绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析_蒋军富

西北植物学报,2010,30(8):1520-1526Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.文章编号:1000-4025(2010)08-1520-07绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析蒋军富,李雄英,吴耀生*,罗育,周娟,赵瑞强(广西医科大学生物化学与分子生物学教研室,南宁530021)摘要:根据已报道植物鲨烯环氧酶(squalene epox idase,SE)基因cD NA序列的保守区域设计引物,利用RT-P CR 和RA CE技术,对绞股蓝SE基因进行克隆及序列分析.结果表明,绞股蓝SE基因cDN A全长为1818bp,编码一个由525个氨基酸残基组成的多肽.绞股蓝SE基因编码的氨基酸序列中含有52.4%的非极性疏水性氨基酸,26.1%极性中性氨基酸,9.0%酸性氨基酸,12.6%碱性氨基酸.Blast结果显示,绞股蓝SE基因核苷酸序列与其他已报道的植物SE基因相似性为73%~82%,推导的氨基酸序列相似性为63.2%~79.4%.SE氨基酸序列进化分析发现,绞股蓝SE与绿珊瑚、拟南芥亲缘关系较近.关键词:绞股蓝;鲨烯环氧酶;R ACE;克隆;序列分析中图分类号:Q789文献标识码:ACloning and Sequence Analysis of Squalene EpoxidaseGene from Gynostemma p entap hy llumJIANG Jun-fu,LI Xiong-ying,WU Yao-sheng*,LU O Yu,ZH OU Juan,ZH A O Ru-i qiang (Departm ent of Biochem istry and M olecular Biology,Guangxi M edical U niver sity,Nanning530021,Chin a)Abstract:Degenerate pr im er s designed fro m the conservative dom ain of squalene epox idase(SE)in plants w ere used to am plify the SE frag ments fr om cDNA of Gy nostemma p entap hy llum by RT-PCR and RACE technolo gy.The ful-l leng th cDNA of SE from G.p entap hy llum had1818bp w ith an o pen r eading frame enco ding525am ino acids o f pro tein.There are52.4%of nonpo larity hydrophobic,26.1%o f po larity neu-tral,9.0%of acidic,as w ell as12.6%of alkaline amino acid residues in the SE polypeptide chain.T he re-sults o f ho molo gous analy sis in GenBank dem onstrated that the sequences had73%~82%similarity on the nucleotide sequence and63.2%~79.4%similarity on the deduced amino acid sequence.Furtherm ore,phy-logenic analysis on the am ino acid sequence o f SE from G.p entap hy llum w ith those o f o ther plants show ed that G.p entap hy llum w as closely related to Eup horbia tirucalli and A r abidop sis thaliana.Key words:Gy nostemm a p entap hy llum;squalene epoxidase;RACE;cloning;sequence analysis三萜皂苷(tr iterpenoid saponin)是一类重要的中草药有效成分,常见于绞股蓝(Gy nostemm a p en-tap hy llum)、人参(P anax ginseng)、三七(P anax notoginseng)、柴胡(Bup leurum chinense)、积雪草(Centella asiatica)等植物中,具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂等多种生物活性[1],具有重要的药用商业价值.三萜皂苷合成途径中,鲨烯环氧酶(EC.1.14.99.7,squalene epo xidase,SE)是一个关键的限速酶.该酶存在于内质网的微粒体中,催化鲨烯(squalene,SQ)生成2,3-氧化鲨烯(2,3-ox idosqua-l¹收稿日期:2010-01-21;修改稿收到日期:2010-07-08基金项目:广西科学基金(桂科基0575065;0731065)作者简介:蒋军富(1982-),男(汉族),在读硕士研究生,主要从事中药基因克隆研究.E-mail:Jiangjunfu2006@*通讯作者:吴耀生,博士,教授,硕士生导师,主要从事植物分子生物学和基因工程方面的研究.E-m ail:w uyaosh eng03@sin ene),可进一步合成三萜皂苷、甾醇、胆固醇等重要萜烯类物质,其含量和活性决定了后续产物的产量[2].目前,已从拟南芥(A rabidop sis thaliana)、人参、三七等植物中克隆出编码SE的基因,使植物体内三萜类物质代谢调控机制研究深入到分子水平.绞股蓝俗称七叶胆、公罗锅底,广泛分布于中国秦岭和长江以南地区,属葫芦科绞股蓝属植物.绞股蓝主要活性成分为三萜皂苷,有8种皂苷与人参皂苷结构完全相同[3],是五加科以外为数不多的含人参皂苷的植物,有÷南方人参"的美称,具有抑制肿瘤、降低血脂、增强免疫等多种药理作用[4].因此提高绞股蓝三萜皂苷含量以提高其药用价值,是绞股蓝育种的一个主要目标.本研究利用逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(rapid am-plification o f cDNA ends,RACE)技术,对绞股蓝三萜皂苷合成途径关键酶SE基因进行克隆,并对克隆的序列进行生物信息学分析,这对从分子水平上探讨三萜皂苷的生物合成机制具有重要意义,并将为通过生物技术提高其含量奠定基础.1材料和方法1.1材料供试材料绞股蓝采自广西医科大学校园,并经广西药用植物园凌征柱研究员鉴定.1.2试剂Taq酶、限制性内切酶、pMD18-T Vector、JM109感受态细胞、3c-Full RACE Co re Set Ver.2.0、dAT P、末端脱氧核糖核苷酸转移酶(ter minal deox ynucleo tidyl transferase,TDT)、RNase H等为Takar a产品;普通cDNA第一链合成试剂盒(Re-v ert AID TM M-First Strand cDNA Synthesis Kit)为MBI产品;柱式胶回收及质粒小量提取试剂盒为杭州博日生物有限公司产品;其余试剂均为上海生工生物工程公司产品.1.3方法1.3.1叶片总RNA提取在陈莉等[5]方法的基础上对异硫氰酸胍法做进一步改进:减少样品的起始量(使之与提取缓冲液的比例在1B10左右);将用于除去蛋白质和多糖的冰浴时间、离心速度和离心时间分别调整为10min、15000r/min、15m in; -20e异丙醇沉淀RNA的时间减为20~30m in,离心速度增至15000r/min.1.3.2总cDNA的逆转录取1L g绞股蓝总RN A,以Oligo dT为引物,进行总cDNA逆转录.反应体系为25L L.按照Rev ertAid TM First strand cDNA synthesis Kit(Fermentas)使用说明,进行逆转录反应,获得cDNA第一链.1.3.3cDNA保守区序列的PCR扩增根据Gen-Bank中已报道的人参、三七、拟南芥、毛曼陀罗(Datur a innox ia)等植物SE cDNA序列进行多重比对,在序列保守区域利用Oligo 6.0软件设计简并引物,扩增绞股蓝cDNA的保守区序列.上游引物为JSE-s(5c-GG(G/T)CT(A/T)GA(G/A)GATTGT (G/T)T G-3c),下游引物为JSE-as(5c-C(A/C) CCATT(T/A)GAAATAGAAGG-3c).PCR反应体系为25L L,包含10@PCR Buffer(Mg2+Free)2.5L L, MgCl2(25mmol/L)2.0L L,dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)4L L,上、下游引物(10L mol/L)各1.0 L L,Taq聚合酶(1U/L L)1.0L L,总cDNA(1L g/ L L)1.0L L,加ddH2O至25L L.反应程序为94e预变性5m in,94e变性40s,54.1e退火1min,72e 延伸90s,40个循环后,72e延伸10m in.1.3.43c RAC E扩增根据SE基因cDNA保守区序列设计SE基因的3c RACE的引物3P15c-GAATT-GTGAACTTCCTCATGC-3c)和3P2(5c-ATACTAG-CAGACCCTTCTCCC-3c),按照3c-Full RACE Core Set Ver.2.0说明书进行3c RA CE反应.1.3.55c RAC E扩增根据已克隆的SE基因中间保守区片段和3c RACE片段的测序结果,利用V ec-tor NTI Suit6.0软件拼接得到绞股蓝SE基因的部分序列,再根据这部分序列利用软件Primer Prem ier5.0设计基因特异性引物.其中AP为反转录引物,5P1和5P2分别作为第1轮和第2轮PCR的下游引物.互补的含同聚尾的锚定引物和相应的接头引物由3c-Full RACE Core Set提供.反转录引物AP (5c-GGGAGAAGGGTCTGCTAGTAT-3c),5P1(5c-GGGAGAAGGGTCTGCTAGTAT-3c),5P2(5c-GCATGAGGAAGTTCACAATTC-3c).按下列方法进行cDNA第1条链合成和PCR扩增.按Fermentas Revert Aid TM First strand cDNA synthesis Kit使用说明,以AP作为特异性反转录引物,进行反转录反应,合成cDNA第1链.用RNase H30e反应1h 降解m RNA-cDNA杂化双链中的mRNA,然后通过柱式胶回收试剂盒纯化第一链cDN A,利用T DT 在单链cDNA的3c末端加入同聚A尾,作为PCR 扩增模板.第1轮PCR反应条件为:94e预变性315218期蒋军富,等:绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析min;94e 变性30s;54.8e 退火30s,72e 延伸1min,30个循环;72e 延伸10min.取第1轮PCR 产物作为模板,进行第2轮巢式PCR.第2轮PCR 反应条件为;94e 预变性3min;94e 变性30s;55e 退火30s,72e 延伸1m in,30个循环;72e 延伸10min.1.3.6 扩增产物克隆与测序 PCR 产物在1%琼脂糖凝胶电泳后,利用胶回收试剂盒回收产物,连接到pM D18-T 载体,构建重组质粒.转化JM109感受态细胞,筛选重组子并提取质粒进行酶切及PCR 鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程公司测序.1.3.7 绞股蓝SE 基因cDNA 全长序列的拼接及生物信息学分析 利用V ecto r NT I Suite 6.0软件对中间保守区扩增片段、3c RA CE 和5c RACE 所得片段的测序结果进行分析和拼接.利用DNAman 软件分析绞股蓝SE 基因cDNA 全长序列的性质,在NCBI 的blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.g ov/Blast.cgi)中进行blastn 比对.运用Vector NTI Suite 6.0软件推导绞股蓝和已报道植物的SE 氨基酸序列,并进行相似性比对和构建系统进化树.2 结果与分析2.1 电泳结果绞股蓝鲨烯环氧酶基因的中间保守区序列、3c RACE 和5c RA CE 的扩增产物电泳结果如图1所示,中间保守序列经PCR 扩增后得到约530bp 的片段(图1,A),3c RACE 扩增出约1050bp 的片段(图1,B),5c RACE 扩增出约800bp 的片段(图1,C).2.2 PCR 产物的测序分别将PCR 产物进行测序,克隆的中间保守区序列、3c RACE 和5c RACE 片段分别为535、1030、802bp.2.3 生物信息学的分析2.3.1 绞股蓝鲨烯环氧酶基因cDNA 全长核苷酸序列分析 根据中间保守区序列、3c RACE 和5c RACE 扩增片段的测序结果,利用Vecto r NTI Suite 6.0软件拼接得到绞股蓝鲨烯环氧酶基因的全长序列.该基因全长为1818bp,翻译起始位点位于57bp 处,polyA 信号位于1806bp,开放阅读框共1578bp,编码525个氨基酸残基(图2),相对分子质量为57.8Kda,等电点(pI)值为9.04.氨基酸序列分析表明,绞股蓝SE 基因的氨基酸序列中含有52.4%的非极性疏水性氨基酸,26.1%极性中性氨基酸,9.0%酸性氨基酸,12.6%碱性氨基酸.将SE 序列提交至GenBank 获得登录号为FJ906798.2.3.2 不同植物SE 基因的序列比较与进化分析 以绞股蓝SE 序列进行blastn 在线序列比对,结果表明来自葫芦科的绞股蓝SE 核苷酸序列与Gen -Bank 中其它7个科的10种植物SE 基因的序列相似性较高,在73%~82%之间(表1),其推导的氨基酸序列与其它植物的SE 基因氨基酸序列的相似性在63.2%~79.4%之间(表1).从表1还可看出,不同植物来源的SE 氨基酸序列长度差别不大,均在519bp~585bp 之间.植物SE 基因的核苷酸序列和氨基酸序列在整体上都表现出较高相似性,表明植物SE 基因在不同物种之间进化关系较近.运用Vector N TI Suite 6.0软件构建绞股蓝和GenBank 中7个科10种植物的18个SE 基因氨基酸序列系统进化树(图3),结果其构建出3个主要图1 绞股蓝SE 中间保守区序列(A )、3c R ACE(B)和5c RA CE(C)的扩增结果1.中间保守区序列扩增产物;2.3c RAC E 产物;3.5c RACE 产物;M.DL2000F ig.1 G.p entap hy ll um SE fr agment amplif ied by co nserv ed sequence(A),3c RA CE(B)and 5c R ACE(C),respect ively1.C on served s equence pr odu ct;2.3c RACE product;3.5c RACE product;M.DL20001522西 北 植 物 学 报 30卷图2 绞股蓝SE cDN A 核苷酸序列及推导的氨基酸序列粗斜体AT G 表示起始密码子;粗体加下划线T GA 表示终止密码子;小写字母表示5c 和3c 端非翻译区,大写字母表示编码区;上面表示核苷酸序列,下面为氨基酸序列F ig.2 N ucleo tide sequence and deduced amino acid sequence for SE cDN A from G.p entap hy ll umAT G the in itiation codon is in bold and italics ;TGA the termination codon is in b old and indicated by u nderlined;Low ercase letters rep resent5c and 3c untranslation region,Capital letters repres ent tran slation region;ab ove.Nucleotide sequ ence;below.Amino acid squ ence15238期 蒋军富,等:绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析分支.第Ñ个分支由7个基因构成,它们分别来自毛茛科的果黑种草、茄科的毛曼陀罗和印度人参、葫芦科的绞股蓝、大戟科的绿珊瑚、十字花科的拟南芥.其中,果黑种草、毛曼陀罗、印度人参聚为一类;绞股蓝与绿珊瑚、拟南芥聚为一类,说明绞股蓝与绿珊瑚、拟南芥的亲缘关系较近.第Ò个分支由8个基因构成,它们主要来自五加科的辽东楤木、人参、三七.第Ó个分支由来自于豆科蒺藜苜蓿和紫苜蓿的3个基因构成.在SE 基因系统进化树中,同属一个科目的植物SE 基因优先聚类合并,这与植物自然进化关系保持一致.聚类分析还发现,拟南芥SE (AB008021、NM _104624)(二者推导的氨基酸序列相似性为100%)没有与拟南芥SE(NM _119938、NM _127848)优先表1 绞股蓝SE 基因和已知其它植物的SE 基因核苷酸与推导的氨基酸序列相似性比较T able 1 A lignment of F J906798and some plant SE nucleo tide sequences and am ino acid sequences in G enBankG e nBank 登录号A ccession N o.in GenBankSE 氨基酸长度L e ng th o f amino acid/bp科名Branch name种名Species相似性Similari t y/%核苷酸Nucleotide 氨基酸Amino a c idFJ906798525葫芦科Cucurbitaceae 绞股蓝Gy nostemma p entap hy l lum 100100A Y995182529茄科So l anaceae 毛曼陀罗Datura innox i a7779.4GU 574803531茄科So l anaceae 印度人参(睡茄)Wi thania som nif era 7778.4A J430609519豆科Fa baceae 蒺藜苜蓿Medicago t runcatula 7777.8A J430608526豆科Fa baceae 蒺藜苜蓿Medicago t runcatula 7777.3DQ366569524豆科Fa baceae 紫苜蓿Medicago sativa 8276.8FJ232947521毛莨科Ranuncul a c e ae 果黑种草N igel la sati va 7575.2AB253602531大戟科Euphorbiaceae 绿珊瑚Eup horbi a tirucal li 7675.1AB003516539五加科A raliaceae 人参Panax ginseng 7573.1AB122078536五加科A raliaceae 人参Panax ginseng 7572.9NM_119938525十字花科Cruciferae 拟南芥A rabidop sis t haliana 7372.9FJ393274545五加科A raliaceae 人参Panax ginseng 7672.8AB008021531十字花科Cruciferae 拟南芥A rabidop sis t haliana 7472.3NM_104624531十字花科Cruciferae 拟南芥A rabidop sis t haliana 7472.3DQ386734537五加科A raliaceae 三七Panax notoginseng 7472.2DQ457054537五加科A raliaceae 三七Panax notoginseng 7472.0GU 354314547五加科A raliaceae 辽东楤木A rali a el at a 7571.6NM_127848585十字花科Cruciferae拟南芥A rabidop sis t haliana7363.2图3 不同植物SE 氨基酸序列进化树括号中为GenBank 登录号F ig.3 Phylog enetic tr ee based o n am ino acid sequence o f SE in differ ent plantsIn th e brackets for GenBan k access ion No.1524西 北 植 物 学 报 30卷聚为一类,人参SE (FJ393274)也没有与人参SE (AB003516、AB122078)优先聚类合并.这有可能是因为它们本为同一基因家族不同成员,进化结果不一致,因此产生这种差异;也有可能是同一基因诱导方式的不同而形成不同转录本,从而导致蛋白的表达产生差异[6].3 讨 论三萜皂苷是植物次生代谢产物的重要组成部分,具有重要的药用价值,探讨植物三萜皂苷生物合成途径及相关酶基因调控的影响,对实现三萜皂苷的工业化生产这一目标具有重要意义.三萜皂苷含量和组分主要取决于生物合成关键酶以及在细胞中的表达水平,从克隆与三萜皂苷合成密切相关的关键酶基因入手,阐明三萜皂苷生物合成及其调控机制,利用人工调控增加三萜皂苷在植物细胞中的产量,这将为提高药用植物的经济价值开辟新的途径.近些年来,三萜皂苷生物合成关键酶基因研究成为植物次生代谢工程研究热点,积雪草、三七、柴胡、西洋参、人参等多种中药材三萜皂苷合成途径部分关键酶基因相继被克隆和鉴定,如积雪草法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophaophate synthase,FPS)[7],三七FPS [8]及鲨烯合酶(squalene synthase,SS)[9],柴胡3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A 还原酶(3-hydroxy -3-methylglutaryl coenzyme A reduetase,H MGR)、异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomer -ase,IPPI)、FPS [10]及SE [11],西洋参和人参FPS,SS,SE,H MGR,达玛烷合酶(Dammarenedio-l Òsynthase,DS),B 香树脂合成酶(B -amyrin synthase,B -AS)等基因[12].关于SE 基因转录和表达研究近年也有陆续报道.Choi 等[13]通过基因微阵列发现在人参发根的3134个表达序列标记(ESTs )中,SE 等3个基因与三萜皂苷合成量高度相关,茉莉酸甲酯(MeJA)可诱导SE 基因高表达增加三萜合成量;相反该酶在细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)作用下发生磷酸化时,三萜合成量会大幅度降低[14].脱乙酰壳多糖(50L g/m L)可以使人参SE 转录水平提高[15].而国内外对于绞股蓝皂苷生物合成关键酶基因研究尚未见报道.本研究首次克隆并报道了绞股蓝SE cDNA 全长序列,为进一步研究三萜皂苷生物合成机制及其在提高植物药用价值方面的应用奠定基础.近年来随着生物技术的不断发展,出现了许多克隆新基因的方法和手段,如图谱克隆技术、转座子标签技术、m RNA 差异显示技术、二基因组减法技术以及cDNA 文库筛选技术等.cDN A 完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要.但上述方法多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点.RACE 技术是1988年Fr oh -man 等[16]发明的一种基于PCR 从低丰度的转录本中快速扩增cDNA 的5c 和3c 末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势成为获得全长cDNA 的一种重要手段.RA CE 技术成功应用于基因的分离[17-19],充分显示了其广阔的应用前景.本研究通过酶的保守区域设计引物,采用RACE 技术,首次在绞股蓝中获得了SE cDNA 的全长序列.SE cDNA 全长序列的获得,一方面,可利用RNA 干扰技术进一步研究绞股蓝SE 基因编码区与调控序列;另一方面,还可以构建相应的表达载体对其功能进行深入分析,以阐明绞股蓝三萜皂苷生物合成的分子基础,探索提高绞股蓝三萜皂苷含量的有效方法.参考文献:[1] ZH ANG Y F(张云峰),WE I D(魏 东),DENG Y R(邓雁如),GU O S Y(郭祀远),CH EN F(陈 峰).Res earch developm ents on the b io -logical activities of triterpen e sapon ins[J].Chinese T r aditional P atent M ed icine (中成药),2006,28(9):1349-1353(in Ch ines e).[2] GOLDS TEIN J L,BROWN M S.Regulation of the mevalonate path way[J].N ature ,1990,343(1):425-430.[3] LIU F,REN D,GU O D,PAN Y,ZH ANG H ,HU P.M eth od developmen t for gypen os ides fin gerprin t by hig h perform ance liquid chroma -tography w ith 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