细胞培养基本实验操作.doc
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞培养基本操作技能
细胞培养基本操作技能无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。
操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。
容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。
对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。
操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
实验用品1. 种类︰1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。
细胞培养室操作规程
细胞培养室操作规程1. 引言细胞培养室是进行细胞培养和实验的专用场所，为保障实验的准确性和安全性，制定了以下操作规程。
2. 操作要求为了保持细胞培养室的洁净和细胞的无菌状态，请遵守以下要求：- 进入细胞培养室前，请先穿戴干净的实验服和手套。
- 禁止携带任何未经消毒的物品进入细胞培养室，包括食物和饮料。
- 在离开细胞培养室前，请使用培养室专用消毒液清洁双手和操作台面。
- 所有细胞培养器材和试剂都需要进行严格的消毒和清洁处理。
- 遵守细胞培养室内的安全操作流程，不得随意更改实验设备或移动培养皿。
3. 培养皿的处理- 使用无菌的培养皿，确保无菌操作环境。
- 打开培养皿前，请先将双手浸泡于培养皿消毒液中，保持10秒钟。
- 使用灭菌鮯头夹拿取培养皿，不要直接用手接触培养皿。
- 不要将培养皿放在操作台上超过30分钟，以防止细菌污染和消耗培养基的水分。
4. 细胞培养物的操作- 细胞培养物必须在无菌实验室中进行。
- 添加培养基和培养物时，请使用灭菌的移液器或吸管，并且保证无气泡的形成。
- 实验结束后，请将细胞培养物放置于相应的培养箱进行保存，并确保环境温度和湿度的合适条件。
- 禁止将培养物带出实验室，以免造成交叉污染。
5. 实验设备的使用- 在使用实验设备之前，请先了解并熟悉相关使用方法和安全操作规程。
- 使用完毕后，及时清理和消毒实验设备，并将其恢复到原有的存放位置。
- 长时间闲置的实验设备需要进行周期性的保养和检修，以确保其正常运作。
6. 废物处理- 废弃物需要分类投放，如废纸、塑料瓶、试验台面等，要分别放入不同的垃圾桶中。
- 临床废液和含病原体细胞培养物的废液应根据相应的危险废物处理程序进行处理。
7. 突发情况处理- 在突发情况下，如实验设备故障或突发火灾，请立即通知实验室负责人并按照应急处理程序进行处理。
- 紧急情况下，确保自身安全的前提下，尽量采取措施保护实验数据和实验设备。
以上即为细胞培养室的操作规程，请严格遵守，以保障实验安全和数据的准确性。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤细胞培养是一项用于研究和生产生物技术产品的基础技术。
以下是细胞培养的一般操作步骤：1.实验室准备：-消毒：在开始实验之前，对实验室进行消毒处理，确保实验环境的无菌。
-工具准备：准备好所有需要的培养器具，如离心管、试管、培养皿、吸管等。
-培养基准备：根据实验需要，准备好适当的培养基，并对其进行消毒处理。
2.细胞准备：-细胞收获：收获细胞，并将其转移到一个装有细胞培养基的培养皿中。
-细胞计数：使用细胞计数器或显微镜对细胞进行计数和分析，以确定细胞的浓度和活性。
-细胞传代：如果需要，将细胞进行传代以维持其活性和数量。
3.培养条件：-培养温度：根据细胞的要求，将培养皿放置在适当的温度控制设备中，通常为37℃。
-CO2浓度：对于一些细胞（如哺乳动物细胞），需要提供适当的CO2浓度来维持其生长和代谢。
-培养液更换：根据具体要求，定期更换培养液，以保持细胞的健康生长。
4.细胞培养：-培养基添加：向培养皿中加入适当量的培养基，以提供细胞生长和繁殖所需的养分。
-培养皿处理：将培养皿放入恒温培养箱中，确保细胞在适宜的环境中生长。
-细胞观察：定期使用显微镜观察细胞的生长情况和形态变化，以评估细胞的健康状态。
-培养皿除菌：如果培养皿被发现有细菌或真菌污染，需要将其除菌，以保证细胞的无菌状态。
5.细胞传递：-细胞解离：当细胞达到所需密度或需要进行分离时，使用适当的酶或溶液将细胞从培养皿中解离。
-细胞收获：通过离心，将细胞收集到离心管中，并进行计数和分析。
-细胞传递：将细胞转移到新的培养皿中，重新开始培养过程。
细胞培养是一项复杂而精细的操作，需要高度的无菌技术和细心的操作。
在整个过程中，需要持续监测和调整培养条件，以确保细胞的健康生长和繁殖。
此外，注意遵循实验室的安全规范，保护自己和实验室的安全。
细胞培养的成功与否，将直接影响到后续实验的结果和应用。
细胞培养室操作规程
细胞培养室操作规程1. 引言在细胞培养室进行实验时，需要遵循一定的操作规程，以确保实验的顺利进行并保护实验人员和细胞的安全。
本文档旨在提供详细的细胞培养室操作规程。
2. 实验前准备在进行细胞培养室实验前，需要做好以下准备工作：- 穿戴实验室制定的个人防护装备，如实验服、手套、口罩和护目镜。
- 检查实验室设备和操作台的清洁度，并确保工作区域整洁无杂物。
- 准备实验所需的培养基、细胞培养物和实验器材，并进行必要的消毒处理。
- 检查培养器具和实验器材的完整性和干净程度。
3. 实验操作在进行细胞培养室实验时，需按照以下操作规程进行：- 打开细胞培养室的门时，先用消毒剂擦拭手部，然后使用洗手液洗手并彻底冲洗干净。
- 进入细胞培养室后，先进行操作台和培养器具的消毒处理，使用消毒剂彻底擦拭工作面和器具表面。
- 进行各项实验操作前，务必佩戴好手套，勿将裸露的手部接触培养物或实验器材。
- 操作过程中，避免发生剧烈动作和摇动，以防止细胞培养物的污染。
- 操作完成后，彻底清洁和消毒操作台、培养器具和实验器材，确保无残留。
4. 废弃物处理细胞培养室中产生的废弃物需按照以下要求进行处理：- 生物废弃物和污染物应放入专用的标有生物危险标志的中，严禁随意丢弃。
- 已消毒处理的实验器皿和培养器具应单独收集，放入装有消毒液的中浸泡，待处理完毕后进行干燥和垃圾分类处理。
5. 安全措施在细胞培养室实验中，请注意以下安全措施：- 不得在实验室内饮食、吸烟或使用化妆品。
- 注意保持良好的个人卫生，经常洗手、勤换手套，避免感染的交叉传播。
- 遇到实验室事故或异常情况时，应立即向负责人报告，并按照相关应急预案进行处理。
6. 总结细胞培养室操作规程的遵守对于实验的成功和细胞的安全至关重要。
在进行实验前准备、实验操作、废弃物处理和安全措施等方面都需要严格按照规程执行。
保持实验室整洁和个人卫生，是保证实验可靠性和重复性的基础。
细胞培养方法与步骤
实验方法—细胞培养
二.细胞培养 • 1.心肌细胞分离
取0~3 d的SD小鼠10只，酒精擦洗消毒，用剪刀从最下端肋骨处开始 剪开胸腔，找到心脏后，剪取心尖心室部分3，立即放入预冷的ADS 缓冲液（116 mmol / L NaCl，20 mmol / L HEPES，0.012% NaH2PO4 2H2O，0.1% Glucose，0.04%KCl，0.01% MgSO4 7H2O）中漂洗3次，然后将心室组织拿到超净工作台中，剪成0. 5 -1 mm3大小的组织块，再用4 预冷的ADS缓冲液漂洗2次以去除血细胞 及漂浮的结缔组织，加入用ADS缓冲液配制的消化酶8 mL（0.05Ⅱ型 胶原蛋白酶和0.06%胰蛋白酶），然后将消化酶和组织的混合液吸入 到50 mL的离心管中，置于37 恒温水浴摇床中，37 恒温振荡10 min. 重新加入8 mL消化酶，恒温振荡8 min，小心吸取上清到一个加有 400 L胎牛血清的15 mL离心管中，混匀，1 000 r / min离心5 min，去 掉上清，可看到离心管底部有淡黄色的细胞沉淀，加入37 预热的培 养基3 mL（72% DMEM，18%M199，10%胎牛血清），吸打混匀， 然后放到CO2培养箱（5% CO2，37 ）中培养，培养过程中注意离心 管盖子不能拧的太紧，几分钟后要拿出来颠倒混匀几次. 重复消化4~5 次，直到组织全部消化完。
实验方法—测定方法
• 取相同量的0.4%苔芬蓝液与细胞悬液混匀，静置310 min， 然后取适量混合液滴于细胞计数板上，计数总细胞数及未 染成蓝色的活细胞数.计数10次，取平均值. 细胞存活率 （%）=活细胞数/细胞总数（活细胞数+死细胞数） *100%
预期实验结果
1. 台盼蓝染色，死细胞被染成蓝色，用细胞计数板计数，统 计3次试验各4个视野的细胞数，细胞存活率大于95%. 2. 通过在显微镜下比较传统胰蛋白酶法和改进的胰蛋白酶+ 胶原蛋白酶法所分离得到的心肌细胞，用改进的方法所得 到的心肌细胞要明显多于传统的方法。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤(总12页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March传代细胞培养的视频拍摄脚本一、实验准备器材液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、分析天平、倒置显微镜、超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、离心管（9个）、带塞培养瓶（不定个）、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶、无菌冻存管、液氮瓶（一）、器皿1玻璃器皿的清洗灭菌：种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml （1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。
以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。
（镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的）（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。
刷洗后经行烘干（镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法）（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。
将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。
清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。
（镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕的形式显示浸泡时间）（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
细胞培养常规操作流程
细胞培养常规操作流程英文回答：Cell culture is a fundamental technique used in biological research and biotechnology. It involves the growth and maintenance of cells in a controlled environment, providing a platform for studying cellular behavior, drug discovery, and tissue engineering. Here, I will outline the general workflow of cell culture operations.1. Cell Line Selection:The first step in cell culture is to select an appropriate cell line for the study. This can vary depending on the research objectives. For example, if I am interested in studying cancer cells, I might choose a well-established cancer cell line like HeLa cells.2. Preparation of Culture Medium:Next, I prepare the culture medium, which provides the necessary nutrients and growth factors for the cells. The medium composition can vary depending on the cell type. For example, I might use DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) supplemented with fetal bovine serum, antibiotics, andother additives.3. Sterilization and Aseptic Technique:To maintain a sterile environment, I sterilize all the equipment and materials that will come into contact withthe cells. This includes the culture dishes, pipettes, and media bottles. I also follow aseptic techniques, such as working in a laminar flow hood and wearing gloves, to minimize the risk of contamination.4. Cell Seeding and Passage:Once the cells are ready, I seed them onto a culture dish or flask. The seeding density can vary depending onthe cell type and experimental requirements. After acertain period of growth, the cells reach confluence andneed to be passaged. This involves detaching the cells from the culture vessel, usually using trypsin, and transferring them to a new dish or flask.5. Monitoring and Maintenance:During the cell culture process, I regularly monitor the cells for their growth and overall health. This includes checking for signs of contamination, such as bacterial or fungal growth. I also maintain the cells by regularly changing the culture medium, adjusting the pH level, and providing fresh nutrients.6. Experimental Manipulations:Once the cells have reached the desired confluence and are in a healthy state, I can perform various experimental manipulations. This can include treatments with different drugs or chemicals, genetic modifications, or exposure to specific environmental conditions.7. Cell Harvesting:At the end of the experiment or when I need to collect the cells for downstream analysis, I harvest them. This involves detaching the cells from the culture dish or flask and collecting them in a centrifuge tube. The harvested cells can then be used for further analysis, such as protein or RNA extraction.中文回答：细胞培养是生物研究和生物技术中的一项基本技术。
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细胞培养基本实验操作
一、细胞复苏
1)提前准备完全培养基并预热至37℃（可以放至在水浴或培养箱中进行预热，
需要多少预热多少，反复预热会导致培养基失活）；用清洗洁净的烧杯或其他合适容器装有适量超纯水，然后放入37-38℃水浴锅中预热至37℃（至少需30min）；把所需耗材和其他物品放置于超净工作台中紫外照射灭菌；
2)提前查询所取冻存管的存放位置，把整个存储架子提起，为了降低复温对其
它细胞的影响，可把该存储架子放置于装有液氮的泡沫盒中，快速（存储架离开液氮罐的时间不要超过1分钟，否则其余细胞容易复温死亡，冻存管子的液氮会气化爆炸）从液氮罐中取出冻存管并放置于装有液氮的保温杯中(必须用用洁净镊子取出冻存管，以免冻伤手)，立即把存储架回液氮罐；用镊子把刚才置于保温杯的冻存管取出，并立即（不要耽搁）放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中，以免进水污染），用镊子镊好冻存管，快速沿着容器内壁转圈，细胞未冻融时（1min 内）切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应弃用该管细胞，冻融后立即用70%酒精消毒该冻存管，然后立即放入超净工作台中；
3)打开冻存管盖，用移液管吹打细胞3次，然后立即把细胞转移至提前准备的
装有5-10ml预热的完全培养基的15ml或50离心管中；
4)离心（？RPM，？min，室温），小心移除上清；
5)加入5ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养
瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；
6)第二天观察细胞的贴壁情况，并进行换液；
注意事项：
1.细胞复苏操作要求快速，否则细胞容易在冻融过程中产生冰晶，从而导致细
胞死亡，所以必须提前准备好所需的培养基、培养耗材和其他所需物品，绝对不允许临时准备；
2.在解冻细胞前，必须把超净工作台准备至工作状态，提前准备装有5-10ml
预热的完全培养基的15ml或50离心管；
3.为了降低复温对其它细胞的影响，可把该存储架子放置于装有液氮的泡沫盒
中；
4.存储架离开液氮罐的时间一般不要超过1分钟，否则其余细胞容易复温死亡，
冻存管子的液氮气化爆炸；
5.放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中，以免进水污染；
6.细胞未冻融时（1min内）切勿取出观察；
7.根据复苏细胞的大小选择合适的离心速度和时间，一般不超过1000RPM,
10min；
8.复苏后的第二天必须要进行换液（加入培养基的量根据细胞的密度和生长速
度），以降低冻存保护剂DMSO的影响；
9.离心速度和时间依据具体细胞决定；
10.上述是以T25培养瓶为例，具体选用何种培养器皿取决于细胞生长密度需求
（启动正常生长所需的密度）；
二、细胞换液培养
1. 全量换液：把所有的旧培养液移除，加入新的培养液（加入培养基的量根据细胞的密度和生长速度）；
2. 半量换液：把旧培养液移至15或50ml离心管中，然后在培养器皿中加入适量新培养基（避免细胞离开培养液太久），把装有旧培养液的离心管进行离心（1000RPM, 10min），离心后，取适量旧培养上清至培养器皿中；
注意事项：
1. 全量换液适合于生长较快的肿瘤细胞，因为这些细胞可在短期内分泌足够的因子来支撑其生长；
2. 半量换液主要适合于生长较慢的原代细胞和干细胞，这些细胞很难在短期内分泌足够的因子来支撑其生长，旧培养液中恰好含有这些因子；
3. 新旧培养液的配比取决于细胞的密度和生长速度及其自身的特性，请参照具体细胞的培养建议，一般为3:1（新：旧）；
4. 如果细胞发生发生污染，切勿进行半量换液；
三、细胞传代培养
1、当细胞密度达到其生长密度极限时（一般肿瘤细胞为80-100%，原代细胞和干细胞为80-90%，有些细胞为40-50%，熟知所养细胞的生长密度极限），移除旧培养液；
2、用PBS洗涤两次（旧培养中的钙离子会抑制胰酶的活性），加入1ml胰酶消化液（以T25培养瓶为例），立即盖好盖子，把培养瓶置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入5ml 预热完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（？RPM，？min，室温），小心移除上清；
3、加入5ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取？细胞分装入T25培养瓶中，添加基至总体积为5ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔？天传代1次；
注意事项：
1、熟知所养细胞的生长密度极限；
2、第一次进行所养细胞传代时，消化时必须把培养瓶置于倒置显微镜下观察，并记录所需时间，下次按照该时间执行即可；
3、进行细胞传代时必须结合考虑细胞生长密度需求（启动正常生长所需的密度）和实际的工作需求，在满足细胞生长密度需求的前提下，需要多少瓶就传多少瓶，降低工作强度和试剂耗材消耗；
4、离心速度和时间依据具体细胞决定；
四、细胞冻存保种
1、提前配制冻存液：用血清或完全培养基配制5-10%DMSO（根据具体细胞决定）冻存液；
2、消化收取细胞：当细胞密度即将达到其生长密度极限时进行换液，第二天，移除旧培养液，用PBS洗涤两次（旧培养中的钙离子会抑制胰酶的活性），加入1ml胰酶消化液（以T25培养瓶为例），立即盖好盖子，把培养瓶置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入5ml 预热完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，
使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（？RPM，？min，室温），小心移除上清；
3、加入适量（消化前预估细胞的数量，1-2*106/ml冻存液）冻存液并吹打混匀，分装至冻存管中，标记冻存细胞的名称、冷冻日期、操作者姓名拼音简写，然后放入梯度降温盒（提前复温至室温），置于-80℃过夜，次晨置于液氮罐中保存；注意事项：
1、密切观察细胞的生长密度，当细胞密度即将达到其生长密度极限时进行换液，以便第二天进行保种；
2、消化前进行冻存液配制，切勿用培养基和血清重悬细胞后再加入DMSO，这样会导致局部高浓度的DMSO对细胞产生损伤；
3、消化前预估细胞的数量，加入适量冻存液，以使细胞密度为1-2*106/ml，密度过高会导致冻存保护液不足，密度过低会导致冻存液对细胞有毒性；
4、梯度降温盒必须提前复温至室温，切勿从-80℃取出即可使用，这样会导致细胞全部死亡；
5、离心速度和时间依据具体细胞决定；。