氧化应激心肌细胞prohibitin表达与分布变化及其生物学意义
氧化应激对细胞生理功能的影响
氧化应激对细胞生理功能的影响在人类身体中，各种细胞通过相互协作，保持着人体健康的状态。
细胞的正常功能依赖于一系列的代谢和信号传递过程，包括细胞周期调节、凋亡、细胞信号传递等等。
然而，我们并不能保证所有事情都跑得足够流畅，细胞也会面临各类挑战。
例如，细胞环境中过度存在于自由基等有害的氧化物质，就会对细胞造成氧化应激的损害。
氧化应激是指在细胞内部存在高水平的氧化性物质，这些物质可以干扰细胞代谢，从而导致蛋白质、脂质和DNA等细胞生物分子氧化损伤。
氧化应激是众多疾病的共性特点，因为它能造成多种细胞和组织的损伤，包括氧化应激，神经退行性疾病，癌症等。
因此，理解氧化应激对细胞生理功能的影响，对人类健康非常重要。
氧化应激对细胞代谢的影响氧化应激一旦发生，会启动细胞生命机制中的应激适应回应。
这种回应能够调节细胞代谢，以应对相应的应激刺激。
但是，在氧化应激程度越大的情况下，这种适应性的反应就不能够有效挽救细胞的损伤。
举个例子，在细胞内，高水平的H2O2会促进蛋白质和DNA的氧化损伤。
同样，细胞在适应氧化应激的次数越多，会逐渐降低其代谢能力和功能。
再举一个例子，氧化应激可能会影响到线粒体，从而影响到细胞酯基化的过程。
线粒体在腺苷酸转化中发挥了主要的作用，而红细胞中含有大量的腺苷酸分子。
如果细胞受到一些应激，比如放射线暴露、暴饮暴食或者暴力攻击等原因，可能会导致线粒体损伤，从而扰乱细胞代谢。
而这种扰动恰恰会引发氧化应激反应。
氧化应激对细胞凋亡的影响氧化应激不仅会对细胞代谢造成影响，也会对细胞凋亡产生影响。
凋亡是细胞正常运作的一个组成部分，是借助有程序的方式减少细胞数量。
氧化应激可能会损害细胞的DNA，从而导致细胞中的死亡受体被激活。
然而，在氧化应激反应下，代表细胞凋亡信号的基因可能会被削弱，从而阻碍细胞凋亡所需的信号传递。
因此，强烈的氧化应激就会导致细胞在疾病的过程中坏死或者癌变。
刺激低水平的氧化应激反应虽然氧化应激对细胞功能有诸多影响，但低水平的氧化应激反应也可能会对人体产生正向作用。
氧化应激在细胞生物学中的作用
氧化应激在细胞生物学中的作用细胞是生物体的基本构成单位，它们负责完成各种生命活动。
在细胞生物学中，氧化应激是一种常见的现象，指氧化剂通过产生大量反应性氧化物质，如自由基和过氧化物等对生物分子产生损伤。
尽管氧化应激是一种有害的生理现象，但是适度的氧化应激可以调控细胞生物学中的很多过程。
氧化应激和自由基氧化应激是由氧化剂造成的细胞反应，自由基是产生氧化应激的罪魁祸首。
自由基是极其不稳定和富有反应性的分子，它们存在于许多细胞代谢途径中，如线粒体呼吸链、细胞色素P450途径和细胞信号传导途径等。
自由基通过与其他分子进行反应，促进了细胞代谢过程的正常进行。
然而，当细胞内出现紊乱时，自由基生成的速度会急剧增加，导致氧化应激的发生。
氧化应激和疾病氧化应激不仅与细胞生物学的正常生理过程有关，也与多种疾病的发生和发展密切相关。
例如，氧化应激可导致脂质过氧化物的形成，从而引起各种心血管疾病、糖尿病、自身免疫疾病、癌症等疾病的发生和发展。
此外，疾病状态下的细胞呈现出更高的氧化应激程度，从而形成了多种修复机制并参与了多种免疫反应。
研究表明，通过增加抗氧化剂和其他预防氧化应激的元。
氧化应激和免疫反应氧化应激在细胞免疫反应中具有重要作用。
免疫细胞在遭受外部危害时，如病毒感染、细菌感染等，会释放大量的自由基和氧化剂，从而形成氧化应激状态。
这种状态可以刺激免疫细胞参与免疫反应，增强细胞的杀菌能力。
此外，氧化应激还可以刺激细胞凋亡以去除有害细胞。
氧化应激和长寿随着时间的推移，生物体正常细胞的DNA和蛋白质不断遭受氧化应激的影响，容易出现突变、缺陷和损坏，导致老化和疾病的发生。
一些研究表明，适度的氧化应激可以刺激细胞的DNA和蛋白质修复机制，从而有效延缓细胞老化和衰败。
总结在细胞生物学中，氧化应激虽然是一种有害的生理现象，但是适度的氧化应激可以调控细胞生物学中的很多过程。
因此，必要时我们应当寻找合理的调控手段，以平衡氧化应激的正负效应。
氧化应激及其生理学作用
氧化应激及其生理学作用氧化应激（Oxidative Stress）是指人体内一些氧化剂（氧自由基、过氧化氢等）超过抗氧化防御系统的清除能力，导致细胞分子氧化损伤、代谢失调等现象的状态。
产生氧化应激的原因多种多样，包括环境污染、放射线、烟草、饮食等因素，同时人体自身的暴露于应激因素下也能引起氧化应激。
氧化应激在正常生理状态下起到调控机体代谢和防御损伤的作用，但过量和持续的氧化应激会导致细胞和组织的功能损伤和器官衰竭。
氧化应激与多种疾病密切相关，比如心血管疾病、癌症、肺炎、糖尿病、神经系统疾病等。
氧化应激对细胞的影响主要包括蛋白质氧化、脂质过氧化以及核酸氧化等。
蛋白质氧化（Protein oxidation）是指氧化剂能够夺取蛋白质的氢原子，使蛋白质的结构发生改变，导致蛋白质功能失调。
脂质过氧化（Lipid peroxidation）是指氧化剂将脂质中的双键氧化成单键和过氧化脂质，导致膜脂质结构和功能的改变，甚至损伤细胞膜。
核酸氧化（DNA oxidation）是指氧化剂作用于DNA分子，导致DNA链断裂和鸟嘌呤、胸腺嘧啶碱基的氧化损伤，进而影响DNA的复制和修复。
细胞内抗氧化防御系统是对抗氧化应激的主要手段，它由多种成分组成，包括酶类如超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase）、过氧化物酶（Catalase）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase）等，以及非酶类如谷胱甘肽（Glutathione）等。
这些成分协同起来，能够有效地清除自由基和过氧化物，保护细胞和组织不受氧化应激的损伤。
氧化应激对各种器官和组织的影响不同，但总的来说都与细胞损伤、氧气利用程度、代谢失调以及炎症反应有关。
例如，氧化应激对心血管系统产生的影响是心脏肌细胞死亡、血管壁Thickness增加、心肌收缩能力下降等；对肺部产生的影响则是肺气肿、慢性支气管炎、哮喘等；对神经系统的影响是神经退行性疾病、帕金森病、多发性硬化症等；对骨骼系统产生的影响是骨质疏松、风湿性关节炎、骨关节炎等。
氧化应激对细胞功能的影响
氧化应激对细胞功能的影响在我们的身体中，细胞是一个重要的组成部分。
细胞能够进行代谢，保持正常的运作，但是随着年龄的增长、环境污染和生活习惯等多种原因，细胞所处的环境也会发生改变，使得细胞本身的功能受到影响，其中一个重要的原因是氧化应激的影响。
氧化应激，是指细胞内的氧离子和其它自由基与细胞组分发生相互作用形成的一系列有害反应。
氧化应激是由内源性或外源性化学刺激引起的，例如：代谢过程中所产生的自由基、辐射、重金属、化学刺激等。
氧化应激不但可以引发细胞的功能异常，甚至能导致细胞死亡，从而引发一系列疾病。
氧化应激引起的细胞损伤细胞内构成的核糖核酸(DNA)表现出了极高的生命完整性，而且细胞内部能够加以自我修复，保证细胞不会停止运作。
但是在发生氧化应激的情况下，自由基可以直接损伤DNA，而且这部分的DNA修复速度很慢，没有得到及时的修复就会造成遗传信息的损伤。
同时自由基还能够危害膜内和膜外的组分，包括膜磷脂, 蛋白质，以及锌、铁等金属离子。
如此的作用终将使细胞产生功能性的损伤或者死亡，影响我们身体的各种协调运作，导致疾病。
氧化应激引起的疾病氧化应激可以影响许多器官的正常运作，从而引发多种疾病，例如：动脉硬化、肥胖症、高血压、糖尿病、关节炎等。
同时，它也是许多神经性疾病的重要原因，例如：老年性认知症、帕金森氏症、阿尔茨海默病等。
随着研究的进一步深入，氧化应激被认为是多种癌症的风险因素，例如：胃癌、乳腺癌等。
由此可知，防止或减少氧化应激对身体健康有着重要意义。
如何预防或减轻氧化应激对身体的危害？如上文所述，氧化应激可产生重大的危害，但可以采取有效的措施预防或减轻这种危害，下面谈谈具体的方法：1.坚持适度的运动低度的运动，例如散步、跳绳、越野等，能够降低氧化应激的形成，提高抗氧化物的合成能力，预防和减轻疾病的发生。
2.不良生活习惯吸烟、饮酒、过度饮食等不良生活习惯是氧化应激的重要因素之一。
要想减轻氧化应激对身体的危害，必须改变这些生活习惯，养成良好的饮食、作息和运动习惯。
氧化应激和细胞死亡在心血管病中的作用
氧化应激和细胞死亡在心血管病中的作用心血管疾病是指影响心脏和血管功能的疾病。
它是全球最常见的死亡原因之一。
许多心血管疾病的病因多种多样，其中涉及的一种重要机制是氧化应激和细胞死亡。
氧化应激是指生物体内部低浓度的活性氧（ROS）和和高浓度的氧化还原剂（如过氧化氢）对细胞内部的蛋白质、核酸和膜脂质等结构的氧化反应过程。
正常的代谢过程会产生少量的ROS，而过多的氧化应激会对身体造成损害。
在心血管疾病中，氧化应激与细胞死亡密切相关。
研究发现，氧化应激是导致心肌细胞凋亡和坏死的主要原因之一。
氧化应激也会导致血管内皮细胞的损伤，从而增加动脉粥样硬化的风险。
此外，氧化应激还会使动脉壁发生炎症，进一步刺激心血管疾病的发展。
细胞的死亡形式可以分为凋亡和坏死。
凋亡是一种被认为是规则化、有控制的程序性死亡，它通常与细胞发育、组织维持和代谢平衡相关。
坏死是由于严重的机械或化学损伤所引起的一种非规则性的、无控制的死亡方式。
心血管疾病中的细胞死亡主要包括心肌细胞坏死和凋亡、血管内皮细胞凋亡和坏死等。
心肌细胞坏死一旦出现，自然无法再恢复功能，而血管内皮细胞坏死则可能导致动脉壁含水量增加、血小板和白细胞附着等，增加了发生心血管病的风险。
为了预防并治疗心血管疾病，我们需要采取一系列措施，包括控制饮食、参加锻炼、戒烟等。
此外，天然氧化应激的清除剂可以减轻或预防心血管疾病的发生。
一些深色蔬菜（如紫茄子、红萝卜、紫甘蓝等）、水果（如葡萄、树莓、蓝莓等）和红酒含有多酚类的化合物，这些化合物可以作为天然的氧化应激清除剂，被广泛用于心血管疾病的治疗中。
此外，一些药物和健康补品（如维生素E、谷胱甘肽和类花青素等）也可以作为氧化应激清除剂来提高心血管功能。
不过，更具体的疗效和安全性还需要进一步的研究。
总之，氧化应激和细胞死亡是影响心血管疾病发生及发展的重要机制之一，在治疗和预防心血管疾病的过程中，我们需要对氧化应激和细胞死亡这一机制有足够的了解。
氧化应激对心肌细胞的影响
氧化应激对心肌细胞的影响
赵洪涛;郑延松
【期刊名称】《心血管病学进展》
【年(卷),期】2004(025)001
【摘要】@@氧化应激(Oxidative stress)是指[1]:"促氧化与抗氧化之间的平衡失调而倾向于前者,导致可能的损害".促氧化是由体内的各种氧化剂来实现的,而最主要的氧化剂是活性氧(reactive oxygen species,ROS).
【总页数】4页(P70-73)
【作者】赵洪涛;郑延松
【作者单位】第四军医大学西京医院老年病科,陕西,西安,710032;北京解放军301总医院老年病科,北京
【正文语种】中文
【中图分类】RQ505
【相关文献】
1.和营安心方抗心肌细胞氧化应激作用及对心肌细胞内钙离子的影响 [J], 贺伟;李永民;朱娟;张海霞;顾鑫;苏志远
2.miR-202-5p靶向下调SOX6表达对缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激的影响研究 [J], 秦少强;梁惠清;王晓元;张占帅;李会贤;张鹏祥;王蕊;李方江
3.ENST00000418539.1调控miR-24对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的影响 [J], 张明磊;杨清泉;李贞彩;王星;张一帆
4.右美托咪定调控miR-126对高糖诱导的心肌细胞氧化应激及凋亡的影响 [J], 孔
建强;邴淼;汪琼;汪建胜
5.硫酸锌对缺氧/复氧损伤H9c2心肌细胞自噬及氧化应激的影响 [J], 吴小燕;吴曾繁;陈磊
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生物体内氧化应激和细胞凋亡的分子机制
生物体内氧化应激和细胞凋亡的分子机制在生物体内，氧气分子被利用来进行细胞呼吸作用，产生能量。
但是，氧气分子也有一定的副作用，即产生氧化应激。
氧化应激就是在生物体内，氧气分子通过氧化还原反应，将电子移交给细胞分子，形成自由基或活性氧种。
这些氧化物可以影响蛋白质、脂质和核酸等生物分子的结构和功能，从而导致细胞损伤和死亡。
氧化应激是多种疾病的发病机制，包括老年痴呆症、心脏病、癌症等。
细胞反应和适应氧化应激的机制是细胞凋亡。
细胞凋亡是一种代谢性的细胞死亡过程，是一个自我控制的过程，与炎症和坏死不同。
细胞凋亡的重要作用在于维持组织、器官和生命的稳态，消除有损细胞，以防止癌症等疾病。
细胞凋亡的分子机制很复杂，涉及多种分子通路和信号传导。
主要包括线粒体途径、死受体途径和内质网途径。
线粒体途径是最初发现的一种细胞凋亡途径。
线粒体是负责细胞能量代谢和细胞信号传导的细胞器。
在氧化应激的作用下，线粒体膜失去完整性，将释放出一些细胞色素c、凋亡诱导因子等蛋白质，这些蛋白质激活一些半胱氨酸蛋白酶，促进细胞凋亡的发生。
死受体途径是通过细胞表面的一些死受体分子来传导死亡信号。
当死受体受到其特异性的配体结合时，就能生产许多复合物，其中一种复合物叫做死亡诱导信号复合体。
这种复合物中有一种凋亡指示蛋白叫做“线粒体跨膜通道蛋白”。
它能引导线粒体内的一些与凋亡有关的神经物质释放进入细胞内，从而促进细胞凋亡的发生。
内质网途径是近年来研究的比较深入的一种细胞死亡途径。
内质网在细胞如同生产部门的位置上起到一个生产成品蛋白的重要角色。
在内质网失去稳定后，会引起内质网应力和不平衡，然后激活细胞凋亡的钙离子通道、Caspase-12等凋亡蛋白分子，促进细胞凋亡的发生。
总之，生物体内氧化应激和细胞凋亡之间的关系非常密切。
在氧化应激的作用下，细胞通过开启细胞凋亡通路，通过自我控制的过程，对受损细胞进行淘汰，以维持生命的正常运行。
因此，对于避免氧化应激和调节细胞凋亡通路，保证细胞稳态具有举足轻重的作用。
氧化应激心肌细胞prohibitin表达与分布变化及其生物学意义
3基金项目:国家自然科学基金资助课题(30570753)收稿日期:2006203231;修回日期:2006212228作者简介:任 哲(19792),女,内蒙古包头人,硕士在读,从事应激医学研究。
△通讯作者氧化应激心肌细胞prohibitin 表达与分布变化及其生物学意义3任 哲,钱令嘉△,杨志华(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津300050)摘要 目的:探讨prohibitin 在氧化应激心肌细胞中的表达与分布变化的特点及其在心肌细胞损伤中的意义。
方法:H 2O 2干预体外培养乳鼠心肌细胞,建立氧化应激心肌细胞损伤模型;采用生物化学法检测细胞培养液中LDH 活性及M TT 实验观察心肌细胞损伤程度;以Western 印迹法检测氧化应激时prohibitin 蛋白表达变化与分布变化;线粒体H +2A TPase 合成活力实验检测线粒体氧化磷酸化功能;流式细胞术检测线粒体跨膜电位。
结果:氧化应激组LDH 活性显著高于对照组,而细胞存活率低于对照组34151%～6515%;线粒体H +2A TPase 合成活力降低60%;氧化应激组线粒体跨膜电位显著低于对照组;心肌细胞prohibitin 表达水平在H 2O 2处理3h 出现升高然后回落到正常水平,线粒体prohibitin 表达水平高于对照组。
结论:氧化应激心肌细胞prohibitin 表达水平代偿性增加并有向线粒体移位的趋势,氧化应激导致心肌细胞线粒体功能障碍。
关键词: prohibitin ; 氧化应激; 线粒体; 心肌损伤中图分类号:R363文献标识码:A文章编号:100026834(2007)022******* 在一些损伤因素的作用下,细胞内的氧化代谢物增加,或细胞中抗氧化机制不足时,促使活性氧堆积,对细胞产生毒性,这种氧化和抗氧化的不平衡就是氧化应激[1]。
近年来的研究表明,氧化应激是多种不利因素,如运动、心理应激、缺血、缺氧等造成心肌细胞损伤的共同机制。
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3基金项目:国家自然科学基金资助课题(30570753)收稿日期:2006203231;修回日期:2006212228作者简介:任 哲(19792),女,内蒙古包头人,硕士在读,从事应激医学研究。
△通讯作者氧化应激心肌细胞prohibitin 表达与分布变化及其生物学意义3任 哲,钱令嘉△,杨志华(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津300050)摘要 目的:探讨prohibitin 在氧化应激心肌细胞中的表达与分布变化的特点及其在心肌细胞损伤中的意义。
方法:H 2O 2干预体外培养乳鼠心肌细胞,建立氧化应激心肌细胞损伤模型;采用生物化学法检测细胞培养液中LDH 活性及M TT 实验观察心肌细胞损伤程度;以Western 印迹法检测氧化应激时prohibitin 蛋白表达变化与分布变化;线粒体H +2A TPase 合成活力实验检测线粒体氧化磷酸化功能;流式细胞术检测线粒体跨膜电位。
结果:氧化应激组LDH 活性显著高于对照组,而细胞存活率低于对照组34151%～6515%;线粒体H +2A TPase 合成活力降低60%;氧化应激组线粒体跨膜电位显著低于对照组;心肌细胞prohibitin 表达水平在H 2O 2处理3h 出现升高然后回落到正常水平,线粒体prohibitin 表达水平高于对照组。
结论:氧化应激心肌细胞prohibitin 表达水平代偿性增加并有向线粒体移位的趋势,氧化应激导致心肌细胞线粒体功能障碍。
关键词: prohibitin ; 氧化应激; 线粒体; 心肌损伤中图分类号:R363文献标识码:A文章编号:100026834(2007)022******* 在一些损伤因素的作用下,细胞内的氧化代谢物增加,或细胞中抗氧化机制不足时,促使活性氧堆积,对细胞产生毒性,这种氧化和抗氧化的不平衡就是氧化应激[1]。
近年来的研究表明,氧化应激是多种不利因素,如运动、心理应激、缺血、缺氧等造成心肌细胞损伤的共同机制。
对氧化应激致心肌损伤发生的规律及其分子基础已进行了大量的研究,发现线粒体作为氧化应激的主要靶标,活性氧可引起线粒体结构和功能损伤,但对其损伤机制仍不明确。
本实验室前期对应激心肌细胞线粒体蛋白质组学研究,发现慢性束缚应激大鼠心肌细胞线粒体pro 2hibitin 表达水平明显升高[2]。
近来有研究发现,prohibitin 可以定位于线粒体并且有分子伴侣的功能[3,4],从而保持线粒体内膜的完整性。
但有关prohibitin 在氧化应激心肌细胞中的表达变化规律及其对线粒体的影响,目前尚未见报道。
本实验拟通过研究氧化应激时心肌细胞prohibitin 表达特点及其与线粒体损伤发生的相关性,为认识氧化应激致心肌细胞损伤机制提供实验依据。
1 材料与方法111 实验动物与试剂Wistar 乳鼠,体重10～14g ,40只(军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物房提供,Ⅱ级)。
乳酸脱氢酶(LDH )试剂盒购自中生北控公司。
prohibitin 单抗,购自Neomarkers 公司,Cox Ⅱ单抗,购自Molecular Probes 公司,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗,购自中杉公司。
Hoechst 33258、32(4,52二甲基噻唑22)22,52二苯基四氮唑嗅盐(M TT )、罗丹明123(Rh123)购自Sigma 公司。
112 氧化应激心肌细胞模型建立11211 心肌细胞培养 参照Paul Simpson 方法,开胸取乳鼠心脏,剪碎,用0125%胰酶消化法分离心肌细胞,细胞贴壁培养于10%胎牛血清M EM 培养液,37℃,5%CO 2培养箱。
选自律性搏动>100b ・min -1的心肌细胞用于实验。
11212 过氧化物诱导氧化应激模型建立 将培养3～4d 的心肌细胞培养液,换成含200μmol ・L -1H 2O 2,10%胎牛血清的M EM 培养液,37℃、5%CO 2培养箱,继续培养24h 。
113 细胞凋亡检测方法心肌细胞接种于011%多聚赖氨酸包被的盖玻片上,按照氧化应激模型建立方法处理细胞。
吸尽培养液,加入4%多聚甲醛固定液,固定30min ,去除固定液,PBS 晃动清洗5min ×3次。
加入浓度为1mg ・ml -1Hoechst33258染色液至终浓度1μg ・ml -1,染色15min ,PBS 晃动清洗5min ×3次,50%甘油封片,荧光倒置显微镜观察。
在显微镜同一视野下观察计数出现凋亡小体的细胞与全部细胞数目,两者进行比值计算,计算细胞凋亡率(%)。
114 乳酸脱氢酶(LD H)活性检测采用生物化学法,按照试剂盒要求测定。
1cm 光程比色杯中按要求加入工作液1ml,心肌细胞培养液200μl,混合均匀,37℃保温30s,读取初始吸光度,同时开始精确计时,1、2、3min时分别读取吸光度,确定每分钟吸光度变化(ΔA/min)。
LDH (U・L-1)=ΔA/min×8095。
115 心肌细胞活力测定用M TT比色法测定心肌细胞活力。
乳鼠心肌细胞接种于96孔板,根据实验目的确定培养时间长短,将原培养液换成无血清M EM培养基200μl/ well,每孔加M TT溶液(5mg・ml-1)20μl,37℃、5%CO2孵育4h,终止培养,小心吸取孔内培养液上清。
每孔加入150μl DMSO,振荡10min,使紫色结晶物充分溶解,酶联免疫测定仪在490nm波长处测定各孔的吸光度D(490)值。
116 心肌细胞线粒体提取收集心肌细胞,加入2ml预冷的分离介质(0125mol・L-1sucrose,0101mol・L-1Tris2HCl,015 mmol・L-1ED TA,011%BSA,p H714),手动匀浆。
采用差速离心法分离线粒体,即首先以700×g离心7min,弃沉淀,上清经10000×g离心10min,弃上清,用分离介质重悬沉淀,以同样高速离心1次,所得沉淀以悬浮介质(0125mol・L-1sucrose,0101mol ・L-1Tris2HCl,p H714)悬浮即制成线粒体悬液。
以上操作均在0～4℃进行。
蛋白定量采用Folin2酚法,线粒体用量根据其蛋白含量决定。
117 线粒体ATP合成速率测定采用荧光素-荧光素酶发光法[5],用20/20n 型发光仪测定。
反应温度25℃,在015ml反应体系中含有015mmol・L-1ED TA,10mmol・L-1hepes,5 mmol・L-1磷酸缓冲液,215mmol・L-1MgCl2,6 mmol・L-1malate,4μmol・L-1ADP。
记录以上体系中发光强度为本底,加入50μg线粒体后启动反应,记录发光强度。
以计算心肌细胞线粒体A TP合成速率:nmol・s-11mg-1pro表示118 心肌细胞线粒体跨膜电位检测利用流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化。
取各组心肌细胞用0125%胰酶消化后,加Rh123至终浓度25μmol・L-1,避光孵育30min,PBS洗两次,1 000r・min-1离心10min,流式细胞仪检测,激发波长2发射波长为488～525nm,每份样本获取1×104个细胞,Cell Quest软件分析细胞平均荧光强度。
119 蛋白质印迹试验检测氧化应激心肌细胞及线粒体中prohibitin表达变化蛋白样品采用Bradford法蛋白定量后,按照标准上样。
应用SDS2PA GE电泳后,转移至PVDF 膜。
含5%脱脂牛奶的PBS封闭1h后,加1∶400稀释的一抗,室温2h,PBS洗膜3次,加1∶5000稀释的二抗,室温45min,洗膜3次,鲁米诺化学发光法显色。
凝胶图像分析系统,扫描图像。
1110 统计分析实验数据用均数±标准差( x±s)表示,组间比较用t检验。
2 结果211 氧化应激致心肌细胞损伤H2O2处理组与对照组相比,细胞培养液中LDH值均显著升高(P<0105,图1),显示200μmol ・L-1H2O2对心肌细胞结构功能造成严重损伤; M TT实验显示H2O2处理组细胞活力显著低于对照组(P<0105,图2)。
通过Hoechst染色观察对细Fig11 E ffects of oxidative stress on LDH activity in medium of cardiomyocytes(U・L-1)( x±s,n=6)3P<0105vscontrolFig12 E ffect of oxidative stress on cardiomyocytes by M TT [D(490), x±s,n=6]3P<0105vs control胞凋亡形态学检测,正常对照组细胞核呈均匀的蓝色,染色质未出现凝集;H 2O 2处理组细胞核,表现出核染色质固缩集聚至核膜周边形成致密浓染,或新月形、呈块或碎裂状改变,呈现典型的细胞凋亡形态学变化(图3)。
细胞凋亡率与对照组相比有明显升高(P <0105,图4)。
Fig 13 Apoptosis of cardiomyocytes staining by Hoechst 33258(×400)A :Control group ;B :H 2O 2treat 6h ;C :H 2O 2treat 12h ;D :H 2O 2treat 24h.Arrow :Apoptosis cellFig 14 Apoptosis rate of cardiomyocytes treated by H 2O 2( x ±s ,n =6)3P <0105vs control212 细胞线粒体功能的变化对照组心肌细胞线粒体A TP 合成速率(nmol.s -11mg -1pro )为1567183±228133,H 2O 26h 、12h 、Fig 15 Change of A TP synthesis rate in mitochondria of ox 2idative stress injured cardiomyocytes ( x ±s ,n =6)3P <0105vs control24h 处理组心肌细胞线粒体A TP 合成速率分别下降为547155±92166,646179±147166和670116±122133,与对照组相比具有显著性差异(P <0105,图5)。
流式细胞术检测线粒体跨膜电位,发现H 2O 2作用6h 后,心肌细胞线粒体膜电位较对照组显著降低52%(P <0105,图6),并且在H 2O 2处理12h ,24h 后,线粒体膜电位仍然处于较低水平。