苯并笓的测定
【VIP专享】水质 苯并(a)芘的测定
乙酰化滤纸层析荧光分光光度法1 主题内容与适用范围本方法规定了测定水质中苯并(a)花[以下简称B(a)P]的方法。
本标准适用于饮用水、地面水、生活污水、工业废水。
最低校出浓度为0.004µg／L。
注意：B(a)P是一种由五个环构成的多环芳烃，它是多环芳烃类的强致癌代表物。
基于B(a)P的强致癌性，按本标准方法分析时必须戴抗有机溶剂的手套，操作应在白搪瓷盘中进行(如溶液转移、定容、点样等)。
室内应避免阳光直接照射，通风良好。
2 原理水中多环芳烃及环已烷可溶物经环己烷萃取(水样必须充分摇匀)，萃取液用无水硫酸钠脱水、浓缩，而后经乙酰化滤纸分离。
分离后的B(a)P用荧光分光光度计测定。
3 试剂除另有说明外，分析时均使用分析纯试剂和蒸馏水。
3.1 B(a)P标准溶液的配制：称取5.00mg固体标准B(a)P于50mL容量瓶中[因B(a)P是强致癌物，为了减少污染，以少转移为好]，用少量苯溶解后，加环已烷至标线，其浓度为100?g／mL。
特此贮备液用环己烷稀释成10?g／mL的标准使用液，避光贮于冰箱中。
3.2 乙酷化滤纸的制备：把15×30cm的层析滤纸15至20张卷成高15cm的圆筒状，逐张放入1000mL高型烧杯中，杯壁与靠杯的第一张纸间插入一根玻璃棒，杯中间放一枚玻璃熔封的电磁搅拌铁芯。
在通风柜中，沿杯壁慢慢倒入乙酰化剂(由苯十乙酸酐＋浓硫酸＝750mL＋250mL＋0.5mL混合配制成)，磁力恒温搅拌器的温度保持55±1℃.连续反应6h。
取出乙酰化滤纸，用自来水漂洗3～4次，再用蒸馏水漂洗2～3次，晾干。
次日用无水乙醇浸泡4h后，取出乙酰化滤纸，晾干压平，备用。
3.3 环己烷，重蒸。
用荧光分光光度计检查：在荧光激发波长367nm，狭缝10nm；荧光发射狭缝2nm，波长405nm应无峰出现。
3.4 丙酮，重蒸。
3.5 甲醇。
3.6 乙醚。
3.7 苯，重蒸。
3.8 乙酸酐。
苯并毕的测定
液相色谱法测定食品中苯并(a)芘 液相色谱法测定食品中苯并 芘
食品中苯并(a)芘在的测定方法有薄层层析法、荧光分光光度 法、气相色谱和液相色谱法，这里介绍液相色谱法。
4.1 原理
本法主要是利用样品经过提取、皂化或者液一液分配以及柱 层析净化，除去脂肪类物质、色素和多环芳烃以外的其他物质后， 再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环芳烃物质中分离 出来。求出样品中苯并芘的含量。
4.2 仪器
(1)液相色谱仪： 柱温：30℃； 色谱柱：ODS柱，柱长250mm，Φ4mm； 流动相：75％甲醇； 流速：2mL／min。
(2)检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长405nm。
4.3 操 作 步 骤
(1)定性测定 用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和样 液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加标准 样产生重叠情况进行定性。 (2)标准曲线的绘制 用微量注射器准确吸取每1mL含1μg的苯 并芘标准溶液1、2、3、4、5uL按照上述实验条件进行操作，以 获得相应的色谱图。然后，分别测量各个色谱的峰面积。以峰面 积为纵坐标，标准苯并芘量为横坐标，绘制标准曲线。 (3)样品的测定在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净化的 样品提取液，注入液相色谱仪中进行分离、分析，测得峰面积， 然后从标准曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。
4／g； A—从标准曲线中查出相当于苯并此的标准量，μg； m—样品的质量，g； P—点样体积与样品浓缩体积的比值。
4.5 说明及注意事项
(1)本法所用试剂及配制方法、样品的提取、净化步骤参照荧光 分光光第二篇食品理化检测技术度法。 (2)高效液相色谱分离多环芳烃的效果与洗脱液的比例、柱温和 流速等有关，其最适宜的条件随仪器而异。 (3)本法灵敏度为0.1ng／g。
食品安全国家标准食品中苯并(a)芘的测定编制说明
为 0.4ml（油脂）和 1ml（其他 3 种食品）。定容体积与取样量对应，便于结果计算。
进样体积：由 10μL 调整为 20μL。在色谱峰形对称的前提下提高了仪器检测灵敏度。
表 6 色谱参考条件的整合
序 参数
号
GB/T 22509
NY/T 1666
SC/T 3041
整合后
1
色谱柱
多环芳香烃柱
C18
次独立测试
次 独 立 测 试 差＜15%
次独立测试
结果的绝对
结果的绝对
结果的绝对
差值不大于
差值不大于
差值不大于
两个测定值
两个测定值
两个测定值
的算术平均
的算术平均
的算术平均
值 20%。
值 20%。
值 20%。
8、定量限
最低检测浓度 依据 GBT 27404-2008 对测定低限的计算公式
计算：标准曲线最低点
4、仪器和设备 检测仪器采用高效液相色谱仪，配有荧光检测器。该设备在食品检测实验室是通用设备。 5、分析步骤 5.1 试样制备
4
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把 4 种食品分成三类撰写。分别是植物性产品、动物性产品、液体油脂。
根据 GB 2760 附录 F《食品分类系统》，油脂及其制品分成不含水的油脂与水油状脂肪乳化制
国际标准：ISO 15302：2007《动植物油脂 苯并(a)芘的测定 反相高效液相色谱法》。
以上 2 个国外检测方法标准均采用高效液相色谱法。
2
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三、标准的重要内容及主要修改情况
与标准文本相对应，下面从范围、原理、试剂和材料、仪器和设、分析步骤、分析结果的表述、
动植物油脂中苯并(a)芘测定方法的制定及应用
动植物油脂中苯并(a)芘测定方法的制定及应
用
1 苯并(a)芘
苯并(a)芘（PAHs）是一类有毒多环芳香烃，包含一个或多个六元
环结构，通常以芘为主。
具有易燃性、有毒性和难降解等特点，能够
进入生物体，其中芘是16种重要的苯并(a)芘化合物之一，具有致癌、致畸、致突变、免疫毒性和其他潜在危害。
2 植物油脂中的苯并(a)芘
植物油脂中的苯并(a)芘是与农药运用、农作物栽培过程和烹调方
式有关的，可随植物油脂中脂肪吸收，存在机械污染也会使其含量增加。
而植物油脂一般都会在生活中消费，长期摄入会对人体产生危害。
3 植物油脂中苯并(a)芘测定方法
植物油脂中苯并(a)芘测定方法一般采用色谱-质谱联用仪，利用
柱质谱原理液相色谱婆罗门芘离子（m/z 212）测定植物油脂中苯并(a)芘含量。
测定方法要求用户必须熟悉色谱-质谱联用仪操作程序，准确
掌握柱层析原理及操作技术。
4 植物油脂中苯并(a)芘测定方法的使用
植物油脂中苯并(a)芘的检测标准建立后，植物油脂中苯并(a)芘
测定方法得到了广泛的应用，它可以用来监测植物油脂中苯并(a)芘的
分布，并可以帮助相关部门科学决策，防治环境污染，保护民众的健康。
苯并[a]芘的测定
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• 4、操作方法 • （1）样品提取 • 粮食及低水分含量食品 • 回流抽提，碱皂化6~8h（90下） • 皂化液趁热转移至分液滤斗 • 洗涤接收瓶（50mL95%乙醇） • 加水（100mL）振摇提取 • 静置分层 • 下层二次提取（70mL环已烷） • 合并环已烷 • 洗涤环已烷层（水，100mL×3） • 洗涤水环已烷提取（30mL×2） • 浓缩至40mL（60 ℃水浴中）
• （５）计算
• 相F 对 F荧40光6 强(度F401 F411) / 2
x
ms F
( Fi
F0 )
m V2 V1
• （二）HPLC法
• １、原理
•
用KOH-甲醇水（1:1）溶液皂化样品中脂肪，环已烷
提取多环芳烃（PAH），再经60%硫酸净化，Sephadex LH-
20色谱柱富集样品中PAH，用高效液相色谱仪检测。
• 二、食品中苯并[a]芘的来源 ➢ BaP是含碳燃料及有机化合物热解过程中的产
物，是煤、石油、天然气、木材等不完全燃烧 的产物。 • 空气中BaP含量为0.01~100μg/m3; • 地表水中BaP含量为0.03~0.1μg/L; • 土壤中BaP含量为0~400μg/kg
➢在熏烤、烘烤过程中形成 • 燃烧产物与食品的直接接触、烟尘与食品的
• 植物油
环已烷100mL
DMF40mL×3
称样20g
分液滤斗
提取
环已烷层 DMF层
环已烷40mL
DMF层
提取
环已烷层 弃去 2%硫酸钠240mL
DMF层
分液滤斗
环已烷100mL×2
混匀 提取
• 鱼、肉及其制品 • 称样， • 加无水硫酸钠（1：1或1：2）搅拌 • 环已烷抽提取 • 蔬菜 • 称样、晾干、加丙酮（150mL）捣碎， • 过滤至分液滤斗 • 加水、 环已烷提取 • 环已烷重复提取 • 环已烷层洗涤（水，125mL×2） • 浓缩至25mL
苯并[a]芘的测定
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植物油
环已烷100mL DMF40mL×3
称样20g
分液滤斗
提取
环已烷层 DMF层
环已烷40mL
DMF层
提取
环已烷层 弃去 2%硫酸钠240mL
DMF层
分液滤斗
环已烷100mL×2
混匀 提取
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鱼、肉及其制品 称样， 加无水硫酸钠（1：1或1：2）搅拌 环已烷抽提取
蔬菜 称样、晾干、加丙酮（150mL）捣碎， 过滤至分液滤斗 加水、 环已烷提取 环已烷重复提取 环已烷层洗涤（水，125mL×2） 浓缩至25mL
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加工环节的污染 设备管道 酱油、醋、酒、饮料 包装材料 糖果、面包、冷饮包装用蜡纸 润滑油等
工业废水、废气的污染 三废的排放 沥青的利用（沥青中苯并芘含量为2.5~3.5%）
细菌、原生生物、淡水藻类及某些高等植物的组织内 合成 藻类、水生植物BaP含量为0.005 μg/kg 植物BaP含量0.01~0.02μg/kg
（５）计算 相对荧光强度
F F406 (F401 F411) / 2
x
ms F
( Fi
F0 )
m V2 V1
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（二）HPLC法 １、原理
用KOH-甲醇水（1:1）溶液皂化样品中脂肪，环已烷提 取多环芳烃（PAH），再经60%硫酸净化，Sephadex LH20色谱柱富集样品中PAH，用高效液相色谱仪检测。 ２、操作方法 （１）皂化
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3、仪器 脂肪抽提器 层析柱（10cm×350cm） 层析缸 K-D浓缩器 紫外灯 荧光分光光度计
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4、操作方法 （1）样品提取 粮食及低水分含量食品
苯并(α)芘的测定
2 日最低摄入量（ug）
美国0.16～1.6；荷兰0.12～0.42；英国0.48； 意大利0.1～0.3；德国0.02～0.14；奥地利0.36
3 限量值
欧盟规定食品中苯并芘的含量最高为2ppb。 我国植物油卫生标准规定为含量不得超过10ppb。
四 苯并芘的测定方法
1 相关检测方法
（1）GB/T 22509-2008
2 在食物的加工过程中形成
热加工（如熏烤）是食品中苯并芘的重要污染途 径。在高温加工时，食物中的脂类物质会分解而形 成多环芳烃类物质，其中就包括苯并芘。
三 国内外食品中苯并芘状况
1 残留量
各国食用植物油中苯并芘均有一定量的残留。 欧洲食用植物油苯并芘含量范围为0.08～0.72ppb, 美国为0.9～2.4ppb。
吸附、洗脱、分离、检测
2.3 剂和材料
水、石油醚、四氢呋喃、乙睛、中性氧化铝、 苯并芘标准品
2.4 仪器设备
高效液相色谱仪、层析柱、恒温水浴锅、旋转 蒸发仪
2.5 操作过程
①净化：层析柱
②洗脱：石油醚 ③收集、浓缩样品 ④测定：色谱条件 ⑤标准曲线的绘制 ⑥样品分析
2.6 注意事项
①试剂的毒性
五 苯并芘检测方法研究进展
快速检测法
厦门大学 “食品中强致癌苯并芘快速检测仪” 该检测仪及其检测方法属国内外首创，研究成果 达到国际先进水平。 首次将导数恒能量同步荧光法应用于食品中强致 癌苯并芘的快速检测中。 可对食品中多种多环芳烃同时进行高灵敏度、高 选择性检测分析。
谢谢大家！
动植物油脂中苯并（ ） 动植物油脂中苯并（α）芘的测定 反相高效液相色谱法
湖南省产商品质量监督检验院 袁列江
一 苯并芘简介
植物油脂中苯并(a)芘的测定-高效液(精)
植物油脂中苯并（a ）芘的测定-高效液相色谱法本方法参考国标方法：动植物油脂苯并（a ）芘的测定反相高效液相色谱法，GBT 22509-2008；该国标源自ISO 15302:2007，MOD 方法。
相关技术差异为：对仪器设备作了改动；氧化铝柱采用天津博纳艾杰尔科技有限公司的商品氧化铝固相萃取柱；将洗脱溶剂改为采用重蒸后的石油醚；待测液定容体积改为300µL，采用仪器自动进样，进样量为20µL；采用外标法定量计算。
方法内容：1．适用范围本方法适用于动植物油脂中苯并（a ）芘的检测。
本方法的最低检出限为0.3-0.5µg/Kg，该最低检出限为对应所使用的仪器的检出限，因此仪器荧光检测器的灵敏度对应检出限。
2．方法原理样品经石油醚溶解，通过商品氧化铝固相萃取柱（活度为Ⅳ级，粒径大小为100-200目）吸附脂肪酸等，用石油醚洗脱苯并（a ）芘，采用反相高效液相色谱法分离，荧光检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，采用峰面积外标法定量。
3．试剂与材料3.1 色谱纯正己烷；石油醚，每升加4g 氢氧化钾重蒸；3.2 氧化铝固相萃取柱：100-200目，brockmann 活度Ⅳ级，在室温下避光保存，天津博纳艾杰尔科技有限公司；3.3 苯并（a ）芘标准储备液：称取10mg 标准品于10ml 容量瓶中，用正己烷定容，配制的标准储备液浓度为1000mg/L；3.4 标准工作液：用正己烷稀释标准储备液，稀释的浓度为10µg/L。
4．仪器和设备4.1 旋转蒸发仪，大于150ml 的圆底旋蒸瓶或鸡心瓶，勿用平底旋蒸瓶；4.2 氮吹仪；4.3 涡旋混合器；QL-866 江苏海门产；4.4 2ml色谱瓶；4.5 250µL色谱瓶玻璃内插管；4.6 高效液相色谱仪，配自动进样器，荧光检测器。
5．样品前处理5.1 样品净化称取约0.300g 的油样，用5ml 石油醚溶解涡旋混合器上充分混匀。
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苯并(a)芘的测定
乙酰化滤纸层析荧光分光光度法
1 主题内容与适用范围
本方法规定了测定水质中苯并(a)花[以下简称B(a)P]的方法。
本方法适用于饮用水、地面水、生活污水、工业废水。
最低校出浓度为0.004μg/L。
注意：B(a)P是一种由五个环构成的多环芳烃，它是多环芳烃类的强致癌代表物。
基于B(a)P的强致癌性，按本方法方法分析时必须戴抗有机溶剂的手套，操作应在白搪瓷盘中进行(如溶液转移、定容、点样等)。
室内应避免阳光直接照射，通风良好。
2 原理
水中多环芳烃及环已烷可溶物经环己烷萃取(水样必须充分摇匀)，萃取液用无水硫酸钠脱水、浓缩，而后经乙酰化滤纸分离。
分离后的B(a)P用荧光分光光度计测定。
3 试剂
除另有说明外，分析时均使用分析纯试剂和蒸馏水。
3.1 B(a)P标准溶液的配制：称取5.00mg固体标准B(a)P于50ml容量瓶中[因B(a)P 是强致癌物，为了减少污染，以少转移为好]，用少量苯溶解后，加环已烷至标线，其浓度为100μg/ml。
特此贮备液用环己烷稀释成10μg/ml的标准使用液，避光贮于冰箱中。
3.2乙酷化滤纸的制备：把15×30cm的层析滤纸15至20张卷成高15cm的圆筒状，逐张放入1000ml高型烧杯中，杯壁与靠杯的第一张纸间插入一根玻璃棒，杯中间放一枚玻璃熔封的电磁搅拌铁芯。
在通风柜中，沿杯壁慢慢倒入乙酰化剂(由苯十乙酸酐＋浓硫酸＝750ml＋250ml＋0.5ml混合配制成)，磁力恒温搅拌器的温度保持55±1℃.连续反应6h。
取出乙酰化滤纸，用自来水漂洗3～4次，再用蒸馏水漂洗2～3次，晾干。
次日用无水乙醇浸泡4h后，取出乙酰化滤纸，晾干压平，备用。
3.3环己烷，重蒸。
用荧光分光光度计检查：在荧光激发波长367nm，狭缝10nm；荧光发射狭缝2nm，波长405nm应无峰出现。
3.4丙酮，重蒸。
3.5甲醇。
3.6乙醚。
3.7 苯，重蒸。
3.8乙酸酐。
3.9硫酸，ρ＝1.84g/ml。
3.10无水硫酸钠。
3.11
二甲基亚矾(DMSO)：用前先用环已烷萃取两次(500ml二甲基亚矾加50ml环已烷萃取)。
弃去环己烷后备用。
4 仪器
常用实验室设备和下列仪器。
4.1备有紫外激发和荧光分光的荧光分光光度计，光程为10mm的石英比色皿。
4.2紫外分析仪(带365nm或254nm的滤光片)。
4.3康氏振荡器。
4.4磁力恒温搅拌器。
4.5立式离心机，转速为4000r/min。
4.6分液漏斗，1L、3L、100ml。
活塞上禁用油性润滑剂，活塞直接用水或有机溶剂润滑即可。
4.7锥形瓶，250ml。
具磨口玻璃塞。
4.8恒温水浴锅。
4.9层析缸。
4.10具磨口塞刻度离心管，5ml。
4.11点样用玻璃毛细管(自制)。
4.12分析天平、感量0.01mg。
5 样品保存
水样应贮于玻璃瓶中并避光，当日(24h内)用环己烷萃取，环已烷萃取液放入冰箱中保存。
6 步骤
6.1 样品和标样的预处理
6.1.1 清洁水和地面水萃取
取充分混匀的清洁水样2000ml放入3000ml分液漏斗中，用环己烷萃取两次，每
次用50ml，在康氏振荡器上每次振荡3min，取下放气，静置半小时，待分层后，将两次环已烷萃取液收集于具塞锥形瓶中，弃去水相部分。
6.1.2 工业废水的萃取
取混匀的工业废水样1000ml，放入1000ml分液漏斗中，每次用50ml环已烷萃取两次，在康氏振荡器上每次振荡3min，取下放气，静置半小时，待分层后，将两次环已烷萃取液收集于具塞锥形瓶中，弃去水相部分。
6.1.3 脱水、浓缩
在(上述)环已烷萃取液中加入无水硫酸钠(约20～50g)，静置至完全脱水(约1～2h)，至具塞锥形瓶底部无水为止。
如果环已烷萃取液颜色比较深，则将脱水后环已烷定容至100ml，分取其一定体积浓缩；如果颜色不深则全部浓缩。
在温度为70～75C 用KD浓缩器减压浓缩至近干，用苯洗涤浓缩管壁三次，每次用3滴，再浓缩至0.05ml，以备纸层析用。
6.1.4 纸层析分离
在乙酰化滤纸30cm长的下端3cm处，用铅笔画一横线，横线两端各留出1.5cm，以2.4cm的间隔将标准B(a)P与样品浓缩液用玻璃毛细管交叉点样。
点样斑点直径不超过3～4mm。
点样过程中用冷风吹干。
每支浓缩管洗两次，每次用一滴苯，全部点在纸上。
将点过样的层析滤纸挂在层析缸内架子上，加入展开剂[甲醇＋乙醚＋蒸馏水＝4＋4＋1(体积比)]，直到滤纸下端浸入展开剂1cm为止。
加盖用透明胶纸密封。
于暗室中展开2～4h。
取出层析滤纸，在紫外分析仪照射下用铅笔圈出标样B(a)P斑点以及样品中与其高度(Rf值)相同的紫蓝色斑点范围。
剪下用铅笔圈出的斑点，剪成小条，分别放入5ml具塞离心管中。
在105～110℃烘箱中烘10min(亦可在干燥器中或干净空气中晾干)。
在干燥器内冷却后、加入丙酮至标线。
用手振荡1min后，以3000r/min的速度离心2min。
上清液留待测量用。
6.2 测定
将标准B(a)P斑点和样品斑点的丙酮洗脱液分别注入10mm的石英比色皿中，在激发、发射狭缝分别为10nm、2nm，激发波长为367nm处，测其发射波长402nm、405nm、408nm处的荧光强度F。
7 结果的表示
用窄基线法按下列公式计算出标准
B(a)P 和样品B(a)P 的相对荧光强度，再计算出B(a)P 的含量C(用相对比较计算法)。
相对荧光强度2
408
402405F F F F nm +-
= R V
F F M C ⨯⨯⨯=标准样品
式中：
C ——水样B(a)P 含量，μg/L ； M ——标准B(a)P 点样量，μg ；
标准F ——标准B(a)P 的相对荧光强度； 样品F ——样品斑点的相对荧光强度；
V ——水样体积，L ；
R ——环己烷提取液总体积与浓缩时所取的环己烷提取液的体积之比值。
8 精密度与准确度
8.1精密度
五个实验室自行配制的含有
B(a)P 近似O.2μg/L 的焦化废水的精密度见表1。
表1 精密度
8.2准确度
两种工业废水的加标回收率见表2、表3。
表2 焦化废水加标回收结果
表3 沥青废水加标回收结果
附录A 对除去B(a)P干扰物的说明
(补充件)
A1石油、含油废水按下面操作进行
将上述(6.1.2)100ml环己烷萃取液定容后取出20ml，放入100ml分液漏斗。
用DMSO萃取2次，每次5ml，用手振荡2min，注意放气，静置半小时。
待分层后收集两次萃取的DMso液于另一个100ml分液漏斗中，弃去环己烷液。
于盛有10mlDMSo 液的分液漏斗中加入事先用冰冷却过的1：1HCl15ml，冷却至室温，再用环己烷反萃取两次，每次5ml，用手振荡2min，注意放气。
合并两次环己烷萃取液10ml于另一个100ml分液漏斗中，加5ml15％NaOH溶液洗一次，振荡两分钟，弃去NaOH液层。
再用蒸馏水洗2—3次，每次15ml，直至洗涤后的蒸馏水pH＝7，弃去水相，将环己烷萃取液加无水流酸钠脱水后，在KD浓缩器上浓缩。
以下步骤包括乙酰化滤纸层析分离，荧光分光光度计测量，计算与(7)相同。
A2测量后的B(a)P丙酮洗脱液切勿随意丢弃，可放入通风柜中专用大烧杯中，统一处理。
A3本实验均应在避免阳光直接照射下进行。
A4所用玻璃器皿必须用洗液浸泡4h以后洗涤。
附加说明：
本方法来源于GB 11895—89。