泳时，核酸 的移动方向是从负极到正极的，A错误； 当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生 一种长度的DNA片段，因此该载体最有 可能为环状DNA分子，B正确；
蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理 D.电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流
PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程 中起作用，B错误； 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪 头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高 压灭菌，C错误； 电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。
跟踪训练
例7. 为优 化目 的 基因(700 bp)的 PCR条件，研究者设计不同的复 性温度进行实验，产物的琼脂糖 凝胶电泳结果如图。据图分析， 下列有关说法错误的是 A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同
√B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度
跟踪训练
例6.下列有关电泳的叙述，不正确的是 A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电
泳中的迁移速率
√C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电 极移动，C错误。
例2 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电 泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入 的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是
高中生物新课标人教版PCR技术PPT 课件
缓冲溶液：维持反应的pH值不变
课题2
多聚酶链式反应（PCR) 扩增DNA片段
温故知新1
组成DNA分子的基本单位是什么? 这些基本单位是如何连接成DNA
分子的? DNA分子结构有什么特点？
脱 氧 磷酸
脱氧
核 苷
核糖 脱氧核苷
腺嘌呤（A） 嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基 嘧啶 胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
利用了DNA的热变性原理，通过控 制温度来控制双链的解聚与结合。
PCR反应的条件
DNA母链：提供复制的模板
8解0—旋1酶00：℃ 打开DNA双链
4种脱氧核苷酸：合成子链的原料
耐DN热A聚的合DN酶A聚：合酶 催化合成DNA子链
ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开
始连接脱氧核苷酸
DNA母链：提供复制的模板 解旋酶：打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开
始连接脱氧核苷酸
一、PCR原理：
PCR（多聚酶链式反应）技术
是一种体外迅速扩增DNA片段的技 术，它能以极少量的DNA为模板， 在几小时内复制出上百万份的DNA 拷贝。
碱基
O
O
OH OH
HO P O
O 碱基
O
OH
5’
碱基
脱氧核糖
OH HO P O
O 碱基
磷酸基团 碱基
脱氧核糖
O
磷酸二酯键 O
HO P O
碱基
O
O
课题2
多聚酶链式反应（PCR) 扩增DNA片段
温故知新1
组成DNA分子的基本单位是什么? 这些基本单位是如何连接成DNA
分子的? DNA分子结构有什么特点？
脱 氧 磷酸
脱氧
核 苷
核糖 脱氧核苷
腺嘌呤（A） 嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基 嘧啶 胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
利用了DNA的热变性原理，通过控 制温度来控制双链的解聚与结合。
PCR反应的条件
DNA母链：提供复制的模板
8解0—旋1酶00：℃ 打开DNA双链
4种脱氧核苷酸：合成子链的原料
耐DN热A聚的合DN酶A聚：合酶 催化合成DNA子链
ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开
始连接脱氧核苷酸
DNA母链：提供复制的模板 解旋酶：打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开
始连接脱氧核苷酸
一、PCR原理：
PCR（多聚酶链式反应）技术
是一种体外迅速扩增DNA片段的技 术，它能以极少量的DNA为模板， 在几小时内复制出上百万份的DNA 拷贝。
碱基
O
O
OH OH
HO P O
O 碱基
O
OH
5’
碱基
脱氧核糖
OH HO P O
O 碱基
磷酸基团 碱基
脱氧核糖
O
磷酸二酯键 O
HO P O
碱基
O
O
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PCR反应的条件
DNA母链：提供复制的模板 解旋酶： 80—100℃ 打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶： 耐热的DNA聚合酶 催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开 始连接脱氧核苷酸 缓冲溶液：维持反应的pH值不变
二、PCR反应的过程
DNA复制的条件
DNA母链：提供复制的模板 解旋酶：打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开 始连接脱氧核苷酸
一、PCR原理：
PCR（多聚酶链式反应）技术
是一种体外迅速扩增DNA片段的技 术，它能以极少量的DNA为模板， 在几小时内复制出上百万份的DNA 拷贝。 利用了DNA的热变性原理，通过控 制温度来控制双链的解聚与结合。
3 2
1
OH
HO
P
O
O
O
碱基
OH OH HO
P O OH
O
O 碱基
5’
碱基
脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖
OH
HO
P
O
O
碱基 O
磷酸二酯键
HO
O
P O O O
碱基
碱基 脱氧核糖
OH
5’
温故知新2
DNA分子的复制过程是怎样的？ DNA分子的复制需要哪些条件？
1、变性： 温度上升到90℃以上时,双链 DNA解聚成为单链。
2、复性（退火）： 温度下降到50℃左右,引
物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、延伸：温度上升到72℃左右,溶液中 的4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的 作用下,根据碱基互补配对的原则合成 新的DNA链。
课题2
多聚酶链式反应（PCR) 扩增DNA片段
温故知新1
组成DNA分子的基本单位是什么? 这些基本单位是如何连接成DNA 分子的? DNA分子结构有什么特点？
脱 磷酸 脱氧 氧 核糖 核 腺嘌呤（A） 苷 脱氧核苷 嘌呤 酸 鸟嘌呤（G） 含氮 碱基 嘧啶 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T）
5 4