酵母表达体系构建
重组海葵毒素AP-b毕赤酵母表达体系的建立及其鉴定
（． ｄｃ ｌ ｏｌｇ Ｉ ｎ ｒ ｎ ｏｉ ｉｅｓ ｙｆｒＮａｉｎ ｌｔ ｓ，ｏ ｇｉｏ０ ８ ０ ，ｈｎ ； １Ｍｅ ｉａ ｌ ｅ，ｎ ｅ ｇ ｌ Ｕｎｖ ｒｉ ｔ ａｉｅ Ｔ ｎ ｌ ２ ０ ０Ｃ ｉａ Ｃ ｅ Ｍｏ ａ ｔ ｏ ｏ ｉ ａ
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酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化
酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化肖牧;徐健;何乐;刘春林;阮颖【摘要】NPR1是水杨酸介导的系统获得性抗性(SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子.在SA诱导下,NPR1被转运至细胞核内并与一些转录因子结合,以启动下游基因的表达.本研究通过PCR扩增获得拟南芥中NPR1基因CDS序列,经过限制性内切酶酶切后在T4连接酶作用下分别克隆至pGBKT7与pGADT7酵母表达载体上,并成功将其转化至Gold酵母菌株中.为利用酵母双杂交筛选NPR1参与形成的转录复合体中其它可能存在的蛋白质并阐明其在植物防御信号传导途径中的互作模式奠定了基础.%NPR1 is an indispensable transcription co-factor in SAR induced by salicylic acid.Upon the SA stimuli,NPR1 is translocated into the nucleus and interacts with some transcription factors,and then starts the expression of downstream genes.In this study,CDS sequence of NPR1 was cloned into two yeast expression vectors pGBKT7 and pGADT7,and then was transformed into yeast Gold strain.This study laid a foundation for sifting other possible proteins in transcriptional complex with participation of NPR1 by Yeast Two-Hybrid and elucidating its interaction model in plant defense signal transduction pathways.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2013(027)003【总页数】4页(P213-216)【关键词】NPR1;基因克隆;酵母双杂交载体;酵母转化【作者】肖牧;徐健;何乐;刘春林;阮颖【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q78拟南芥NPR1是水杨酸(Salicylic acid)介导的系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子，其包含的BTB/POZ结构域［1］以及锚蛋白重复序列是行使其生物学功能的基础［2］。
外源基因在酵母体系中表达
C.albicans hyphal n.r cell wall Ag
Spinach
2
phosphoribulokinase
S/Mut+ Halaas, et al (1995)
Shiba, et al (1995)
S/Mut+
S/Mut+, S/MutS( 30,000 copies/c ell) S/MutS
fragment C
Pertusis
3
antigen P69
Mouse EGF 0.45
Aprotinin 0.8
Kunitz
1
protease
inhibitor (A-
beta-PP)
Human
4
serum
albumin(HS
A)
HIV-1
1.25
gp120
and
0.02
I/Mut+ and Muts I/Muts S/Muts S/Mut+/Muts S/Mut+
第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵 母表达系统为典型代表。
第二代酵母基因工程表达系统的典型代表 就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统 等为代表的甲醇酵母表达系统：
1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕 赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达 外源蛋白以来，由于它具有表达效率高， 遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成 为近年来极受青睐的真核基因表达系统。
S:284
ds Fv (di-sulfide-bonded n.r S/n.r Luo, et al (1995), J.
single chain antibodies) n.r
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
［1］。
同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。
酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。
干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。
酵母膜系统文库构建与筛选技术
DUAL membrane 系统的背景DUAL membrane 系统(DUAL membrane system)首先由瑞士的Dualsystems Biotech AG 公司开发出来，是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，泛素可以分成两部分表达，即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub)，后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。
NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白体系，断裂的泛素的两部分分别连接一个蛋白，且两个蛋白之间存在相互作用。
它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，使得分析膜蛋白间的互作成为现实。
技术特点可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。
它既可以用于表达文库的筛选，也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证。
膜系统原理1、泛素(ubiquitin)可以分成两部分：N端(Nub)和C端(Cub)；2、Nub与Cub有很强的亲和力，当在同一细胞同时表达时，Nub与Cub会结合形成完整的泛素，会被泛素蛋白酶(UBPs)识别并切割；3、Nub第三位的异亮氨酸突变成甘氨酸后(NubI→NubG)，Nub与Cub的亲和力大大降低。
4、Cub融合转录因子LexA-VP16，诱饵构建在Cub上，猎物构建在NubG上；5、当诱饵与猎物互作，使得Cub与NubG靠近而形成完整的泛素，UBPs识别并切割；6、被切下的转录因子LexA-VP16 进入核内，启动报告基因(His，Ade，LacZ)的表达。
独具技术优势▪在体内原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号▪使用小的泛素结构域(NubG/Cub)使得相互作用蛋白质之间的空间位阻最小化▪蛋白间的互作信号靠泛素特异性结合蛋白(UBPs)剪切人工转录因子(LexA)启动，而不是靠转录，因此可以检测蛋白自身的转录激活或抑制序列▪此体系可以用来研究两个膜蛋白的相互作用和一个膜蛋白与一个胞质蛋白的相互作用▪任何一种膜蛋白都可以作为诱饵，能使与待检测蛋白融合的相互作用模块(Cub-PLV-NubG)定位在细胞质内诱饵载体的选择方式注：若N端和C端都位于胞外，可截短使得C端出现位于胞内段，再选择相应载体应用前景该技术可以解决信号转导通路，离子通道，受体，细胞增殖分化，病毒侵染宿主等许多重要的生物学问题，也可以设计药物，为发现新药寻找到合适的生物靶标。
酵母表达体系
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶.而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子.毕赤酵母含有两种醇氧化物酶,AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。
AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白:分泌型和胞内表达.利用含有α因子序列的分泌型载体即可.翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N—连接糖基化高甘露糖型,毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基)短得多。
菌株：GS115 （ Mut+， Muts)和 KM71（Muts）分泌型载体：pPICZα A，B,and C（5’AOX1启动子，紧密型调节,甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)胞内表达型载体:pPICZ A，B，and C,一：分子克隆1。
设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B，p15—pPICZ C）2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer(10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture（各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlO up to 50μlddH2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3。
毕式酵母表达常见问题及解析
毕式酵母表达常见问题及解析点击次数：433 作者：佚名发表于：2008-08-27 15:20转载请注明来自丁香园1、问：我用毕式酵母表达一个27KD的蛋白，小量表达并做SDS－PAGE有一条类似三聚体的条带。
用大量表达，表达上清用镍柱进行亲和层析，在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，为什么呢？请赐教参考见解：你在大量表达后有没有跑电泳检测?表达上清用镍柱亲和层析后洗脱液有没有电泳检测?你首先要做的是:1,确定你的蛋白确实有表达;2,亲和层析是表达的蛋白确实被洗脱下来了.然后再考虑FPLC的事.在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，可能的原因有：1，上样时没有目的蛋白，可能是1)没表达2)亲和层析时没洗脱或是穿透了；2，目的蛋白结合在FP LC柱子上没被洗脱；3，目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是盐分峰；4，电泳时没跑好,目的蛋白没被检测到.FPLC大峰也可能是目的蛋白峰，它的吸收值有多少？不要看与基线相比的高度,要看吸收值，如果吸收值不高的话就是蛋白的浓度太低,浓缩后再跑电泳。
2、问：我现在做的是裂殖酵母表达，表达载体pesp-2,酵母菌珠sp-q01.说明只提供用化学转化法，但我转化了好几次都没有结果，是否也可以用电转化，在多克隆位点把质粒线性化？参考见解：其实无论是那种类型的酵母表达，转化方法基本是一制的。
化学转化法对酵母转化讲就不是很高，这里你可以用电转的。
查一下以前别人的讨论，看看电转化方法，效率提高了，筛选的希望就大些了由于筛选表达酵母的时间比较长，两个方案同时做应该来的及的至于线性化，对于电转是要做的步骤，这是为了后面定位重组整合。
3、问：我做毕赤酵母分泌表达,想问做阴性对照的是应该用加甲醇前的上清还是用一直不加甲醇摇瓶同样时间的上清呢?参考见解：对于阴性对照我一般都用转了不含基因的原始质粒（比如９K等）的菌作为对照，诱导过程中同样加入甲醇，诱导的时间均一样，每次样品都会有一个对照。
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酵母表达体系构建
酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。
构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。
本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。
一、选择酵母菌种和载体
1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。
常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。
2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。
在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。
二、目的基因的克隆和鉴定
1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。
可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。
2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。
3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。
三、构建酵母表达体系
1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。
2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。
3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。
4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。
同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。
5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。
6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。
四、注意事项
1．在构建酵母表达体系时，应注意选择无毒、无害的载体和宿主细胞，以确保生产出的生物制品安全可靠。
2．在转化和筛选过程中，应严格遵守操作规程，避免交叉污染和误操作导致实验失败。
3．在优化表达条件时，应综合考虑各种因素对目的基因表达的影响，以获得最佳的表达效果。
4．在生产与纯化过程中，应注意保持生产环境的清洁和卫生，以确保产品质量和安全。
5．在整个过程中，应注意记录实验数据和结果，并进行总结和分析，以便不断提高和完善酵母表达体系的构建和应用水平。
总之，构建酵母表达体系需要多方面的知识和技能，包括基因克
隆、转化、筛选、表达条件优化等。
只有掌握了这些技术和注意事项，才能成功构建出高效、稳定的酵母表达体系，为生物制品的生产和研究提供有力支持。