木糖醇脱氢酶基因高拷贝表达载体构建及在酿酒酵母中的表达

木糖醇脱氢酶基因高拷贝表达载体构建及在酿酒酵母中的表
达
摘要：木质纤维素的主要组分是纤维素（20％-30％），其次是半纤维素（20％一30％）和木质素（10％-25％），其中木糖是半纤维素的主要组成部分，以木糖为底物转化乙醇的研究，是乙醇途径工程研究的热点之一。

关键词：木糖醇脱氢酶基因；酿酒酵母
一、酵母表面展示系统
酿酒酵母为单细胞真核微生物，细胞壁主要由甘露糖蛋白和葡聚糖组成。

细胞壁分为两层，内层由葡聚糖与少量几丁质组成，提供细胞壁的强度；外层由甘露糖蛋白组成，决定了大多数细胞的表面特性；甘露糖蛋白共价连接到内层的葡聚糖上，连接方式主要分为两种类型：一种是通过非共价键松散连接构成细胞壁，能够用SDS提取；另一种甘露糖蛋白通过葡聚糖酶消化细胞壁的葡聚糖层获得，它不能用SDS提取。

絮凝素是一种在絮凝中起重要作用的酵母细胞壁蛋白，拥有高水平糖基化而形成杆状结构，因此能够覆盖长达300nm的距离，与酵母细胞壁的厚度相当。

具有1200个氨基酸残基的重复区域，可以设计不同长度的锚定点。

包含有分泌信号、絮凝功能区，GPI锚定粘着信号和膜锚定区，其中絮凝功能区接近N 末端，能够识别并且以非共价键连接到细胞壁复合物上，如a。

甘露聚糖，引起可逆的细胞絮凝f22l。

酵母表面展示技术由于其具有转录后修饰，蛋白有效的空间折叠等优势，使其在真核生物蛋白展示和直接利用上具有独特优势。

包括乙醇发酵、新药筛选、生物吸、抗原表面展剥、蛋白质分子的相互识别、定向进化、酶的固定化等。

但是同时酵母展示系统也存在许多不利因素，如重组酵母缺少选择性标记，生长条件苛刻；如果配体对细胞有毒性作用，有可能导致酵母死亡，无法得到目的克隆。

相信随着技术的不断发展和完善，多不利因素会被克服，酵母表面展示在进一步的生物科学研究和实际应用中发挥重要作用。

二、木糖醇脱氢酶基因高拷贝表达载体构建及在酿酒酵母中的表达
1.表达载体的构建。

第一，PCR反应。

成功获得目的基因和质粒之后，要进～步将目的基因构建到相关的表达载体；这需要在目的基因的两端加上相应的酶切位点，因此设计带有酶切位点的引物，进行PCR反应，其中设以水为模板的阴性对照管。

第二，酶切、连接、转化。

在获得带有酶切位点的目的基因PCR产物以后，要对表达载体和目的基因进行双酶切，以使它们能够在连接反应里面进行正确的连接。

双酶切反应体系如下，将反应体系置于0．5mL离心管中，水浴过夜反应。

对酶切产物进行电泳、切胶回收片段和载体，以备连接反应使用。

（1）在预冷的装有100吵L新制备酵母感受态细胞的离心管中，分别加入31xL经线性化处理的表达载体DNA，轻轻混匀；（2）向每管中加入600}tLPEG／LiAc溶液，轻轻振荡混匀；（3）每隔10分钟轻摇振荡一次，以混匀溶液；（4）向每管中加入70}tL的二甲基亚砜（DMSO），轻摇混匀：（5）每管取200L分别涂布于SD平板上。

2.酿酒酵母受态细胞的制备。

步骤如下：（1）挑取酵母单菌落接种于10 mLYPD液体培养基中，200转／分钟培养过夜；（2）测A600nm值；（3）取过夜培养液接种到100mL YPD液体培养基（盛于1000mL的三角瓶中）中，室温下，以6000转／分钟离心5分钟回收细胞，用50mL无菌水重悬细胞。

3.重组酿酒酵母表型的基因组PCR鉴定采用玻璃珠法提取重组酵母基因组，步骤如下：（1）将1．5mL的重组酵母菌菌液装入1．5mL离心管重，10000转／分钟离心30秒、弃上清，菌体用50mL水重悬、离心、弃上清；（2）菌体用漩涡振荡器松散，每管加入20mL破菌缓冲液重悬菌体，加约O．39酸洗玻璃珠剧烈振荡3分钟，再加入20mL的TE溶液，振荡
均匀；（3）将水相转移到一干净的离心管，加入1／10体积的；溶液及2倍体积的冰冷无
水乙醇，混匀9300转／分钟离心5分钟，这时可见管内有白色沉淀，弃上清、加入E缓冲
液溶解沉淀；（4）基因组DNA沉淀最终由缓冲液溶解；（7）电泳检查基因组抽提效果。

4.讨论。

载体质粒的线性化与在酿酒酵母的转化，线性质粒比环状质粒的整合效率要高
的多，而且一般环状质粒在转化过程中，需要的浓度大约是线性质粒的10倍左右，因此在
酵母转化时，一般采用的是线性化质粒，所以需要预先对环状质粒进行酶切处理。

尽管前面
已经通过营养缺陷型培养基平板初步筛选得到重组酿酒酵母转化菌株，但仍不能确定这些重
组酿洒酵母转化菌株中是否含有重组质粒。

为了进一步确定初步筛选得到的重组酿酒酵母转
化菌株是否含有重组质粒，采用基因组PCR的方法来检测。

经荧光显微镜观察之后，将经免
疫荧光处理的剩余细胞稀释后流式细胞仪检测。

经过处理后的细胞通过流动池，部分细胞标
圯上了绿色荧光物质，荧光物质在激光的激发发光；细胞由于没有表达带有氨酸篮标签的融
合蛋白，在激光的激发下井小发绿色荧光荧光，而重组酵母细胞融合蛋白上的氢酸蛋白标签
抗组氨酸标签单克隆鼠抗体结合后，再抗结合伍激光的激发下发出绿色荧光。

重组表达载体
经过线性化后，通过醋酸里化学转化法转化酿酒酵母感受态细胞，在SDW筛选平板上筛选出转化子。

重组的酿酒酵母工程细胞经过酵母基因组PCR鉴定，表明表达载体已整合至宿主染
色体上。

木糖利用率较低可能是因为虽然能够在酿酒酵母中表达，但表达量不足，使得木糖
不能全部转化成为木糖醇；或者是本反应自身是需要辅酶的催化来完成，而酵母细胞表面的
辅酶量不足而导致催化效果受影响，而造成木糖醇产量低。

发酵液中的木糖利转化为木糖醇。

重组酿造酵母细胞表面展示了具有活性的木糖还原酶，只完成构建木糖代谢酿酒酵母的第一步，如果进一步将木糖醇脱氢酶引入酿酒酵母细胞表面，在木糖醇脱氢酶的作用下使木糖醇
转化成木酮糖，将可以在酿造酵母中启动木糖代谢途径，使构建的新型重组酵母能同时利用
葡萄糖和木糖，有望实现纤维素水解糖高效转化的代谢作用和乙醇的生产过程。

三、展望
利用酿酒酵母表面展示体系在酿酒酵母细胞表面建立木糖代谢起始途径，仅取得一些初
步的结果和数据，证明表面展示技术可以在这方面运用并能获得一定效果，但是要进一步提
高乙醇产量和木糖的利用率，达到生产应用水平，还有很多方面需要研究。

首先，将外源基
因在酿酒酵母表面进行展示，并没有对与蛋白催化活性相关的空间构象在表面展示体系中的
情况进行研究，因为表面展示涉及到了蛋白在细胞表面的确折叠和空问位阻的问题，这些都
对蛋白活性有影响，进一步深入的研究有望提高表面展示的蛋白活性。

其次，在代谢通路上
存在着氧化还原不平衡的问题，这对木糖的利用会造成影响，有望通过蛋白质定向进化或者
定点突变的手段对蛋白质序列进行改造，以改变蛋白质的辅酶依赖性以解决氧化还原不平衡
的问题。

同时，也可以利用辅酶工程改造细胞内辅酶的比率，实现辅酶的再生，可使酿酒酵
母木糖代谢工程菌向着有利于木糖利用、乙醇产生的方向进行，为最终实现利用木质纤维原
料工业化生产乙醇奠定基础。

木糖醇脱氢酶是木糖代谢的重要限速酶之一，它的活性高低直接关系到乙醇产量的多少。

在酿酒酵母表面成功展示了木糖还原酶的基础上，构建了一株转化能够表面展示木糖代谢的
重组酿酒酵母菌株。

重组酿造酵母细胞表面展示了具有活性的木糖还原酶，完成构建木糖代
谢酿酒酵母的第一步。

参考文献：
[1]侯伟鹏．开发甘蔗燃料乙醇大有可为【J】．广西蔗糖，2016，6（2）：4．35
[2]倪维斗．中国液体燃料的短缺及其替代问题【N】．科技导报．2017，（2）：19-21。