肠道病毒71型分子生物学研究
新型肠道病毒71型灭活疫苗免疫策略关键技术研究
新型肠道病毒71型灭活疫苗免疫策略关键技术研究大量研究已表明手足口病(HFMD)患者中的重症及死亡病例主要是由EV71所致。
自1969年美国首次从患儿的粪便中分离出肠道病毒71型(EV71)以来,世界多个国家和地区均有EV71暴发和流行的报道。
近年来,HFMD的流行成为我国大陆、台湾地区以及东南亚国家的重大公共卫生问题之一,造成巨大的经济和社会负担。
目前,临床上尚无治疗HFMD的特效药物。
疫苗成为预防和控制该病的传播与流行的最有效的手段。
研发有效的疫苗,探索科学合理的免疫策略,具有重大的社会意义。
本课题针对北京微谷生物制药有限公司研发的新型EV71灭活疫苗(本文简称EV71疫苗)开展免疫策略关键技术的研究。
【研究目的】1.确定EV71疫苗的最佳免疫剂量、剂型和免疫程序。
2.评价E V 7 1疫苗诱导的免疫反应的持久性,探讨加强免疫的必要性。
3.确定EV71疫苗针对EV71所致HFMD/疾病的保护效力。
4.研究EV71疫苗保护效力的免疫学替代终点。
5.探索EV71疫苗与其他肠道病毒之间可能存在的交叉免疫/保护作用。
6.研究不同批次E V71疫苗的批间一致性。
【研究方法】1.EV71疫苗的最佳免疫剂量剂型及免疫程序研究采用随机双盲、安慰剂对照的研究设计,选择幼儿组(12~60月龄)600人、婴儿组(6~11月龄)600人,研究不同剂型不同剂量的EV71灭活疫苗(含佐剂160U、含佐剂320U、含佐剂640U疫苗以及无佐剂640U疫苗)的免疫原性和安全性。
比较受试者接种一针次和两针次疫苗后血清抗体水平的差异及不良反应发生率,确定EV71疫苗的最佳免疫剂量、剂型及免疫程序。
2.EV71疫苗免疫持久性和加强免疫研究基于最佳免疫剂量剂型及免疫程序研究的队列,随访至第1针免疫后第8月和第14月进行血清检测,观察EV71疫苗诱导的抗EV71中和抗体的持久性。
采用巢式随机双盲对照研究设计,在14个月时对已经完成两针次基础免疫的受试者进行再次招募入组,按2:1随机分配给予相同剂量剂型的ev71疫苗或安慰剂进行1针次加强免疫研究,比较各组受试者加强或不加强后的血清抗体反应水平差异,评价加强免疫的效果。
肠道病毒71型分子生物学研究进展
关键词 ： 肠道病毒 ７ 型 ； ｌ 毒力 ； 流行病学 ； 疫苗
Ｐ ｏ ｒ ｓ ｆｒ ｓ ａ ｃ ｎ ｔ ｅｍｏｅ ｕ ａ ｉｌｇ ｆｅ ｔｒ ｖｒ ｓ７ ｒ ｇ ｅ ｓｏ ｅｅ ｒ ｈ ｏ ｈ ｌｃ ｌｒｂｏｏ ｙ ｏ ｎ ｅ ｏ ｉｕ １
ＬＩ Ｌｉ ｎ，ＺＨＵ — ｎ Ｕ — Ｙａ Ｑｉ Ｒｏ ｇ
（ ａ ｄ ｆｏ ｎ ｕｈ ｄｓ ａｅ ＨＦ ｈ ｎ ，ｏ ｔａ ｄｍｏ ｔ ｉ ｓ ， ＭＤ） 在 临 上 ｅ ，
１ Ｅ ７ Ｖ １的 结构 特 征
Ｅ １是 小 ＲＮＡ 病 毒 科 （ ｉ ｒａ ｉｉ ｅ 肠 道 Ｖ７ ｐｃ ｎ ｖｒ ａ ） ｏ ｄ
病毒属 成员 。病 毒颗 粒为 二 十面体 立体对 称 的球形
结构 ， 包 膜和 突 起 ， 无 直径 ２ ～ ３ ｍ， 酸 为 单 股 ４ ０ｎ 核
与柯 萨奇 病 毒 Ａ１ 致 的 ＨＦ ６所 ＭＤ难 以 区分 ， 能 也＿ 引起无 菌 眭脑膜 炎 、 干 脑炎 和脊 髓 灰 质炎 等 种 脑
与神经 系 统 相 关 的严 重 疾 病 。近 年 来 ， Ｖ７ Ｅ １的流 行在亚 太地 区呈上 升趋 势 ， 中最 令 人 关 注 的是 该 其 地 区 的 Ｅ １ 染 出现越来 越严 重 的 中枢 神 经 系｝ Ｖ７ 感 统
正链 Ｒ Ａ。病毒颗粒的衣壳 由 ６ 个亚单位构成， Ｎ ０
后 者 由 ４ 衣壳 蛋 白 （ １ 种 ＶＰ ￣ＶＰ ） ４ 拼装 成 五 聚体 样
结 构 。４种结 构蛋 白中 ， ＶＰ 除 ４包 埋 在病 毒颗 粒 外
壳 的 内侧 并 与病毒 核 心 紧密 连接 外 ， 他 ３种 均 暴 其 露 在病 毒 颗 粒 表 面 ， 而 抗 原 决 定 簇 基 本 上 位 于 因 ＶＰ ￣ＶＰ Ｅ］ Ｉ ３ｌ 。病 毒 颗粒 没 有 类 脂 性 的 包膜 ， 去 ｏ 对
肠道病毒71型分子生物学研究
Ａｂｓｒ ｃ ｔ ａ ｔ：Ｉ ａ ｓｒ ｖｅ ｏ ｔｍ ｋｅ ｅ ｉｗ ｎ ＥＶ １ ｉ ｔ ｓ ｉ ｌｖｒ ｂ ７ ｎ ｅ ｔｎａ ｉｕｓａ ｏｕｔｉｓｂ ｏｏｇ ｃ ｌｃ ｒ ｃ ｅ ｉｔｃ，ｒ ｐ ｉａ ｉ ｔ ｉ ｌ ｉａ ｈａ ａ ｔ ｒｓｉ ｅ ｌｃ ｔｏｎ，ｄｉｇ ｓｓｔ ｃ ｎｏ ｏ ｙ，ＥＶ ｙ — ａ ｎｏ ｉ ｅ ｈ ｌ ｇ ｔ ｐｅｉ ｄ ｎｔｆｃ ｔｏｎ ａ ｏｌｃ ａ ｐｉ ｍ ｉ ｃｅ ｅ． ｅ ｉｉａ ｉ ｎｄ ｍ ｅ ｕｌｒ ｅ ｄｅ ｃｓ ｉｎｃ Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｓ：ｉ ｅ ｔｎａ ｒ ｄ ｎｔ ｓ ｉ ｌｖｉｕｓ； ＥＶ １；ｇ ｎｅ ｔ ｐｅ；ｍ ｏｌｃ ｌ ｒｅ ｄ ｍ ｉ ｃｅ ｅ ７ ｅ ｙ ｅ ｕ ａ ｐｉｅ ｃｓ ｉｎｃ
维普资讯
浙江中医药大学学报 ２０ ０ ８年 ５月 第 ３ 卷 第 ３期 ２
Ｅ ］ 顾 植 山． 手 足 Ｅ病 谈 中 医 药 应 对 突 发 公 共 卫 生事 件 的 １ 从 ｌ 意 义 Ｅ］ 浙江 中 医 药 大 学学 报 ，０ ８ ３ （ ）１２ Ｊ． ２ ０ ，２ ３ ：－． ［］ 方焕生． 州地 区肠道病毒 ７ ２ 广 １型 感 染 的研 究 ［ ］ 第 一 Ｄ．
医 科 大 学 学 报 ，０ ８ ２ （ ） ２ ４ ２ ０ ，９ ２ ：８ ．
［］ 郭卫平． ７ 中西 医结 合 治 疗 ４ Ｊ 手 足 口病 １ ６例 ［］ 河 北 ，Ｌ １ Ｊ．
中 医 ， ０ ６，８ ７ ５ ８ ２ ０ ２ （ ）：４ ．
Ｅ ］ 任 国珍 ． 药 外 洗 配 合 食 疗 治 疗 手 足 Ｅ 病 Ｅ］ 医 学 导 ８ 中 ｌ Ｊ．
军 医 大 学 ，０ ５ ２０．
［ Ｏ 陈永 宏 ． 射 用 双 黄 连 治 疗 ４ Ｊ 手 足 口病 临 床 观 察 ［］ １］ 注 ，Ｌ Ｊ．
新肠道病毒71型致手足口病研究进展
毒 之一 。近 年来 Ｅ １引起 的 ＨＦ Ｖ７ ＭＤ发病 率 明显 上升， 呈现 季节 流行 和全 年 散 发 趋 势 ， 致 死率 逐 其 年 上升 。对 Ｅ １型 ＨＦ Ｖ７ ＭＤ的发病 机 制 目前 尚不
鼻分 泌物 也会带 有 高浓度 的病 毒 ， Ｅ １也 可经 故 Ｖ７
由飞沫 或密 切接 触等 途径 传播 ＿ 。 ５ ］
和 ＶＰ １序列 中可 能 存 在 神 经 毒 力决 定 簇 。因 此 ，
Ｅ １的 毒 力 可 能 是 由 多 个 病 毒 基 因 共 同 决 定 。 Ｖ７
近 来研 究表 明 ， Ｖ７ Ｅ １可 能 诱 导 中枢 神 经 系统 Ｉ 一 Ｌ
１ 、Ｌ ６和 Ｉ Ｎ ７等炎 症介 质 释放 ［ ， 管平 滑 肌 ０Ｉ 一 Ｆ 一 ８血 ］
综述 ・
新肠 道病毒 ７ １型 致 手 足 Ｉ 研 究 进 展 Ｊ病
刘增 甲 王 旭 综 述 崔 文 审校
（ 宁 医 学 院 基 础 医学 与法 医学 院 ， 东 臼照 ２ ６ ２ ） 济 山 ７８ ６
关 键 词 新肠 道 病 毒 ７ ； 足 口病 ； １手 中枢 神 经 系 统 病 变
定 作用 。
随着分 子生 物学技 术 的发展 ， 现脊髓 灰质 炎 发 病 毒 的 ５ ＮＣ 和 ＶＰ ＂ Ｒ － １与 其 神 经 毒 性 有 关 。对 来
细 胞血 管细 胞 黏 附 分 子 ＶＣ ＡＭ一 １表 达 上 调［ ， ９ 提 ］ 示 Ｅ １ 染所 致 的炎症 反应 可 能 是 引 发 中枢 神 Ｖ７ 感
经 系统 疾病 的原 因之 一 。体 外研 究 显 示 ， Ｖ７ Ｅ １可
通 过 活 化 蛋 白激 酶 Ｃ ｋ 诱 导 神 经 细 胞 凋 亡 ， 种 ｄ５ 这
2008-2009年江苏省肠道病毒71型分子流行病学研究
Ｍ ｏ ｅ ｕ ａ ｐ ｄ ｍ ｉ ｌ ｇ ｆｅ ｅ ｏ ｉｕ ｎ Ｊ ａ ｇ ｕ Ｐｒ ｖｎｃ ｒ ｍ ０ ８ ｔ ０ ９ ｌｃ ｌｒ ｅ ｉ ｅ ｏ ｏ ｙ ｏ ｎｔ ｒ ｖ ｒ ｓ７１ ｉ ｉ ｎ ｓ ｏ ｉ ｅｆ ｏ ２ ０ ｏ ２ ０
基 因 型 。结 论 ２ ０ － ２ ０ ０ ８－ ０ ９年 江 苏省 分 离 的 ｌ ８株 ＥＶ７ １可 能 与 安 徽 省 和 山东 省 分 离 的 ＥＶ７ １有 相 同 的起 源 ， 属 于 Ｃ４ 均 ａ亚
型； 目前 Ｃ ａ亚 型 病 毒在 中 国 大 陆 可 能 有 较广 泛 的 分 布 和传 播 。 ４
相 近 ， 苷 酸 同源 性 在 ９ ． ～ ９ ． 之 间 ， 核 ６３ ９６ 氨基 酸 同源 性在 ９ ． ～ ９ ． 之 间 ； 与 Ａ、 基 因 型 参 考 株 比较 差 异 较 大 ， ９０ ９７ 而 Ｂ 核 苷 酸 同 源 性 只在 ８ ． ￣ ～８ ． 之 间 ， 基 酸 同源 性 在 ９ ． ～ ９ ． 之 间 ； 明本 文 的 １ １８ Ａ ４４ 氨 ４３ ７ｏ 说 ８株 病 毒 均 属 于 Ｅ １型 Ｃ ａ Ｖ７ ４
单 军 ， 李 显 ， 唐 震 ， 郭喜 玲 ， 康辰 ， 仑标 ， 以跃 ， 赵 崔 葛 史智扬
摘 要 ： 目的 探 讨 ２ ０ － ２ ０ ０ ８ ０ ９年 江 苏 省 肠 道 病 毒 ７ １型 （ Ｖ １ 分 离株 的病 毒 基 因特 征 。 方 法 选 取 ｌ Ｅ Ｔ） ８份 Ｅ １分 离 ＶＴ
２１ ０ ０， ２ （ ０ ６ ）
Ｃｈｉ ｅ ｅ Ｊ ｕｒ ａ ｆ Ｚｏ ｎ ｓ ｏ ｎ ｌ ｏ ｏｎｏ ｅ ｓｓ
STAT3在新型肠道病毒71型(EV71)感染和复制中的作用初步研究
新鲜 培养 基覆 盖并孵 育 ７ ２ ｈ 。用 ０ ． １ 的 中性红 染 色４ ～６ ｈ后观 察蚀 斑形 成情 况 。为确 定 Ｓ Ｔ ＡＴ３对 Ｅ Ｖ７ １形成蚀 斑 能 力 的 影 响 ， 将 整 合 不 同 慢 病 毒 的 ＲＤ细胞 分别 接 种 于 ６孔 板 ， 然 后 用 相 同病 毒 储 存 液（ 经正常 Ｒ Ｄ细 胞测定后 病毒滴度 为 ４ ． ８×１ ０ Ｐ Ｆ Ｕ／ ｍＬ ） 经 指定倍 数 稀释 ， 分别用 ０ ． ５ ｍＬ病 毒 稀
病毒的细胞 株 Ｒ Ｄ － ｐ Ｌ Ｋ０． １ － ｓ ｈ Ｓ Ｔ ＡＴ３ 。 提 取 细 胞
同细胞 上形 成蚀 斑 的数量 和大 小 。 数据统 计分析 不 同组 间 的数 据使 用 Ｓ ｔ ｕ ｄ ｅ ｎ ｔ Ｓ ｔ 检验进行 数据 分析 ， 所 有数 据均 使用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ １ ． ０软
件 进 行 处 理 。Ｐ ＜Ｏ ． ０ ５为 差 异 有 统 计 学 意 义 。
基 因组 Ｄ ＮＡ 经 Ｐ Ｃ Ｒ进 一步 确认 病毒 整合情 况 。 为 构建 过 表 达 Ｓ ＴＡＴ ３细 胞 ， 将 Ｓ ＴＡＴ ３ ｃ ＤＮＡ （ 位
于 １ ３ ３ ～ ２ ３ ９ ６， ＮＭ
一
后 ３ ０和 ４ ５ ａｉ ｒ ｎ ， Ｓ ＴＡＴ ３磷 酸化 （ ｐ － Ｓ ＴＡＴ ３ ） 水 平 分
别下 调 １ ． ８ ６和 ３ ． １ ４倍 ， 并 长 时间持 续 下 降 （ 图 １ Ａ） 。而 总 Ｓ ＴＡＴ ３的 表 达 在 Ｅ Ｖ７ １感 染 后 无 显 著 变化 （ 图 １ Ｂ ） 。结 果 表 明 Ｅ Ｖ７ １感 染 可 迅 速 下 调 ｐ — Ｓ ＴＡＴ ３的水 平 ， 而对 总 Ｓ ＴＡＴ ３ 的 表 达 无 显 著
肠道病毒71型感染人Jurkat细胞诱导细胞因子表达研究
国际病毒学杂志 2020 年12 月第27 卷第6 期International Journal of Virology, December 2020, Vol. 27, No. 6• 469 ••基础研究•肠道病毒71型感染人J u rk a t细胞诱导细胞因子表达研究吕秋月韩焱刘丹红薄志坚大连市疾病预防控制中心微生物检验所116021通信作者：薄志坚，Em ail:155****0762@,【摘要】目的研究手足口病发病与细胞因子水平异常变化的关系，研究E V71病毒诱导细胞天然免疫的发生机制。
方法将J u r k a t细胞接种到24孔板中，设E V71病毒感染组和对照组，并用R e a l t i m e-P C R法检测感染不同时间段的细胞上清液中丨1,1-p、1L6、T N F-c x、I F N-1的m R N A表达含量。
用乙醜肉S•蔑佛波酯（p h o r h o l-12-m y r i s t a t e-13-a c r t a t e，P M A)预作用J u r k a t细胞不同时间后，接种E V71病毒，检测细胞上清液中病毒载量变化。
结果E V7丨病毒感染J u r k a t细胞后，I L l-p的m R N A在6h后达峰，I L-6的n i R N A在24h后达峰，T N F- a和I F N- 7的m R N A分别在48h和72h达峰；P M A预作用J u r k a t细胞后，I L1-P、I L6、T N F-a、丨F N-7的m R N A表达均上调，病毒载量下降。
结论随着E V71病毒作用时间的延长，I U- p、I L6、T N F-a、I F N- 7的m R N A表达均达峰值，J u r k a t细胞内E V71病毒载量呈递减趋势。
E V71可引起I L l-p、I L6、T N F-a、I F N-7细胞因子反应。
【关键词】肠道病毒71型；细胞因子；乙酰肉豆蔻佛波酯基金项目：大连市科技计划项目（2015E12S F133)DOI：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2020.06.007Expression of cytokines induced by enterovirus 71 infecting human Jurkat cellsLyu Qiuyue, Han Yan, Liu Danhong, Bo ZhijianInstitute of Microbiological Detection, Dalian Municipal Center for Disease Prevention and Control,Dalian 116021, ChinaCorresponding author: Bo Zhijian, Email: 155****************,Tel: 0086-411-84335939【Abstract 】Objective To find relationship between the onset of hand, foot, and mouth diseaseand abnormal changes of cytokine levels, so as to clarify the mechanism of enterovirus 71 (EV71)-induced natural cellular immunity. Methods Jurkat cells were cultured in 24-well plates and the EV71infection group and control group were set up. The mRNA expression levels of ILl-p, IL6, TNF-a andIFN-y in supernatants collected at different time after infection were detected by realtime-PCR. EV71 wasinoculated into Jurkat cells pre-treated with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) for different time toanalyze the changes of viral loads in supernatant of cell culture. Results After Jurkat cells infected byEV71, the mRNA of IL1-P reached peak level at 6h, the mRNA of IL-6 reached peak level after 24h whilethe mRNAs of TNF-a and IFN-y reached peak levels after 48h and 72h, respectively. For PMA-pre-treatedJurkat cells, the mRNA expressions of ILl-p, IL6, TNF-a and IFN-y were all up-regulated with decreasedviral loads. Conclusions With the prolongation of infection by EV71, all mRNA expressions of IL1-P，IL6, TNF-a and IFN-y reached peak levels while the viral loads in Jurkat cells decreased. EV71 can inducecytokine reactions, including ILl-(3, IL6, TNF-a and IFN-y.【K eyw ords】Enterovirus 71; Cytokine; Phorbol-12-myristate-13-acetateFund Program: Dalian Municial Science Planning Project (2015E12SF133)DOI：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2020.06.007EV71病毒属肠道病毒，可引起以儿童为主要 感染对象的手、足、口部的疱疹，少数病例可引 起心肌炎、脑炎、呼吸道感染等严重并发症m，甚至死亡。
肠道病毒71型实验室诊断研究进展
原体 ， 多感染婴幼儿 ， 少数病例 可以并发 呼吸道感染 和心肌炎 、 无菌性 脑膜炎 、 脑炎 、 急性 弛缓性麻 痹等严 重疾病 ，
可致残 、 致死 。因此 Ｅ ７ 实验室诊断对 Ｅ ７ Ｖ１ Ｖ １引起疾 病的治疗 和防控具 有重要意义 。本 文将从核酸检测 、 抗体 检 测及其他检测等三部分对 Ｅ ７ Ｖ １的实验室诊断方法研究进展进行 了综述。
（Ｆ Ｈ ＭＤ）ｉ Ｃ ｉ ａｅａ ｅｔｄｍｉｉ ｓａｄｐｔｎｉｌ ｌ ｄｔ ｌｅｔｒ ｔ ｉｇｃｍ ｌａｉ ｓｉ ｉｆｎ ．Ｆ ｒ ｅ ｒ， ｎ ｈｎ ｈｖ ｆ ｃ ｌｏ ｎ ｏ ｔ ｌ ｅ ｏ ｉ — ｅ ｅ ｎ ｏ ｐｉ ｔ ｎ ｎ ｎａｔ ｕｔ ｒ ｅ ａ ｆ ｅ ｌｎ ｅ ａｙ ａ ｆ ｈ ａ ｎ ｃ ｏ ｓ ｈ ｍｏ
ｔｎ ｒｓａｃ ｂｅｔ ｔ ｔｅｄｖｌ ｍ ｎ ｏ ｍ ｌｃｌ ｉｇｏｔ ｃｎｑ ｅ ｆ ｅｄｔ ｔ ｎｏ ｅｅｔｒｖ ｕｅ．Ｔ ｉ ｒ— ａｔ ｅｅｒ ｓ ｊｃｓｏ ｈ ｅｅ ｐ ｅｔ ｆ ｏｅｕａ ｄａｎ ｓｃｔ ｈ ｉ ｓ ｒ ｈ ｅ ｃｉ ｆｈ ｎｅｏｉ ｓｓ ｈｓ ｅ ｈｕ ｏ ｒ ｉｅ ｕ ｔ ｏ ｅ ｏ ｔ ｒ
ｔ ｅ ｅ ｏ ｔ ｒ ａ ｓｒｐ ｅ ｅ ｔａ ｓ ｎ ｆ ａ ｔ ｌｂ ｕ ｌ ｅ ｌ ｓｕ ｎ ｔ ｅ ｗ ｒ ．Ｔ ｅ ｅ ｃ ｍｍｏ ｎ ｅ ｔ ｎ ｒａ ｅ ａｓｇ ｉ ｃ ｎ ｈ ｓ ｕ ｂ ｅ ｋ ｅ ｒ ｓ ｎ ｉ ｉ ｃ ｎ ｏ ａ ｐ ｂ ｉ ｈ ａｔ ｉｓ ｅｉ ｈ ｏ ｄ ｇ ｉ ｇ ｌ ｃ ｈ ｌ ｈ ｓ ｏ ｎ ｉ ｃｉ ｓｃ ｅ ｔ ｉｎｆ ａ ｔ ｆ ｏ ｉ ｂ ｒ ｅ ｎ ｏ ｒｓ ｃｅｙ ａ ｄ ｈ ａ ｈ ａ ｅ ｓ ｓ ｍ． Ｏ ｒｕ ｄ ｒ ｔｎ ｉ ｇ ｏ ｉ ｉ ｏ ａ ｔ ｇｏ ｐ ｏ ｉ ｌｐ ｔ ｏ ｅ ｓ ｈ ｓ ｉ ｃ ｅ ｓ ｄ ｕ ｄ ｎ ｏ ｕ ｏ ｉｔ ｎ ｅ ｈ ｃ ｒ ｙ ｔ ｅ ｕ ｎ ｅ ｓａ ｄ ｎ ｆ ｔ ｓ ｍｐ ｒ ｎ ｒｕ ｆ ｖｒ ａ ｈ ｇ ｎ ａ ｎ ｒ ａ ｅ ｈ ｔ ａ ｄ ａ ｔ ａ ｌ ｈ ａ ｔ ｅ ａ ｅ ｈ ｕ ｎ ｉ ｔ ｅ ａ ｓ ｙ ｍｅｈ ｄ ｒｖ ｃ ｉ ｅ ａ ｔ ｅ ｎ ｅ ｔａｉｉ ｇａ ｔ ｏ ｙａ ｅ ｔ ｅｉ ｏ ‘ ｒ ｍａｉ ｌ ｉ ｔｅ ｐ ｓ ｃ ｄ ．Ｔ ｅ ｑ ａ ｔ ａ ｉ ｓ ａ ｔｏ ｓｆ ａ ｃ ｎ ｎｉ ｎ ａ ｄ ｎ ｕ ｒｌ ｎ ｎ ｉ ｄ ｒ ｍｐ ｒ ｃ ｙｎ ｄ ｔ ｖ ｏ ｇ ｚ ｂ ｈ
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肠道病毒71型分子生物学研究【摘要】就有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。
【关键词】肠道病毒71型基因型分子流行病学Molecular Biological Research on 7I Intestinal VirusLin Xin, Han GuangenZhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310053)Abstract: It makes review on EV 71 intestinal virus about its biological characteristic, replication, diagnosis technology, EV type identification and molecular epidemic science.Key words: intestinal virus; EV 71; gene type; molecular epidemic science 近年，肠道病毒71型(EV71)感染在世界各地不断出现爆发流行的报道。
EV7I感染主要引起手足口病，但所致的神经系统并发症可导致死亡或永久性肌麻痹。
本文从有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。
1 病毒的一般特征1.1 病毒颗粒结构及理化性质肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员［1］。
EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。
病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由VPI、VPZ、VP3和VP4四种外壳蛋白构成原聚体(Protomer)，再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位(Pentamer)。
四种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他三种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VPI.VP3上（见图1）。
由于病毒颗粒没有类脂性的包膜，所以对去污剂、乙醚、脱氧胆酸盐以及弱酸有抵抗力，此外，该病毒还能抵抗70%乙醇和5%甲酚皂溶液等常见的消毒剂，这些都决定了该病毒较强的野外生存能力。
EV71病毒对高温(50℃以上)及紫外线的抵抗能力较差。
图1 肠道病毒粒子及外壳蛋白的结构（略）1.2 基因组结构［2］EV71基因组为7408个核苷酸的单股正链RNA，腺嗓吟核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(A+U=52.8)，病毒的的单链具有侵染性。
基因组中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2193个氨基酸的多聚蛋白(Polyrotein)，在其两侧分别为746个核苷酸的5’-非编码区(UTRs)和83个核苷酸的3’-非编码区。
在3’-非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(poly A)，而其5’末端共价结合有一个小分子量的蛋白(VPg)。
该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3三个前体蛋白，Pl前体蛋白编码IA(多肽VP4)、IB(多肽VP2)、IC(多肽VP3)、ID(多肽VP4)四个病毒外壳蛋白;P2前体蛋白编码ZA(特异性蛋白酶)、2B、2C;P3前体蛋白编码3A、VPg(5’末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)、3D(RNA 多聚酶组份)。
病毒的单链RNA具有感染性。
病毒RNA正链和负链的5’末端和3’末端非编码区中分别含有多肽翻译的起始信号以及RNA合成起始信号。
VPg蛋白通过其酪氨酸残基的轻基基团与RNAS’末端的pUPU形成磷酸二酷键与基因组RNA结合。
5’ UTR通常折叠成多个特异性的空间结构，这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合在起始病毒基因组RNA的合成以及病毒蛋白的翻译的过程中发挥重要作用。
此外，5’UTR结构还涉及病毒的宿主X围和病毒的毒力等多个方面的功能。
EV71病毒基因组3‘UTR区和多聚腺苷酸尾的功能目前尚不清楚。
2 病毒的复制EV71基因组的复制类似于其它正链RNA的病毒。
当病毒基因组编码的RNA聚合酶3C完成翻译和加工后，病毒基因组便开始进行复制。
病毒基因组RNA 首先作为mRNA合成病毒蛋白，然后再作为模板在病毒RNA聚合酶的作用下合成负链RNA。
后者又作为模板在细胞内质网进一步合成大量的正链RNA。
体外实验证实:病毒基因组的复制至少需要病毒RNA聚合酶3C、末端结合蛋白VPg以及一种以上的宿主细胞蛋白。
随着大量病毒正链RNA在细胞浆内的堆积，病毒开始进入子代毒粒的组装阶段。
由于蛋白酶3C或3CD的增多以及活性的增强，加速了Pl前体蛋白的切割。
其产物构成的原聚体组成五聚体，并进一步包装病毒VPg一阴A形成病毒子粒［2］。
一般情况下，肠道病毒的原病毒毒粒无感染性，经过蛋白酶的再加工(水解切割P1，产生钾1一4多肽)才产生有感染性的病毒粒子［3］。
3 EV的诊断技术3.1 核酸杂交技术由于EV各型间存在序列高度保守区,利用针对此保守区的通用互补脱氧核糖核酸(cDNA)核酸探针可进行大X围的EV诊断［4］。
杂交技术已能成功地检测出可疑病例临床标本中的EV RNA［5］,而且原位杂交技术可以提供病毒感染的组织细胞分布及其与炎症和坏死之间的关系的信息［6］。
但是核酸杂交技术过程较复杂,且敏感性不太高,特别当用于检测脑脊液中RNA时。
3.2 逆转录(RT)PCR技术根据EV属特异性的高度保守序列设计其通用引物,为提高其检测敏感性,进行套式PCR能够检出包括无法进行细胞培养和定型的大部分EV分离物,还可直接从临床标本中检测EV核酸,整个过程一般在5h左右完成［7］。
周世力［8］利用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒VP1/pPIC9K,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,以Myc Tag多克隆抗体作为一抗,利用双层滤膜法筛选酵母转化子,甲醇诱导表达。
SDS PAGE分析显示:表达产物的分子量约为30 000,与天然VP1大小一致;表明,表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应,表明重组蛋白VP1具有免疫原性。
4 EV型别鉴定诊断后其型别鉴定的方法主要有:将PCR结合细胞培养进行型别鉴定或者对PCR产物进行限制性酶切片段长度多态性分析或进行单链构象多态性分析(PCR SSCP)或进行基因序列测定与遗传性分析等来定型分类。
而在结构蛋白编码区,据Oberste等研究,VP1区核酸序列与决定血清型的抗原决定因子密切相关,根据VP1区序列进行分型结果与中和试验鉴定结果一致性较好,与血清型相关性较其它结构蛋白编码区高［9］。
但也有研究表明VP4的分型结果与血清也较一致,且因其核酸序列较短(VP4207nt,而VP1834～951nt),应用更为便利［10］。
Oberste等根据对EV遗传性分析的结果,提出根据VP1基因全长或部分序列同源性大小进行型别判定的标准。
将被检序列与含所有EV血清型参考株序列的数据库(如Genbank)进行比对,如果被检株序列与某一型参考株同源性最高且>75%,同时与同源性位居其次的另一型参考株同源性<70%,则可判定被检株与最高同源性参考株为同一血清型;如果最高同源性<75%或者第二同源性>70%,则型别判定有待于进一步研究确定;如果最高同源性<70%,则为一新血清型［11］。
周世力［12］将扩增得到的肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆到测序载体pGEM T,测序验证该序列为目的片段后,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX5x1中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物经SDS PAGE分析和Western blot验证。
结果表明,在经IPTG诱导的BL21中检测到分子量与预期大小相符的大约60kDa的融合蛋白。
利用表达产物作为抗原,对EV71感染病人阳性血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的检测用抗原。
见图2～4。
唐启慧［13］在成功克隆肠道病毒71型XX株EVGZ06全长VP1蛋白基因并测序的基础上,将部分VP1蛋白基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建了重组表达质粒pET28a(+)/(502～891)VPI,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。
结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS PAGE显示其相对分子质量为19 000,与预计大小一致。
ELISA 和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。
图2 重组表达载体pGEX5x1/VP1结构（略）图3 SOS PAGE电泳分析表达（略）图4 Western Blot鉴定原核表达的EV71 VP1蛋白（略）5 分子流行病学目前EV71分子流行病学主要研究内容是VPI基因、VP4基因和5’价R区的变异。
其中，VPl基因最具研究价值，这是因为:(1)VPI蛋白是主要的病毒中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性(Oberste等，1999);(2)VPI基因具有与病毒血清型完全对应遗传多样性;它不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，而且可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。
周世力［14］对SHZH03株、SHZH98株、亚洲流行株(XX98年、日本99年、及新加坡2000和2001年流行株等)以及一部分欧洲流行株等的结构蛋白基因进行遗传进化分析。
方法在对肠道病毒71型中国(XX)分离株SHZH03进行全基因组序列测定的基础上,利用DNA STAR软件对结构蛋白基因进行遗传进化分析。
结果SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的XX98流行株、日本99流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异。
结论我国XX地区流行的肠道病毒71型有可能来源于XX1998年EV71大规模流行时的毒株。
X爱利［15］2002～2003年从XX市和XX市手足口病患儿的疱液标本中分离到10株病毒,其中XX9株,XX1株。
利用两对分别针对EV71和Cox.A16病毒VP1区的特异性引物,用RT PCR方法对病毒进行初步鉴别。
根据PCR所用引物及PCR扩增出的产物片段大小不同,可初步判定出EV71和Cox.A16病毒的血清型别。
提示,XX分离到的9株病毒中,有2株为EV71,其余7株病毒为Cox.A16;XX分离到的1株病毒为EV71。