时间分辨荧光分析技术
时间分辨荧光免疫层析 技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，利用
镧系元素标记抗原或抗体，通过时间分辨技术测量荧光。
具体来说，当含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区时，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析。
当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微
球标记物继续向前层析，与固定在质控线上的二抗结合。
反应结束后，用紫外光源（340nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线
上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。
通过
测量延缓时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以排除非特异本底荧光的干扰。
通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和可定量分析等特点。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅时间分辨荧光免疫层析相关文献或咨询该领域专家。
均相时间分辨荧光技术
卡尔·古斯塔法·莫桑德尔 （Carl·Gustaf·Mosander）
背景简介——镧
镧的发现
镧于1839年1月，由在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡研究所的卡尔·古斯 塔法·莫桑德尔（Carl·Gustaf·Mosander）发现。他从在1803已 经发现的铈中提取了它。莫桑德尔注意到他的大多数氧化铈样本不 可溶，而有些是可溶的，他推断这是一种新元素的氧化物。他从铈 中提取出了第二种元素，他称之为didymium（镨钕混合物）。然而 他没有意识到didymium也是混合物，在1885年它被分离成了镨和钕。
利用长发射半衰期的稀土镧系元素作为供体荧光团，HTRF技术结合了荧光共振能量转移 （FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence） 两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF 技术拥有 如下优势：实验方式灵活、可靠，并且具有更高的灵敏度、 稳定，实验结果的假阳性率较低
镧系元素：lanthanide element
镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门， 是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素后又 找到稀土元素中的三个。镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土 元素的第二道大门，是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继 铈和钇两个元素后又找到稀土元素中的三个。
二、荧光共振能量转移
荧光共振能量的缺点：
然而，这些生物测定法在荧光检测方面具有很大的缺点，因为它被来自散射激发光的背 景噪声显着抑制，并且受到样品中共存材料荧光（荧光化合物和粉尘/线）的显着干扰，使其 变得困难以获得高度敏感的测量而且在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰 期非常短，其背景荧光较强。
科技成果——时间分辨荧光测控分析技术
科技成果——时间分辨荧光测控分析技术
成果简介
时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）具有灵敏度高、特异性强、不受背景荧光干扰等特点，在即时检验（POCT）领域有极高的发展潜力。
目前市场上的TRFIA分析仪以中大型为主，手持式极少。
本项目围绕小型化、低成本等理念，将TRFIA技术应用到POCT 领域。
该小型化TRFIA测控模块，尺寸小、成本低、检测速度快、重复性好、适用于多种稀土螯合物。
在无滤光片条件下，基本达到了小型化TRFIA测控模块的性能极限。
性能优势
（1）使用双自由度调光法，更优良；
（2）单次采样即可满足精度要求，采样时间更短；
（3）单/双通道可节省两块滤光片，成本低一半；
（4）采用基于多点采样数据拟合法的荧光物质浓度测定法。
技术成熟度原理样机
国家重大科学仪器设备专项（2012YQ3026102）：核酸扩增产物实时荧光快速检测关键技术及部件开发，完成TRFIA分析仪的核心模块——TRFIA测控模块的研究。
合作方式合作开发。
时间分辨荧光技术
时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。
大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。
荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。
但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。
不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。
平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。
时间分辨荧光技术
• 荧光素的Stokes位移为280nm 3、荧光特异性强（发射光谱带很窄：615± 5nm）
4、解离-增强技术 可使其荧光性提高100万倍
18
利用镧系元素荧光物
理特性，荧光激发后
在固定时间段检测特 异性荧光而在此时间 之前，非特异性荧光 已完全衰减为0
19
巨大Stokes位移
发射光谱与激发 光谱间存在的巨 大Stokes位移。可 以通过干涉滤光 片将发射光谱与
21
22
时间分辨荧光技术 （TRFIA）
1
主要内容时间Fra bibliotek辨荧光免疫技术背景 时间分辨荧光免疫技术应用 时间分辨荧光免疫技术简介
2
时间分辨荧光免疫技术背景
1979年，提出“时间分辨荧光免疫分析”理论，1989年该技术
获诺贝尔化学奖提名。
90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高（10-18mol/L)， 操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污 染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。 时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景 的分析手段
激发光谱完全分
离
20
时间分辨荧光免疫---突出优点
特异性荧光与非特异性荧光分离，发射荧光与激发光分离，零本底、 零背景、高特异性、高灵敏度 荧光性大大提高，稳定的荧光螯合物，线性范围宽 原子标记，标记位点多，可达20个，对标记物结构及活性影响小，无 衰变，受环境影响小。高稳定性，高精确度，试剂有效期长，标准曲 线稳定性好 多标记，同一试剂盒可同时测多个项目，易于自动化 对环境及人体没有任何影响
5
时间分辨荧光免疫技术简介
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)操作
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。
它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。
从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。
在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。
对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。
（一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序1 开机1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。
1.2 打开计算机显示器。
1.3 启动计算机。
1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。
Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。
在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。
2 开机后准备1.1 清洗液准备1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。
1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。
1.2 样品处理器准备1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。
拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。
1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。
时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(time-reso1vedfIuoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。
其主要特点是以锢系元素铺(Eu3υ等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。
一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。
铺系元素第(Eu).彭(Sn1)、轼(Tb)和钛(Nd)通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。
经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。
辆系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出铺系离子，然后与荧光增强液中的B-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强铺系荧光免疫分析(dissociation-enhanced-1anthanidefIuoroimmunoassay,DE1FIA)o锢系元素的发光时间延长，如Eu*和Snr的荧光衰变时间分别达到 4.3×IOns和4.1×10,ns,而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4-10ns,通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。
此外，锢系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，StOkeS位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。
二、试剂组成(一)EuS标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。
密封后4。
C或-20。
C保存，但应避免反复冻融。
若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。
(二)固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。
时间分辨荧光分析技术的应用研究
时间分辨荧光分析技术的应用研究时间分辨荧光分析技术是一种基于表面增强荧光技术，结合时间分辨检测和分析的新型荧光分析方法。
其应用涉及化学、生物学、环境监测等多个领域，具有快速、灵敏、高通量等优点。
本文将从时间分辨荧光分析技术的原理和应用角度，探究其在不同领域的应用及前景。
一、技术原理时间分辨荧光分析技术通过对荧光信号的时间分辨和分析，可以得到更全面、准确的研究结果。
其基本原理为：通过引入表面增强荧光剂和金属纳米颗粒等材料，使样品在激发光作用下，发出强烈的荧光信号。
荧光信号在不同的材料表面上，会受到扩散、共振能量转移等影响，产生不同的荧光寿命和谱型。
利用时间分辨荧光分析仪，可以通过研究荧光信号的寿命和谱型，快速有效地分析样品中目标物质的数量、分子结构、反应速率等参数。
二、应用领域2.1 生物学在细胞研究领域，时间分辨荧光分析技术是一种重要的荧光探针和成像工具。
例如，可以通过合成表面增强荧光生物传感器，对等离子体膜上的酶活性、蛋白质结构、细胞内钙离子转运等生物过程进行实时监测和成像。
此外，时间分辨荧光分析技术还可以用于研究荧光标记的生物分子在细胞内部的传递、吸附、反应等过程，为研究基因组学、蛋白质组学等提供了有力的工具。
2.2 化学领域在化学反应动力学研究领域，时间分辨荧光分析技术主要应用于研究化学反应过程中的荧光衰减动力学和反应速率等参数。
例如，利用荧光探针技术，可以对物质分子之间的共振能量转移、酸碱中性化反应、阳离子络合反应等化学反应进行实时监测和定量分析。
此外，时间分辨荧光分析技术还可以用于生化传感器、化学传感器等相关领域的研究。
2.3 环境监测和安全领域在环境监测领域，时间分辨荧光分析技术常用于检测水质中的重金属、污染物等有害成分。
例如，利用荧光标记技术，可以对水中的难降解有机物、重金属等污染物进行定量检测和分析，并快速地监测水质的污染程度。
在安全领域中，时间分辨荧光分析技术还可以用于爆炸物质检测、生化武器检测等方面，具有很强的应用前景。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.1 时间分辨荧光分析技术时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。
本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。
1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。
其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。
图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。
1020152530355E N E R G Y ,103c m -16H 5/2G 5/26H 15/27F 0F 2D 05D17F 6F 545D313/249/2Sm 3+Eu 3+Tb 3+Dy 3+H 9/2图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。
当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。
以铕(III)配合物为例，其荧光发光机理如图1.2所示[9]，包括三线态发光机理和单线态发光机理。
当铕(III)配合物受光激发后，配体分子吸收激发光能量由基态S 0跃迁至第一单线激发态S 1，处于此激发态的分子不稳定，可以通过辐射跃迁的方式返回基态，发出配体荧光（S 1→S 0），也可以通过系间窜跃（非辐射跃迁方式）将能量传递至配体的第一三线激发态T 1。
处于T 1能级的配体分子可以通过辐射跃迁的方式回到基态，发出配体磷光（T 1→S 0）；当T 1能级高于Eu 3+的共振能级时，能量就可以进一步传递给Eu 3+使之激发至共振能级，并在由共振能级跃迁回基态的过程中发出Eu 3+的特征荧光，此即三线态发光机理。
而上述处于S 1激发态的配体分子如果不经过T 1激发态，直接将能量传递给Eu 3+使之激发至共振能级，然后由共振能级跃迁回基态发出Eu 3+的特征荧光，此即单线态发光机理。
到目前为止，绝大多数的Eu 3+配合物的荧光发光都遵循三线态发光机理，只有极个别的遵循单线态发光机理。
Eu 3+ligandS1S7FF2D 0D1F 6Eu 3+ligandSS F 0F 2D 0D 1F 6D 3D 2(a) (b)图1.2 铕(III)配合物发光机理示意图：（a ）三线态发光机理；（b ）单线态发光机理 Fig. 1.2 Schematic diagrams of the radiative processes of the chelate leading to Eu 3+ fluorescence by (a) triplet excited state mechanism and (b) singlet excited state mechanism不同于有机荧光化合物，稀土配合物的荧光性质，一方面取决于有机配位体的三重态能级T 1的位置，另一方面取决于配位体与稀土离子处于激发态时的能量匹配程度。
荧光发光的波长和强度，均随稀土离子的不同而不同。
Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+、Dy 3+等稀土离子的配合物属于镧系元素荧光配合物中的强荧光物质。
激发这些离子所需能量较低，同时由于这些离子的激发态和基态能量相差较大，非放射迁移较小，因此它们的荧光量子产率相对较高。
由于稀土荧光配合物特殊的发光机理，使其相对于常规有机荧光化合物，像荧光素和罗丹明等而言具有以下特点：（1）荧光发射的特征峰波长主要与中心离子有关，而与配位体结构关联不大。
稀土配合物发光是基于配合物内由配位体到中心金属离子的能量转移所产生的，配位体吸收激发光能量后转移到中心稀土离子，然后再通过中心稀土离子的4f轨道能量跃迁而发出荧光，即接受激发光能量和发射荧光是由不同的部分所完成的，因此同一种稀土离子与不同配位体形成的配合物的荧光发射峰波长基本不变。
（2）荧光寿命非常长，通常在10 μs（Sm3+、Dy3+）或100 μs（Eu3+、Tb3+）以上。
这是由于稀土配合物的发光是经过配位体的三重态的能量转移所致，所产生的荧光是延迟荧光，其寿命比配位体的磷光寿命还要长。
从表1.1可以看出，Eu3+配合物的荧光寿命比普通荧光化合物的荧光寿命要长大约105倍。
利用这种长荧光寿命，就可进行百微秒级的时间分辨荧光测定。
（3）稀土配合物所发荧光的Stokes位移(最大发射峰与最大吸收峰之间的波长差) 非常大，大部分在200 nm以上，对克服因激发光而导致的散乱光对测定的干扰很有利。
（4）荧光激发谱带较宽，有利于增高激发能，而发射峰非常尖锐，半峰宽通常在10~15 nm，为类线性光谱，有利于降低本底，提高分辨率。
稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质比较[10-12]见表1.1。
表1.1 稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质Tab. 1.1 Fluorescence properties of lanthanide complex and conventional organiccompoundsCompound Lifetime(ns)λex,max(nm)λem,max(nm)Stokes shift(nm)Quantumyields (Q)ε(mol-1Lcm-1)FITC 4.5492518260.85 7.0 x 104 RBITC3550585350.70 1.2 x 104 Cy5 ---- 650 667 17 0.27 2.5 x 105 Eu(β--NTA)37 x 1053406132730.209 3.6 x 104 FITC: Fluorescein isothiocyanate; RBITC: Rhodamine-B200-isothiocyanate; Cy5: Cyanine dye;β--NTA: 2-naphthoyltrifluorobutanedione.1.1.2 时间分辨荧光测定原理时间分辨荧光测定技术是利用稀土配合物具有长寿命荧光这一特点，在样品被脉冲光激发后、荧光信号采集前，根据样品中所包含的荧光物质荧光寿命的不同引入一定的延迟时间(delay time)，待短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的特异性荧光信号进行测定，原理如图1.3所示。
采用时间分辨荧光测定技术可以有效消除来自样品、试剂、仪器等的短寿命非特异性荧光的干扰，从而极大地提高荧光检测的灵敏度。
Time (µs)F l u o r e s c e n c e i n t e n c i t y图1.3 时间分辨荧光测定的原理Fig. 1.3 Principle of time-resolved fluorescence measurement1.1.3 时间分辨荧光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术是采用具有超长荧光寿命的稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光生化分析技术。
详细内容将在1.2.4.5节进行叙述。
1.1.4 时间分辨荧光显微镜生物成像技术荧光显微镜生物成像技术因其具有可视化特点，已成为不同生物环境中生物分子的可视化及生物功能的阐述等方面的一种强有力的工具[13,14]。
然而对于一些复杂生物体系来讲，体系本身的自发荧光及仪器背景荧光会对荧光成像产生严重干扰。
在过去十年中逐渐发展起来的时间分辨荧光显微镜生物成像技术是基于长寿命稀土荧光标记物而建立起来的，目前被广泛应用于免疫组织化学[15-17]、免疫细胞化学[18]、原位核酸杂交[15,16]、生物分子可视化和定量测定[19,20]、细胞中特定离子检测[21]及环境微生物检测[22,23]等方面。
该技术的最大优点是能够在脉冲激发和荧光成像检测之间引入适当的延迟时间，从而消除常规荧光显微镜测定时生物样品的短寿命本底荧光对测定的干扰，使得影像具有更高的灵敏度和信噪比。
1992年，Soini 等以4-(4’-异硫氰基苯乙炔基)-2,6-二(胺甲基-N,N-二乙酸基)-吡啶-Eu 3+配合物标记的抗体或SA 为探针，用于与人结肠恶性粘膜癌相关的C242抗原、人软骨性生长II 类胶原质mRNA 、人宫颈扁平上皮细胞中的HPV 特异基因的时间分辨荧光显微镜成像定位[15]。
实验结果表明通过时间分辨荧光成像方法可以有效消除免疫组织化学及核酸原位杂交反应中的样品自发荧光对测定的干扰，从而实现在细胞和组织水平上的高对比度成像测定。
使用Eu3+荧光标记物的时间分辨荧光显微镜测定技术还被用于人类血清中胰岛细胞自身抗体的定量测定[20]。
该方法首先在载片表面将血清和胰腺组织反应，然后载片再与铕配合物标记的抗人IgG抗体反应，最后进行时间分辨荧光显微镜测定。
该法的信噪比要比常规测定法大12倍。
1999年，Lilja等人将铕荧光配合物标记的SA用于前列腺组织中前列腺特异抗原的免疫组织化学测定[17]。
比起使用过氧化物酶标记SA的测定法，时间分辨荧光显微镜成像测定法具有高信噪比和高灵敏度的优点，可用于替代所有使用过氧化物酶标记SA的测定法。
2001年，Lövgren等人以铕纳米微粒作为荧光标记物，采用时间分辨荧光成像方法实现了对单个前列腺特异抗原分子的可视化检测[19]。
2004年，Piper等人报道了利用时间分辨荧光显微镜成像技术检测浓缩水样中的病源微生物Cryptosporidium和Giardia。
他们首先将BHHST-Eu3+配合物分别标记上抗Cryptosporidium单抗和羊抗鼠二次抗体，然后分别与浓缩水样中的Cryptosporidium和经单抗预处理过的Giardia共同孵育，最后进行时间分辨荧光成像检测。
结果显示水样中杂质的强背景荧光被完全消除，检测信噪比增强了10倍[22]。
2007年，Nagano等开发出一种基于铕配合物的Zn2+选择性化学传感器，将其注射进入活Hela细胞内，利用时间分辨荧光显微镜能够监测出细胞内Zn2+浓度的变化[21]。