waters色谱柱相关知识
Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择
Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择2016-04-25 Bruce Lee生产高效液相色谱柱的厂家有很多，如Waters，Agilent，Phenomenex，Shimadzu，Thermo等，每家供应商又生产多个系列，导致市场上的液相色谱柱的可选择性极强。
目前实验室以及公司，企业使用最多的是Waters以及Agilent所生产的RP液相色谱柱。
Waters主要有Symmetry，Sunfire，XTerra，XBridge，XSelect，CORTECS以及Atlantis系列等，其详细分类以及键合相如下。
Figure 1 Waters Symmetry column familyFigure 2 Waters Sunfire column familySymmetry与Sunfire系列色谱柱使用高纯度硅胶（B型）作为固定相基质，摒除金属离子杂质对固定相Si-O键的促进水解作用，此外由于金属离子含量特别低，在对其表面键合选择性烃基或内嵌极性官能团烃基时，可通过配体添加量控制硅胶表面键合相的多少，因此其最大特点在于批次之间的重现性。
两个系列均采用封端技术，Sunfire C8与C18表面载碳量分别为12%和16%；SymmetryC8与C18载碳量均为12%，因此两个系列的C8色谱柱对于分析物的保留能力上没有本质的区别，而Sunfire C18色谱柱则相比Symmetry C18色谱柱，对于非极性比较大的分析物具有更强一些的保留能力，当然对于有机相的最低比例也相对比较高一些。
Symmetry C8 Prep与C18 Prep色谱柱的填料粒径为7 um，其设计用途为制备；Symmetry300 C18（孔径300埃，载碳量8.5%）与Symmetry300 C4（孔径300埃，载碳量2.8%）则是为生物大分子多肽以及蛋白质的分离，分析而设计。
Symmetry Shield RP 18内嵌极性官能团色谱柱，由于在靠近硅胶表面的极性官能团的存在，增加了硅胶表面的水分子浓度，改善了与水之间的浸润状况;因此可以允许使用极高水相作为分离，分析条件，而不会出现孔隙内去湿现象，对于分析碱性等大极性分析物而言，减少其保留能力，改善峰形，具有很高的方法重现性。
waters液相色谱柱的活化
waters液相色谱柱的活化
Waters液相色谱柱的活化方法如下：
1. 使用新的C18柱时，先用甲醇或乙腈冲洗20-30个柱体积，然后用甲醇/乙腈：水（50:50）冲洗10个柱体积，然后再用流动相平衡10-30柱体积。
2. 若流动相含有缓冲盐，用跟流动相中盐相等比例的超纯水和有机相冲洗过渡，用量为20倍柱体积，再用含缓冲盐的流动相平衡色谱柱，用量为20倍柱体积或以上。
3. 当用HILIC模式时，新柱用50倍柱体积50/50乙腈/水活化平衡，然后再用流动相平衡20个柱体积。
另外，当出现拖尾或者柱压升高时，可以考虑将正向进口端拆开，并将筛板超声清洗干净，有时候效果很好。
若使用正相色谱柱时，用异丙醇或乙醇冲洗色谱柱50-100个柱体积。
以上信息仅供参考，具体操作建议咨询专业人士。
[课件]常用液相色谱柱原理及使用与维护保养PPT
![[课件]常用液相色谱柱原理及使用与维护保养PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/0f2fca3cb7360b4c2e3f64f8.png)
能团与Si-OH 键合）→端基封口（对残余的Si-OH 用小分子的氯-甲基、氯乙基键合 ）→润湿混合（加乙醇等调匀，其配方各厂家均有专利保护）→ 装填（机械装填或手工装填，层层装填，压紧，润湿）→高压平衡（轴向加
压或径向加压，各厂家均有专利保护）→干燥（此步为关键工艺步骤，各厂
家均有专利保护）→削平→组件安装→预平衡→柱效测试流动相平衡→柱效 测试→封口→包装
小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成， 用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
+ 1.3
液相色谱柱的分类与应用范围 分类方法很多，可按键合相类型、用途（分析 型与制备型）、基质种类等进行分类。 1.3.1硅胶基质柱（4大类）
目前，分析型液相色谱柱多为硅胶基质柱，细分为： 高纯硅胶柱：以高纯度硅烷化硅胶（Silica）为填料，应用范 围较广，但只能在PH2.0-7.5，小于60度的条件下使用。又由 于强极性硅羟基（Si-OH)的次级保留效应较强，所以应用受 到局限，已被键合相柱所取代。 反相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合弱极性官能 团的固定相。目前多用C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、 C6H5（phenyl，苯基）等。用于分离大多数有机化合物，应 用范围最广。
1.3.5.4其他无机物填料柱
如氧化铝、石墨化碳、氧化锆、硅藻土等，主要作制备色谱用。
1.4液相色谱柱制备工艺简述
不同品牌色谱柱制备工艺各异，但都可归纳为如下流程 （以硅胶柱为例）：
硅烷化硅胶制备（四乙氧基硅烷脱乙基与聚合）→Si-OH 基暴露（ 脱乙基， 置换成H）→海绵状多孔硅胶构造（物理匀质过程）→官能团键合（各种官
异构体；氧化铝柱刚性强，柱床稳定，可分离多种化合物且多
waters xbridge protein beh色谱柱使用说明
waters xbridge protein beh色谱柱使用说明1. 引言1.1 概述在生物医学研究和制药领域中，蛋白质是至关重要的研究对象。
为了更好地理解蛋白质的结构和功能，科学家们需要利用高效的色谱柱来进行分离和纯化。
Waters XBridge Protein BEH色谱柱作为一种先进的工具，能够提供快速、高效、稳定的蛋白质纯化解决方案。
1.2 文章结构本文将对Waters XBridge Protein BEH色谱柱进行详细介绍，并提供使用说明和操作技巧。
首先，我们将概述该色谱柱的基本情况，包括其结构和特点。
接着，我们将讨论该色谱柱的工作原理，并阐述其在不同应用领域中的优势和适用性。
然后，我们将详细介绍如何准备样品并装载到色谱柱中，以及如何设置合适的色谱条件来实现最佳分离效果。
最后，我们将介绍一些注意事项、常见问题解答以及安全须知与储存要求。
通过阅读本文，读者能够全面了解Waters XBridge Protein BEH色谱柱的使用方法，并能够在实验中取得准确可靠的结果。
1.3 目的本文旨在向用户提供关于Waters XBridge Protein BEH色谱柱的详细说明，帮助用户正确并高效地使用该色谱柱进行蛋白质纯化。
我们希望通过本文的阐述，读者能够深入了解该色谱柱的特点和应用领域，并能够根据具体实验需求，熟练掌握样品准备、色谱条件设置以及数据分析与结果解读等技巧，从而为自己的科研工作或制药生产提供有力支持。
2. Waters XBridge Protein BEH色谱柱2.1 色谱柱概述：Waters XBridge Protein BEH色谱柱是一种高性能液相色谱（HPLC）柱，主要用于蛋白质和肽段的分离和纯化。
该色谱柱具有独特的粒径和孔隙结构，能够提供出色的分离效果和样品回收率。
2.2 工作原理：Waters XBridge Protein BEH色谱柱采用亲水性强的氢化硅胶作为填料材料，通过调节流动相中溶剂成分和温度等条件，实现对不同蛋白质和肽段的选择性分离。
watershsst3色谱柱说明书
watershsst3色谱柱说明书Waters HSS T3色谱柱是一种高效液相色谱柱，被广泛应用于生命科学、制药、环境和食品分析等领域。
该柱具有优异的分离性能和稳定性，可用于分离复杂的混合物，提供准确和可靠的分析结果。
以下是关于Waters HSS T3色谱柱的详细说明：1. 柱材料：Waters HSS T3色谱柱采用高质量的硅胶材料制成，具有特殊的表面处理，能够提供优异的色谱性能和稳定性。
2. 柱尺寸：Waters HSS T3色谱柱的常见尺寸为4.6mm乘250mm，具有较大的分离能力和样品容量。
此外，还提供其他规格的色谱柱可供选择。
3. 分离性能：Waters HSS T3色谱柱具有极好的分离性能，可有效分离复杂样品中的成分。
其独特的柱底和柱壁结构可以增强样品和柱相之间的相互作用，提高分离效果。
4. 稳定性：Waters HSS T3色谱柱具有出色的稳定性和重现性，可持续运行大量样品分析而不产生漂移或降解。
柱底和柱壁的特殊表面处理使得该色谱柱不易受到污染和损害，有助于保持柱的使用寿命。
5. 应用范围：Waters HSS T3色谱柱广泛适用于各种样品类型的分析，包括有机化合物、天然产物、药物、代谢产物等。
它可用于定量和定性分析，以及结构鉴定和纯化工作。
6. 色谱条件：Waters HSS T3色谱柱适用于反相液相色谱和离子对色谱法。
在反相液相色谱中，可以使用不同的流动相和梯度条件来优化分离效果。
在离子对色谱中，可以添加离子对试剂来改变运行条件。
7. 包装和存储：Waters HSS T3色谱柱以高压不锈钢柱体包装，旨在保护柱底和柱壁免受损坏和污染。
柱体上标有批号和有效期，以便用户能够正确追踪使用日期和有效期限。
该色谱柱应存放在避光、干燥和温度控制的环境中，以确保其质量和性能。
总之，Waters HSS T3色谱柱是一种优质的色谱柱，具有卓越的分离性能和稳定性，适用于各种复杂样品的分析工作。
液相色谱柱使用原则和waters超高压柱特点
液相色谱柱使用原则和waters超高压柱特点1、何谓常规反相色谱柱？那些在硅胶或杂化基质颗粒上键合了如C18、C8、C4或苯基等键合相的色谱调料所装的色谱柱，按反相色谱条件进行操作和分离。
反相是液相色谱中最常使用的分离模式，而C18柱是最常使用的反相色谱柱之一。
2、新色谱柱开启和安装的推荐步骤：1、使用新鲜洁净的水与乙腈。
冲洗系统，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。
2、取用色谱柱时避免磕碰掉落。
3、将色谱柱入口端接到系统上，柱出口端先不要连接，色谱柱身上有箭头表明正确流向。
4、在0.1mL/min流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱，然后在2分钟内将流速升至0.5mL/min。
5、当溶剂均匀的从柱出口端流出，停流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上（这样可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡）。
6、重启流速，按照步骤4的方法逐渐提高流速，至常规分析时所使用的流速。
7、参考柱效测试报告中的方法，使用该流动相条件平衡色谱柱，通常需要使用5-10倍柱体积的流动相，直至压力与基线稳定。
8、测试柱效。
注：1、当使用2.1mm内径色谱柱时，建议优化系统以减少谱带展宽，包括：使用检测器微量流通池，减少进样器loop环体积，使用较小内径（如0.005或0.12mm）的系统管路。
确保管路与色谱柱连接恰当，无死体积。
2、当使用小颗粒填料（如2.5um）短柱进行高效快速分离时，需要考虑一下因素：1）、确保管路与色谱柱连接恰当、无死体积，尽量优化系统减少谱带展宽；2）、提高采样频率至10点/秒以上；3）、较小粒径的色谱柱产生的柱压较高，而较小粒径要达到最优色谱效率所需的线速度较高，请根据所用LC系统的实际情况条件流速；4）、可使用较高的柱温来补偿小颗粒造成的压力升高，例如40℃。
使用杂化颗粒反相色谱柱时，可使用45℃或者更高。
3、进行实际样品分析的推荐步骤：1、确保流动相洁净，每隔24-48小时就应新配水相流动相，并同时更换或仔细清洗流动相溶剂瓶，以避免流动相长菌。
waters色谱柱相关知识
流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例
Good Column
Inject
用“5”法计算柱效
色谱柱的正确使用及操作
流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
正确使用色谱柱（一）
样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
对HPLC柱填料的了解(五)
填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）
残基处理的效果
NovaPak C18
未封口 C18
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺
对HPLC柱填料的了解（六）
硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k' 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志
加速色谱柱寿命试验： (pH 10 ，50 °C)
寿命 (小时)
Xterra: 快梯度分析
AU
0.00
0.10
0.20
Minutes
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
HPLC色谱柱介绍课件
Analyte
必须允许流动相进入内孔以 保证待分析和分离的化合物 能够和色谱填料有保留
©2014 Waters Corporation
12
键合方式：单点键合
O
OH
Si
O
+
O
H3C C C C C Si C C C C3 H
Cl C3 H
H3C
C
C
Si
C
O
O
Si O
C H3
O
C
C
C
C C H3
+ HCl
©2014 Waters Corporation
20
对色谱柱填料的了解(二)
填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）
©2014 Waters Corporation
21
残基处理的效果
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺
硅 胶 的 溶 解 曲 线
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
©2014 Waters Corporation
27
硅胶表面键合相的水解（PH<2）
©2014 Waters Corporation
O
OH
Si
O
+
O
H3C C C C C Si C C C C3 H
Cl C3 H
O
+ H3C
C
C
C
300 – 1,000 Å (30 -100 nm)
无孔填料
注意：孔径是分布值
Si-OH = 硅羟基 (Silanol)
©2014 Waters Corporation
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色谱柱化学及外形结构的关系
液 相 色 谱 柱
填料 柱管
颗 粒 表 面 性 质
颗 粒 度 长 度 径 内 料 材
化 学 性 质 ∶ k ， 分 辨 率
a
机 械 因 素 ∶
N
寿 命 ， 柱 效 ， 速 度 ， 溶 剂 消 耗
对HPLC柱的了解
理 论 塔 板 数 (N), 容 量 因 子 (K’), 选 择 性 系 数 (a),其影响因素有∶ N：受平均颗粒度及颗粒度分布的影响,颗 粒度越小,N越高 a：受填料表面化学性质对色谱柱的影响, 不同键合相对不同种类样品分离不同 K’ ：受键合相表面含碳量的影响 , 含碳量 高 时保留时间长
Waters特殊应用的色谱柱(3)
Waters生命科学专用柱(1)
蛋白，多肽的分析和提纯
Protein-Pak系列凝胶柱
Protein-Pak系列离子交换柱
– 弱阴离子/ DEAE 弱阳离子/ CM – 强阴离子/ Q 强阳离子/ SP
疏水回受柱 亲合色谱柱 反相柱
DNA分析，同蛋白分析相近，但有些专用柱
XTerra™ MS C18 C18-Silica A C18-Silica B C18-Silica C C18-Silica D C18-Silica E C18-Silica F C18-Silica G
0
6
12
18
24
30
36
42
寿命 (小时)
Xterra: 快梯度分析
0.20
AU0.10
Waters特殊应用的色谱柱(4)
Waters生命科学专用柱(2)
糖蛋白的寡聚糖分析及纯化
离子交换柱(酸性)，Glyco-Pak
DEAE 分配柱(中性)，Glyco-Pak N (7.8×300mm) Carbohydrate Analysis
儿茶酚胺分析柱
Resolve
C18 (传统方法)、Symmetry C8
Waters色谱柱的内径
分析柱：Waters Spherisorb及其它公司品牌的 色谱柱多为 4.6mm 内径。 Waters 传统品牌的分 析柱以3.9mm内径为主，比一般分析柱(4.6mm) 细，因此： 相对灵敏度高 省溶剂，可用相对较低的流速 同样的流速下，柱压较高(高效柱尤为明显) 注意在用文献方法时转换流速 , 即 : 降低流速 , 以 保持线速度相同。
99.8 %
99.6 %
Waters 21,379
超越极限：全新Xterra色谱柱
集硅胶与聚合物基质填料的优点为一体,突破常规 高效色谱柱的极限 高效、高速分离
不仅能够使用极小粒径的填料以进行高分辨及快
速分析，而且允许在高温下进行分离
峰形优异 --对碱性化合物尤其如此 pH范围可与聚合物基质色谱柱相比
NovaPak C18 Styragel HR 100A及500A柱有效地分离。
胆甾醇及未皂化的油中的抗氧剂的分析
离子排斥类型色谱柱，用于有机酸，醇和碳水化合 物类的分析，适合于分析单糖类、有机酸或糖酸 离子排斥及反相混合类型的色谱柱，可测定葡萄酒 、啤酒或其他饮料中的乙醇及有机酸的种类及含量， 以确定其香型
氨基酸分析柱
离子交换柱
反相柱：Pico-Tag方法，AccQ-Tag方法
液相色谱实用技术（二）
色谱柱的使用及保养
色谱柱与仪器的联接
不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时,会造 成：
色谱峰展宽(死体积)致使柱效下降或渗漏
解决办法∶
自制相应的转换接头 使用“通用”型接头（锥箍及螺母）
氨基类型柱
分析单糖、双糖及三糖等多糖的分析，最大到DP10。用途较 为广泛，主要用于食品中糖的分析。
反相类型柱 硅胶类型柱 体积排除(凝胶/GPC)类型柱
Waters特殊应用的色谱柱(2)
食品中常见有机物的分析
游离脂肪酸(Free Fatty Acid)分析 甘油三酯及胆甾醇(俗称胆固醇)的分析
C%
19 17 15 12 12 11 11 10 7
k'苊 (50/50的乙腈/水)
17 15.7 10.3 12.5 12.4 11.3 12.0 7.9 5.5
对HPLC柱填料的了解(五)
填料的端基封口
封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）
残基处理的效果
对HPLC柱填料的了解（二）
平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布
大的孔径可分析高分 子量的分子
对HPLC柱填料的了解（三）
键合相化学
影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN
硅胶表面及键合相
H C 3 C H 2 H C 2 C H 2 H C 2 C H 2 H C 2 H C 3 C H 2 H C 2 C H 2 H C 2 H C 3 H C 3 C H 2 C H 2 H C 2 H C 2 C H 2
键合相色谱柱
以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳 八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点∶
固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响
缺点∶
pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
对HPLC柱填料的了解（四）
含碳量
含碳量越高，k'值越大（固定相传质效应增加）
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺
NovaPak C18
未封口 C18
对HPLC柱填料的了解（六）
硅胶的活性
主要影响碱性化合物的保留行为：k' 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源
硅胶的杂质含量
重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志
这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即 stop-depth 的长度 可调。因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从 Waters Phase Separations 公司能得到一些 PEEK工程塑 料的接头,可用在各种类型的色谱柱上。
2 1 3
C18-Silica
10 20
USP T =2.28
4 5
0
Time (min)
30
Alden, Iraneta
宽 pH 范围
在pH 使pH
1-12范围内保持稳定
成为改变选择性的有力工具
使可在非离子状态下进行分析
碱性物质的稳定保留
加速色谱柱寿命试验： (pH 10 ，50 °C)
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
2.20
2.40
Minutes
Waters特殊应用的色谱柱(1)
糖及其它碳水化合物的分析
离子交换柱(钙基/Ca)
用于单糖、双糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析。 主要用于药厂维生素C的原料分析(sorbitol/mannitol-山梨 醇/甘露醇)，酒厂(葡萄酒、啤酒等)的糖及乙醇含量的分析。 柱温~90℃，要求有柱温箱。对流动相(水)的要求较高，要求 用户另置超纯水系统。
对HPLC柱填料的了解（七）
填料的稳定性
硅胶填料 pH：2-8
聚合物填料
硅 胶 的 溶 解 曲 线
pH：2-12 pH值小于2时 键合相水解
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
填料基质物理性质的影响
所有C18柱都是相同的吗? 填料基质的物理性质对色谱柱的影响
平均孔径及其分布∶影响被分析样品的分子量，大孔径的可 分析高分子量样品 平均孔体积及其分布∶影响同孔径 含碳量∶影响化合物的保留时间，高含碳量保留时间长 填料的端基封口 ∶主要影响碱性化合物的峰形，未封口会使 碱性化合物拖尾 硅胶的活性 ∶ 主要影响碱性化合物的保留行为： K’ ，高活 性的K’大 硅胶的杂质含量∶更苛刻条件下的碱性化合物峰形
C1 C4 C6 C8 C18 Phenyl CN NH2
mBandaPak
Resolve Nova-Pak Delta-Pak Symmetry Spherisorb
Waters不同品牌的色谱柱
m-BondaPak
文献背景强, 是工业标准 平均孔径125Å，10mm高活性、无定形硅胶 中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性
Nova-Pak
平均孔径60Å，4mm高韧度低活性球形硅胶 低酸性，高疏水性, 极好的端基封口 有利于小分子物质的分析
Waters不同品牌的色谱柱
Resolve
平均孔径90Å，5/10 mm低活性硅胶 非常高的疏水性, 无端基封口 有利于低保留的中性及酸性化合物分离
C H 2 H C 2
H C 2
C H C H 2 2 C H 2 H C H C 2 2 H C 2
C H C H 2 2 C H C H C H C H 2 2 3 3 H C H C 3 3 H C H C C H H C H C C Hi 3 3 3 3 3 C H C HS C H C H i 3 S S i 3 S i 3 S i 3 i 3 S H H H H H H O H O O O O O O O O O O O O S i S i S i i S i i S i S S i S i S i S i S O S i O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O