分别利用产甘油假丝酵母抗逆转录因子CgSTB5和CgSEF1对酿酒酵母菌株糠醛耐受
高强度产甘油假丝酵母突变株的选育及其发酵性状
甘 油 的 生 产 方 法 一 直 是 以 皂 化 法 和 化 学 合 成 法 为 主 ． 用 微 生 物 法 生 产 甘 油 作 为 生 产 甘 油 的 又 利
一
有 降 低 ， 发 酵 速 度 明 显 提 高 的 突 变 菌 株 ， 对 该 而 并
突变 菌 株 的发 酵 性 状 进 行 了 初 步 研 究 ．
Ｊ１ ２０ ｕ． ０２
文 章 编 号 ：０ ９—０ ８ ２ ０ ）４—０ ３ １０ ３ Ｘ（ ０ ２ ０ ３ ６—０ ４
高 强 度 产 甘 油 假 丝 酵 母 突 变 株 的 选 育 及 其 发 酵 性 状
郭 雪 娜 ， 诸 葛斌 ， 邱 重 晏 ， 诸 葛健
（ 南 大 学 工 业 生物 技 术 教 育部 重 点 实验 室，江 苏 无 锡 ２ ４ ３ ） 江 １ ０ ６
Ａ ｂ ｔ ａ ｔ Ｃａｎｄｉ ｙ ｅ ｏ ｇｅ ｅ ｗａ ｕ ａ ｅｄ ｂｙ Ｎ ＴＧ ． Ｔｈｅ ｐｈ ｓ ｈｏ ｕｓ ｃ ｓｒ ｃ ： ｄａ ｇｌ ｃ ｒ ｌ ｎｓ ｓ ｓｍ ｔ ｔ ｏ ｐ ｒ ｏｎｃ ｎｔａ ｉ ｎ ｏｆｓ ｒ ｅ ｎｇ ｅ ｒ ｔｏ ｃ ｅ ｎｉ ｍ ｅｄ ｕ ， ｉ ｈ ｃ ｉｍ ｎ ｗ ｉ ｈ ｐｈｏ ｐｈ ｕ ｏｕ ｃ ｏｎ ｉｔ ｏ ｎ ｓ ｅ ｐ ｌｑ ｏｒａ ｎ ｇ ｎｉ ｏ ｐ ｒ ， ｗ ａ ６０ ｓ ｏｒ ｓ ｓ ｒ ｅ ｃ ｓｓ ｓｏｆｃ ｒ ｔ ｅ ｉ ｕ ｎｄ ｉ ｏｒ ａ ｃ ｐｈ ｓ ｈｏ ｕｓ ｓ４
学 发 酵 甘 油 研 究 设计 中 心保 藏 ．
１ １ ２ 种 子 培 养 基 葡 萄 糖 １ ０ ｇ Ｉ 尿 素 ２ ｇ Ｉ ．． ０ ／ ， ／ ，
玉 米 浆 １ …ｉ ０ｍＩ ／ １ １ ３ 发 酵 培 养基 ．． 玉 米 浆 ５ｇ Ｉ． ／ 葡 萄 糖 ２ ０ ｇ Ｉ 尿 素 ２ｇ Ｉ ５ ／ ， ／ ，
产甘油假丝酵母甘油合成关键酶基因CgGPD1多拷贝表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
Ｗ ＮＧ ｈ ｎ ， Ｒ ）Ｚ ｉ ｎ 。 Ｚ Ｚ ｅ Ａ（ ｈ＿ ｇ ＿ ｍｉ ， ＨＵＧＥ Ｂｎ ， Ｓ ｉ ＨＥＮ ｅ ， Ｆ Ｗ ＡＮＧ ｉ ｇ ， Ｚ Ｈｕ一 ＨＵＧＥＪａ ｎ ｉｎ， 。
（ ．Ｋｅ ｂ ｒ ｔｒ ｆ ｎ ｕ ｔｉｌ ｉｔｃ ｎ ｌｇ ，Ｍ ｉｉｔｙｏ ｄ ｃｔｏ Ｊａ ｇ ａ １ ｅｓｔ ，Ｗ ｕ ｉ ｌ １ ２，Ｃｈｎ ； １ ｙＩａ ｏ ａｏ ｙｏ ｄ ｓｒａ ｏ ｅ ｈ ０ｏ ｙ Ｉ Ｂ ｎ ｓｒ ｆＥ ｕ ａｉｎ， ｉｎ ｎ ｎＵＩｖ ｒｉｙ ｉ ｘ ４ ２ ２ ｉａ
度 的升 高 而增 加 。 当 Ｎａ ｌ 量浓度 达到 ２ ５ｇ ｄ Ｃ 质 ． ／ Ｌ时 ， ＤＨ 的酶 活比在 Ｏ ５ｇ ｄ Ｃ 下 平均 ＧＰ ． ／ Ｌ Ｎａ ｌ 提 高 ３ ． ；当葡萄糖 质量 浓度提 高至 １ ／ Ｌ 时 ， Ｐ １２ ０ｇ ｄ Ｇ ＤＨ 的酶 活 比 ２ ｇ ｄ ／ Ｌ葡 萄糖 下 平 均提 高
平均提 高 ９ ９ 。以上结 果表 明 ， 大肠杆 菌 中 Ｃ ＧＰ ． 在 ｇ Ｄ１基 因的表达 同样 受渗 透压胁 迫调 节 。
关键 词 ： 浆 ３磷酸 甘 油脱氢 酶 ；产甘 油假 丝酵母 ；渗透压 胁迫 胞 一 中图分 类号 ： ３ ． ７ Ｑ ９ ９ ９ 文 献标识 码 ： Ａ
文 章 编 号 ： ６ ３１ ８ （ 【 ８ Ｏ 一０ Ｏ Ｏ １ ７ — ６ ９ ２） ） ５ｏ ５ ～７ （ ］
产甘油假 丝酵Байду номын сангаас甘油合成关键酶基 因 Ｃ Ｇ Ｄ１多拷贝表 达载体的构建及 ｇ Ｐ 其在大肠杆菌中的表达
王 震ｈ， 饶 志明 。
江 苏 无锡 ２ ４ ２ ） １ １ ２ 摘 要 ： 用 Ｐ Ｒ的 方法从 产甘 油假丝 酵母 （ 采 Ｃ ＆ｇ Ｐ ０ 鲫Ｐ ） ｚ ｆｒ ｇ 中扩 增 出 ３磷 酸甘 油脱 氢 一
产甘油假丝酵母烯醇化酶基因的克隆及序列分析
第27卷第2期2008年3月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology Vol.27 No.2Mar. 2008 文章编号:167321689(2008)022******* 收稿日期:2007203206. 基金项目:国家自然科学基金项目(30570142).作者简介:姚雁(19802),女,河北怀来人,发酵工程硕士研究生.3通讯作者:沈微(19682),男,江苏无锡人,工学博士,副教授,主要从事微生物学的研究.Email :microshen @gmail 1google 1com诸葛健(19392),男,浙江金华人,教授,博士生导师,主要从事发酵工程和工业微生物领域的研究.Email :jianzhuge @hotmail 1com产甘油假丝酵母烯醇化酶基因的克隆及序列分析姚雁, 沈微3, 饶志明, 王正祥, 诸葛健3(食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡214122)摘 要:从产甘油假丝酵母(Can di da gl yceri nogenes )基因文库中分离了一个含烯醇化酶基因(CgENO1)的克隆子。
插入片段全长2456bp ,包含一段1314bp 的没有内含子的蛋白质编码区,编码一个含438个氨基酸残基的多肽链,其氨基酸序列与来源于酿酒酵母的烯醇化酶相似性为74.3%。
多重序列比对显示,产甘油假丝酵母烯醇化酶(CgENO1)含有酵母烯醇化酶全部保守区。
对编码区上下游序列分析显示,克隆片段含有典型的酵母基因上下游调控区,是一个完整的酵母新基因。
关键词:产甘油假丝酵母;烯醇化酶;序列分析中图分类号:Q 786文献标识码:ACloning and Sequence Analysis of the Ca ndida gl yceri nogenes E nolase G eneYAO Yan , SH EN Wei 3, RAO Zhi 2min , WAN G Zheng 2xiang , ZHU GE Jian 3(National Key Laboratory of Food Sceince and Technolgoy ,Jiangnan University ,Wuxi 214121,China )Abstract :A DNA clone containing t he p utative Candida glycerinogenes enolase gene (CgENO1)was isolated from genomic library.The 2456bp insert contained a int ronless open reading f rame (ORF )of 1314bp encoding a peptide of 438amino acid residues wit h 74.3%similarity to t he Saccharomyces cerevisiae enolase 1.Multi 2alignment compariso n revealed t he CgENO1contained all t he conserved regions of yeast enolase.Sequence analysis of 5’2and 3’2flanks of t he ORF revealed t he existence of several regulatory element s of t he yeast genes ,so t he gene cloned was a complete new gene.K ey w ords :Candi da gl yceri nogenes ;enolase ;sequence analysis 产甘油假丝酵母(Can di da gl yceri nogenes )是中国发酵甘油工业的生产菌种,除过量合成甘油外,该酵母还具有耐受高渗透压的优良性能[1]。
2019年北京高三二模生物汇编：选修一、三含答案
2019年北京高三二模生物汇编：选修一、三一．选择题（共11小题）1．（2019•东城区二模）图为农杆菌Ti质粒的T﹣DNA区段结构示意图。
农杆菌附着植物细胞后，T﹣DNA 首先在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制，然后进入植物细胞并整合到染色体上，继而诱发细胞异常生长和分裂，形成植物肿瘤。
以下有关叙述不正确的是（）A．Ti质粒存在于农杆菌的拟核DNA之外B．植物肿瘤的形成与A、B两个基因的表达有关C．清除植物肿瘤组织中的农杆菌后肿瘤不再生长D．利用T﹣DNA进行转基因时需保留LB、RB序列2．（2019•西城区二模）酵母菌细胞壁的主要成分是几丁质。
酿酒酵母产酒精能力强，但没有合成淀粉酶的能力；糖化酵母能合成淀粉酶，但酒精发酵能力弱。
科研人员通过两种途径改良酵母菌种，实现以淀粉为底物高效生产酒精的目的。
下列叙述正确的是（）A．途径Ⅰ需用纤维素酶处理酵母菌，再利用PEG诱导融合B．途径Ⅱ需要以淀粉酶基因作为目的基因构建表达载体C．途径Ⅰ和途径Ⅱ最终获得的目的酵母菌染色体数目相同D．以淀粉转化为还原糖的效率作为最终鉴定目的菌的指标3．（2019•海淀区二模）为提高大都对磷元素的吸收能力，研究人员利用杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中，如图为重组Ti质粒上T﹣DNA的序列结构示意图。
下列相关叙述不正确的是（）A．以水稻RNA为模板通过逆转录及PCR扩增可获得大量OsPTF基因B．RNA聚合酶与启动子1识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录C．可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因大豆愈伤组织D．用EcoRI、BamHI双酶切重组Ti质粒后，经电泳分离至少得到两条带4．（2019•朝阳区二模）餐厨废水含有丰富的糖类、蛋白质等有机物，研究者将三种细菌单独或混合接种于餐厨废水培养液中，通过测定菌悬液细胞密度（结果如表）研究三者的关系，以期为利用餐厨废水制备复合菌肥的研究提供依据。
下列说法错误的是（）对照组单独培养组三种细菌混合培养组解磷巨大芽孢杆菌08.498.24圆褐固氮菌 5.09 3.35解钾胶质芽孢杆菌 2.81 1.41注：cfu•mL﹣1指每毫升样品中培养出的菌落数A．上述细菌作为分解者将餐厨废水中的有机物分解B．对照组的培养液为没有经过灭菌处理的餐厨废水C．可用稀释涂布平板法，计算不同条件下的活菌数D．由结果可知，解磷巨大芽孢杆菌的竞争能力较强5．（2019•朝阳区二模）以下高中生物学实验中，表述正确的是（）A．实验1、2、3、4中的颜色都是经过染色出现的B．实验1不需要对照，图示结果表明细胞正在失水C．实验2中刚果红培养基可用于筛选尿素分解菌D．可从同种植物的不同部位取材进行实验1和36．（2019•丰台区二模）甲基对硫磷是常见的农药污染物。
纸片真菌药敏法与浓度梯度法检测 氟康唑对 种酵母样真菌 …
中华医院感染学杂志 2004 年第 14 卷第 10 期
·1101 ·
计算 。
112 菌株鉴定 将不同标本直接划种沙保弱琼脂 (自制) ,35 ℃培养 ,用全自动细菌鉴定系统 VITEK2 CC4 的 YBC 鉴定卡 (法国生物梅里埃公司) 进行鉴 定 ,鉴定概率值 > 90 % ,作为本次实验菌株 。 113 Etest 方法 氟康唑 Etest 试条由 AB BioDisc 生 产 ,MIC 检测范围 01125～256mg/ L ,按操作说明进 行 ,酵母菌配制成 015 麦氏浊度 ,35 ℃培养 24～48 h 后观测结果 ;隐球菌属配制成 1 个麦氏浊度 ,35 ℃培 养 48～72 h 观测结果 。质控标准 :近平滑假丝酵母 菌 ATCC 22019 ,2～16 ;克柔假丝酵母菌 ATCC 6258 , ≥256 ;白色假丝酵母菌 ATCC 90028 ,01125～1 。氟 康唑的判断标准 : (1997NCCLS 推荐) MIC ≤8mg/ L 为 敏感 ( S) ; MIC16 ～ 32mg/ L 为 剂 量 依 赖 性 敏 感 (SDD) ;MIC ≥64mg/ L 为耐药 (R) 3 。 114 纸片法真菌药敏 (丹麦 Rosco 公司) 4 氟康 唑纸片的含量为 15μg/ 片 。将改良 Shadomy 琼脂平 皿置 35 ℃干 燥 20 ～ 25 min , 吸 110ml 待 检 菌 液
rosco纸片法真菌药敏其操作简单相对比中华医院感染学杂志2004年第14卷第10etest方法成本低与nccls认可的肉汤稀释法有良好符合率本次结果也显示与etest方法有较高符合率9215同时结果判读清晰已被多个国家使用来监测真菌的耐药性26但该纸片法在本次实验中对于检测处于临界值mic的菌株有一定的误差对于区分sdd株存在不足与国外报道基本一致因此对从严重的系统感染患者分离到的酵母菌应遵循更为严格的判断标准有条件的实验室应用etest方法检测其mic值有利于临床准确使用抗真菌药物
产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因
产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因在酿酒酵母中的表达*中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(1):38～41赵有玺1,2饶志明1**沈微1方慧英1诸葛健1**（1 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院工业微生物研究中心无锡214036)(2 北京联合大学生物化学工程学院北京100023）摘要甘油是一种极其理想的耐高渗透压介质。
利用PCR方法，从产甘油假丝酵母WL2002 5中扩增出了2个产甘油的关键酶基因GPD和GPP，分别编码3 磷酸甘油脱氢酶（glycerol 3 phosphate dehydrogenase, GPD）和3 磷酸甘油磷酸酶（glycerol 3 phosphate phosphatase, GPP）。
利用T Vector在Escherichia coli JM109中克隆得到大量的GPD 和GPP基因，并成功构建了重组质粒pYX212 GPD和pYX212 GPP；通过LiAc转化法将重组质粒导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303 1A。
初步实验结果表明：发酵过程中pYX212 GPD/S. cerevisiae W303 1A的生物量高于pYX212 GPP/S. cerevisiae W303 1A和野生型S. cerevisiae W303 1A；发酵72h后，pYX212 GPD/S. cerevisiae W303 1A发酵液中甘油含量大约为12mmol/L，明显高于野生型S. cerevisiae W303 1A 的甘油含量，而pYX212 GPP/S. cerevisiae W303 1A与野生型S. cerevisiae W303 1A在甘油含量上相差不大，均只有4mmol/L 左右。
关键词甘油3 磷酸甘油脱氢酶3 磷酸甘油磷酸酶酵母工程菌中图分类号Q786收稿日期：2005 03 09修回日期：2005 09 22*国家自然科学基金资助项目（30300027），江南大学工业生物技术教育部重点实验室开放基金资助项目（KLIB KF200507），江南大学预研基金资助项目（0004402）** 通讯作者，电子信箱：raozm@ 甘油是一种极其理想的耐高渗透压介质。
高糖胁迫下产甘油假丝酵母细胞质膜抗逆应答机制的初步研究
高糖胁迫下产甘油假丝酵母细胞质膜抗逆应答机制的初步研究产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）具有抗逆性强、糖代谢迅速、目标产物转化率高等特点,特别是在500 g·L<sup>-1</sup>的高葡萄糖浓度下仍可维持很好的发酵性能,是一株可应用于节能环保浓醪发酵的渗透压工业酵母。
酵母细胞质膜是其与外界环境进行物质能量交换和信号传递的重要场所,在胁迫压力下会发生一系列的动态应答,与此相关的理论机制可为指导实际生产提供重要的科学依据。
本研究在建立了一种适合C.glycerinogenes质膜提取方法的基础上,对其高糖胁迫下质膜的组成和相关基因的全局转录应答机制展开研究,主要结果如下:（1）采用先制备原生质体、再低渗裂解获得粗膜提取物、最后双水相分离纯化细胞质膜的策略,优化了原生质体的制备方法和粗膜的两相分离纯化体系,得到一种适合于C.glycerinogenes的高效质膜提取方法,优化后质膜纯度平均可达65%以上。
（2）研究发现,C.glycerinogenes在高浓度葡萄糖胁迫下,细胞质膜中的不饱和脂肪酸（特别是油酸）和麦角固醇的相对含量显著增加,而细胞质膜的流动性和通透性出现不同程度的降低。
因此,C.glycerinogenes细胞质膜在高糖胁迫下通过增加油酸的含量来稳固细胞质膜的流动性,通过增加麦角固醇的含量来维持质膜稳态。
（3）利用RNA-Seq测序技术考察高糖胁迫下C.glycerinogenes细胞质膜相关基因的全局转录应答情况,结果发现:获得了85个质膜相关差异显著表达基因,其中68个上调,17个下调;麦角固醇合成相关基因ERG6、ERG2、ERG3、ERG5、ERG4显著上调,这与麦角固醇含量增加的结果相符合;不饱和脂肪酸合成途径中大部分基因显著上调;1个葡萄糖转运蛋白基因的差异表达倍数最高（log2=9.55）;糖脂合成、MAPK途径、mTOR途径的差异基因均显著上调。
211091438_耐酒精高产L-乳酸菌株的筛选及发酵培养基优化
肖敏敏，邢馨月，刘文光，等. 耐酒精高产L-乳酸菌株的筛选及发酵培养基优化[J]. 食品工业科技，2023，44（8）：135−143. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022040147XIAO Minmin, XING Xinyue, LIU Wenguang, et al. Screening of an Alcohol Tolerant and High-yield L-lactic Acid Strain and Optimization of Culture Medium[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(8): 135−143. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022040147· 生物工程 ·耐酒精高产L-乳酸菌株的筛选及发酵培养基优化肖敏敏1，邢馨月1，刘文光2，孟祥慧1，魏姗姗1，张天笑1，王玉华1，李 侠1,*（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118；2.华信检测技术有限公司，吉林长春 130000）摘 要：为提高L-乳酸产量，降低L-乳酸的生产成本，该研究经过筛选、驯化获得一株耐酒精且高产L-乳酸的菌株鼠李糖乳杆菌AK-0779。
使用玉米酒糟代替部分酵母粉作为菌株AK-0779发酵培养基的氮源。
在单因素实验基础上，对葡萄糖添加量、酵母粉添加量和玉米酒糟添加量进行三因素三水平响应面优化试验。
结果表明，最适发酵培养基为：葡萄糖添加量9.80%，玉米酒糟添加量0.98%，酵母粉添加量1.72%，L-乳酸产量为78.91 g/L ，糖酸转换率为80.52%。
与酵母粉完全充当氮源产L-乳酸82.36 g/L 相比，产量无显著差异，说明玉米酒糟能有效代替部分酵母粉作为发酵培养基的氮源，降低L-乳酸生产成本。
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分别利用产甘油假丝酵母抗逆转录因子CgSTB5和CgSEF1对酿酒酵母菌株糠醛耐受
产甘油假丝酵母抗逆转录因子CgSTB5和CgSEF1是两个与逆境应答相关的基因。
它们在酿酒酵母菌株中的糠醛耐受性方面可能发挥一定的作用。
下面是分别利用这两个基因进行的研究方法：
1. 利用CgSTB5增强酵母的糠醛耐受性：
- 克隆CgSTB5基因：首先，将CgSTB5基因从产甘油假丝酵母中克隆出来。
- 构建表达载体：将CgSTB5基因插入一个适合酿酒酵母的表达载体中，以便在酿酒酵母中进行表达。
- 转形酿酒酵母：将表达载体导入酿酒酵母细胞中，使其表达CgSTB5。
- 鉴定表达水平：通过RT-PCR、Western blot或其他适当的方法确认CgSTB5在酿酒酵母中的表达水平。
- 酸性糠醛处理：将转形后表达CgSTB5的酿酒酵母细胞暴露在含有酸性糠醛的培养基中。
- 分析耐受性变化：通过细胞生长曲线、存活率、基因表达等指标来评估酿酒酵母在糠醛胁迫下的耐受性。
2. 利用CgSEF1增强酵母的糠醛耐受性：
- 克隆CgSEF1基因：将CgSEF1基因从产甘油假丝酵母中克隆出来。
- 构建表达载体：将CgSEF1基因插入一个适合酿酒酵母的表达载体中，使其在酿酒酵母中进行表达。
- 转形酿酒酵母：将表达载体导入酿酒酵母细胞中，使其表达CgSEF1。
- 鉴定表达水平：通过RT-PCR、Western blot或其他适当的方法确认CgSEF1在酿酒酵母中的表达水平。
- 糠醛耐受性测试：将转形后表达CgSEF1的酿酒酵母细胞暴露在含有糠醛的培养基中。
- 评估耐受性变化：通过细胞生长曲线、存活率、基因表达等指标来评估酿酒酵母在糠醛胁迫下的耐受性。
这些方法可以帮助研究人员了解CgSTB5和CgSEF1对酿酒酵母菌株糠醛耐受性的影响，从而为改良高糠醛耐受性的酿酒酵母菌株提供理论基础。
请注意，在具体实验中应根据实际情况优化实验条件和测量方法。