第五章 酶法分析技术(NO)
酶工程笔记和期末重点
第五章生物药物的酶学分析法酶学分析法原理：利用酶作为分析工具，测定样品中待测物质含量的方法称作酶法分析。
待测物质应是酶的底物，或者是酶的抑制剂、活化剂或酶的辅因子，否则不能采用酶法进行分析检查。
酶法分析可分为终点法和反应速度法。
（一）终点法，又称总变量法基本原理：利用酶的生物催化反应，使待测物质发生转化，然后测定产物产量或底物残余量，通过定量分析，从而明确待测物质的含量。
可以是单酶反应，也可以是几种酶构成的偶联酶反应。
在生物药物分析中，终点法是最常用的酶法分析。
终点法的条件必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品。
能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。
反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测定。
在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。
使用终点法应注意的问题1．酶的底物专一性：绝对专一性相对专一性立体异构专一性对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对专一性的酶。
若样品中存在除待测物质外其他可作为底物的物质时，可利用偶联酶的专一性进行区别定量分析。
2．反应的平衡对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不同的酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全。
若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测，不需进行任何处理。
若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反应不能完全，因而也就不能正常定量。
为了解决这一问题，通常采取以下一些措施：对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度对氧化还原之类与H＋有关的反应要选择适当的pH设法除去产物用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物3．反应液中的酶量对于一个具体的测定来说不同的酶反应有不同的Km值，通过米氏方程和均相溶液反应的动力学推算和分析，可以大致得到如下的结论：对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（u/ml）相当于Km（mmol）对于偶联反应的酶法分析，所加入的酶量如下：第一反应为酶量（u/ml）相当于Km1（mmol）第二反应为酶量（u/ml）相当于（1～2）×Km2（mmol）4.反应产物抑制若产物对反应本身有抑制作用，则就会妨碍反应进行，在这种情况下可采取将该产物除去或者和再生系统偶联的办法解决。
酶学分析技术范文
酶学分析技术范文酶学分析技术（Enzyme Assay Techniques）是一种用于测定生物样品中酶活性的方法。
酶是生物体内广泛存在的催化剂，可以加速化学反应的速率。
酶学分析技术在生物化学、医学、农业等领域都有重要的应用。
首先，酶学分析技术中最常用的方法之一是光度法。
光度法基于酶催化反应产生物质的颜色变化，并通过测量吸光度来确定酶活性的方法。
典型的酶学分析技术中，一种常用的测量指标是酶促反应后产生的NADH或NADPH的浓度。
通过比较反应前后的吸光度差异，可以计算出酶的催化速率。
其次，酶学分析技术中常用的另一种方法是荧光法。
荧光法基于酶催化反应后产生荧光分子的原理，通过测量荧光信号来确定酶活性的方法。
荧光法具有高灵敏度和高选择性的特点，适用于检测低浓度的酶活性。
常用的荧光剂包括荧光底物和荧光探针，可以通过酶催化反应后的荧光信号强度或颜色变化来确定酶活性。
此外，酶学分析技术中还有其他一些常用的方法，例如比色法、电化学法和质谱法等。
比色法通过测量反应物质的颜色变化来确定酶活性，常用的比色剂有碘化钠、邻联二硝基苯胺等。
电化学法基于酶催化反应过程中产生的电流变化来确定酶活性，常用的电极包括氧化还原电极、工作电极和对比电极等。
质谱法利用质谱仪分析酶催化反应产物的质荷比来确定酶活性，可以用于分析复杂的代谢途径和检测微量物质。
总的来说，酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中有着广泛的应用。
通过研究酶的活性和底物/产物之间的关系，可以了解酶的催化机制和生理功能。
酶学分析技术不仅可以用于检测酶的活性、底物和产物的含量，还可以用于筛选和优化酶的性质，例如通过变异酶突变、构建重组酶等方法。
此外，酶学分析技术还可以用于药物研发、生物工程和环境监测等领域。
总结起来，酶学分析技术是一种用于测定生物样品中酶活性的重要方法。
其原理和实验步骤多种多样，常用的方法包括光度法、荧光法、比色法、电化学法和质谱法等。
酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中具有广泛的应用，可以了解酶的催化机制、优化酶的性质，以及在药物研发、生物工程和环境监测等领域中的应用。
酶学分析技术(临床生物化学检验技术课件)
大于±0.10C。
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三、酶促反应的影响因素
4. PH值 ➢ 酶催化活性最高时反应体系的PH称为酶促反应的
最适PH。 ➢ 人体大多数酶的最适PH值为6.5~8之间， ➢ 测定酶活性时，应选用适宜的缓冲液以保持酶活
性的相对恒定。
式中v代表反应速率、Vmax代表最大反应速率、[S] 代表底物浓度、Km 为米氏常数。
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二、Km与Vmax
1. 米氏常数 ➢ 当v = ½ Vmax 时
Km=[S] ➢ 含义：反应速度为最
大反应速度一半时， 底物的浓度。
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二、Km与Vmax
2.Vmax的应用
➢ Vmax指酶完全被底物饱和时的反应速率，与酶的浓度呈 正比。
➢ 测定方法不同
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二、酶活性浓度测定方法
（一）定时法 ➢定时法又称为终点法（end-point assay）或两 点法（two-point assay），测定的是酶促反应 开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加 量。 ➢优点是比较简单 ➢缺点是难以确定反应时间段内酶促反应是否处 于线性期。
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14
Lineweaver-Burk 作图法
1 Km 1 1 v Vmax [S] V max
15
Lineweaver-Burk 作图法
➢以1/v为纵坐标，1/[S] 为横坐标作图可得一 直线。纵轴截距为 1/Vmas，斜率为 Km/Vmax，横轴截距 为-1/Km。根据 1/Vmax和-1/Km的数 值，即可求得Km与 Vmax。
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（二）连续监测法
➢ 连续监测法 ➢ 多时间点连 续监测
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酶法分析的基本原理与应用
酶法分析的基本原理与应用1. 酶法分析的基本原理酶法分析是一种通过酶的催化活性来测定样品中特定物质含量的方法。
它基于酶与底物之间的专一性结合和催化活性，利用底物的转化率与被测物质的含量成正比的原理进行分析。
其基本原理包括以下几个方面：•酶的选择性：酶具有高度的选择性，只能催化特定的底物转化为特定的产物。
通过选择适当的酶，可以实现对目标物质的特异性分析。
•底物浓度与酶催化率的线性关系：酶活性与底物浓度呈线性关系。
当底物浓度较低时，酶的催化率与底物浓度成正比；而当底物浓度较高时，酶的催化率可能会达到饱和状态。
•酶催化反应速率的测定：酶催化反应速率可以通过测定底物消失速度、产物生成速度或酶底物复合物的稳定性等指标来确定有关酶催化反应的动力学参数。
2. 酶法分析的应用酶法分析由于其高度的选择性、灵敏度和准确性，被广泛应用于许多生物医学、食品安全和环境监测领域。
以下是酶法分析的几个主要应用：2.1 生物医学领域酶法分析在生物医学领域中有着重要的应用。
它常被用于检测血液、尿液和其他生物体液中的生化指标，如葡萄糖、胆固醇、尿素等。
通过检测这些指标的变化，可以评估人体的健康状况和疾病风险。
2.2 食品安全领域酶法分析在食品安全领域中也有广泛的应用。
例如，通过检测食品中的转基因成分、防腐剂和重金属等有害物质，可以确保食品的质量和安全性。
同时，酶法分析还可以用于检测食品中的营养成分，以评估食品的营养价值。
2.3 环境监测领域在环境监测领域，酶法分析被广泛应用于水污染、空气污染和土壤污染等环境问题的监测。
通过测定水样、大气样和土壤中特定物质的含量，可以评估环境的质量和污染程度，并制定相应的环境保护措施。
2.4 药物研发与生产领域酶法分析在药物研发与生产领域中也有重要的应用。
它可以用来评估药物的纯度、活性和稳定性，以确保药物的质量和疗效。
同时，酶法分析还可以用于药物代谢及药代动力学的研究，以评估药物的吸收、分布、代谢和排泄等过程。
酶法分析的基本原理和应用
酶法分析的基本原理和应用1. 概述酶法分析是一种常用的生化分析方法，利用酶在特定条件下对物质的特异性催化作用进行定量测定。
它具有高灵敏度、高选择性和实时监测等优点，因此在医学、食品安全、环境监测等领域得到广泛的应用。
2. 基本原理酶法分析的基本原理是利用酶催化底物与受体结合生成产物的特性，通过测量产物的数量来间接测定样品中目标物质的含量。
其原理主要包括以下几个方面：2.1 酶的选择性不同酶对底物的特异性结合和催化能力不同，可以选择与目标物质发生特异性反应的酶作为分析方法的基础。
例如，葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖的氧化反应，可以用于测定葡萄糖的含量。
2.2 底物与酶的反应底物与酶结合后形成底物-酶复合物，酶催化底物发生特定的反应，生成产物。
产物的数量与底物的浓度成正比关系，可以通过测定产物的数量来间接测定底物的含量。
2.3 受体结合和信号转导酶催化底物生成产物后，产物会与受体结合，触发一系列的信号转导过程。
这些信号转导过程可以通过荧光、吸光度、电化学或其他方法进行检测和定量。
3. 应用领域酶法分析具有广泛的应用领域，以下是几个常见的应用领域：3.1 医学诊断酶法分析在医学诊断中起到关键的作用。
例如，测定血清中的肝功能指标酶（如谷丙转氨酶）可以评估肝功能的健康状况；测定血液中特定酶的活性可以用于早期诊断某些疾病。
3.2 食品安全酶法分析可以用于食品安全领域，检测食品中的重金属、农药残留、催化剂等有害物质的含量。
例如，测定牛奶中的抗生素残留可以保障食品的安全。
3.3 环境监测酶法分析可应用于环境监测，检测水体中的污染物、土壤中的重金属、空气中的有害气体等。
通过测定目标分子的含量，可以评估环境的污染程度。
3.4 生物工程酶法分析在生物工程中也有广泛的应用。
例如，测定酶的活性可以用于评估工程菌株的合成能力，优化反应条件，提高产物的产量和纯度。
4. 优缺点酶法分析作为一种生化分析方法，具有以下优点：•高灵敏度和高选择性，可以进行低浓度目标物质的检测。
酶分析法的原理及应用
酶分析法的原理及应用1. 概述酶分析法是一种常用的生物化学分析方法，通过利用酶对底物的特异性反应来定量分析样品中的物质含量。
本文将介绍酶分析法的原理及其在科学研究和生物医学领域中的应用。
2. 酶的特性与原理酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应速度，而不被消耗。
它们具有高度的专一性，只对特定的底物进行反应。
酶的反应速率与底物浓度呈正比关系，且受到温度和pH值等环境因素的影响。
通常，酶分析法的原理基于底物和酶的反应产生的物质的可测量性。
常见的酶分析方法包括酶反应动力学法、酶抑制法、酶联免疫吸附法等。
3. 酶分析方法的应用3.1 酶测定法在生物化学研究中的应用酶测定法在生物化学研究中具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：•酶活性测定：通过测量酶催化底物转化产物的含量变化，可以确定酶催化反应的速率和活性。
•代谢物检测：许多代谢产物可以通过特定的酶催化反应转化成可测量的产物，从而快速检测和定量代谢产物的含量。
•蛋白质定量：一些酶能够特异性催化蛋白质的降解，通过测量酶反应产生的物质的含量变化，可以间接地确定蛋白质的含量。
3.2 酶分析法在生物医学领域中的应用酶分析法在生物医学研究和临床诊断中也具有重要的应用价值。
以下是一些常见的应用领域：•生物标志物的检测：许多疾病都伴随特定的生物标志物的变化，通过测量酶反应产物的含量变化，可以快速检测和诊断疾病。
•药物测定：酶反应可用于药物的定量分析，例如测定血液中药物的浓度，以指导药物治疗。
•免疫学研究：酶与抗体结合的酶联免疫测定法是一种常用的免疫学研究方法，可以检测特定抗体的存在和浓度。
4. 酶分析法的优缺点酶分析法具有以下优点：•高灵敏度：由于酶对底物的专一性反应，酶分析法能够检测到非常低浓度的底物。
•高选择性：酶对于特定底物的反应非常特异，可以避免其他杂质的干扰。
•快速和简便：酶分析法通常具有简单的操作步骤和快速的反应速率。
然而，酶分析法也存在一些缺点：•受环境条件影响：酶的反应速率受到温度和pH值等环境因素的影响，需要严格控制实验条件。
《酶法分析》课件
酶的分类和特性
酶的分类
酶的种类：包括氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂合酶、异 构酶等
酶的活性：受温度、pH值、离 子强度等因素影响
酶的来源：包括动物、植物、 微生物等
酶的稳定性：受温度、pH值、 离子强度等因素影响
酶的特性
酶是一种生物催化剂，可以加速化 学反应的速度
酶的活性受温度、pH值、离子强 度等因素的影响
法
酶法分析的应 用领域广泛， 包括食品、医 药、环境等领
域
酶法分析的发 展趋势是向着 自动化、微型 化、高通量方
向发展
酶法分析的未 来前景广阔， 有望在更多领
域得到应用
对未来发展的展望
酶法分析技术在生物医学领域的应用前景 酶法分析技术在环境监测领域的应用前景 酶法分析技术在食品检测领域的应用前景 酶法分析技术在工业生产领域的应用前景
酶法分析在生物体内的应用实例：例如，酶法分析可以用于检测血液中的葡萄糖、血脂、胆固醇等 物质，也可以用于检测尿液中的蛋白质、尿素、肌酐等物质。
酶法分析在生物体内的发展趋势：随着生物技术的不断发展，酶法分析在生物体内的应用将会越来 越广泛，越来越深入，为疾病的诊断和治疗提供更加准确、快速的信息。
食品分析中的酶法分析
《酶法分析》PPT课件
汇报人：PPT
目录
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01
酶法分析的实验技术 和方法
04
酶法分析概述
02
酶的分类和特性
03
酶法分析的应用实例
05
酶法分析的优缺点和 未来发展前景
06
添加章节标题
酶法分析概述
酶法分析的定义和原理
酶法分析：利用酶的生物催化作用，对样品进行定性、定量分析的方法
酶法分析ppt课件
胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸 的羧基组成的肽键，酰胺键及酯键。其水解速率为酯键＞酰 胺键＞肽键。也可水解间位经基苯甲酸酶及脂肪酸酶，以及 变性蛋白如酶蛋白、血红蛋白。
可选用酪蛋白或含有碱性氨基酸的酰胺、酶等作为底物。 目前均采用专属性较高的
例如：过氧化氢分解
2H2O2
2H2O + O2
Fe3+ 催化，效率为6×104 mol/mol. S 过氧化氢酶催化，效率为6 × 106 mol/mol.S
专一性
即对底物的选择性或特异性。一种酶只催化一种或一类
底物转变成相应的产物。
4
酶容易变性
这是酶的化学本质（蛋白质）所决定的。
酶的可调节性 抑制和激活（activation and inhibition ） 反馈控制(feed back) 酶原激活(activation of proenzyme) 变构酶(allosteric enzyme) 化学修饰(chemical modification ) 多酶复合体(multienzyme complex)
（3）被测物为活化剂：当其他条件最适且一定时，活化剂在
低浓度范围内，酶反应速度随活化剂浓度增大而升高，并在
一定范围内具有线性比例关系。但是用动力学方法测定时有
两个问题应注意：①活化剂浓度超过一定水平后常导致抑制；
②对于某一种酶，相似的离子往往也能表现出活化作用，因
此测定不专一，易受到干扰。
17
（4）被测物是抑制剂： 不可逆抑制剂对酶反应产生的抑制程度，随抑制剂浓度呈
乳酸 乳酸脱氢酶 丙酮酸
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反应液（酶量，第一反应1km1,指示酶1~2个km指 ） 反应产物的抑制（反应物除去；再生系统偶联)
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酶法分析技术
酶法分析技术的概念
酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶
促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利
用酶促反应测定酶活性的一类方法。
以酶为分析对象的分析方法
酶法 ——酶活力测定法
以酶为分析工具或分析试剂的分析方法 ——酶分析法
原理和方法：以酶能专一而高效地催化某些化学反应为 基础，通过对酶反应速度的测定或生成物等浓度的测定 而检测相应物质的含量。
标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固
定时间法(fixed assay)。
速率法和平衡法测定比较
区别 速率法 平衡法
测定时间 检测速度 检测成本 产物堆积 样品色原 测定仪器
较短 较快 酶用量小，成本低 影响较小 影响较小 要求电噪声小，A读准到 0.0001，温差<0.1%
较长 较慢 酶用量大，成本高 影响较大 影响较大 要求不严
二、终点法的种类
单酶反应定量法
偶联酶反应定量法
（1 ） 单酶反应定量法 单酶反应只需要一种催化酶，如下式所示
用这种反应作底物定量时，可以测定底物 的减少量，也可以测定产物的增加量。对 含有辅酶的酶，测定辅酶的变化量也是有 效的方法。
1. 底物减少量的测定
在待测物质为底物的酶反应中，如果底物能
(1)
终点法基本理论
终点法又称为总变化量法，先借助酶反应(单独的反应
或几种酶构成的稠联酶反应)使被测物质定量地进行转变，
在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质(第二底物) 等的变化量，因此称为终点测定法(end-point method)。
终点法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。
测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型 NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处 吸光度的下降来计算被测物的浓度。
脱氢酶指示系统
血清葡萄糖己糖激酶法测定
Glu + ATP
G-6-P +
G-6-P+ADP
P-6-GA + NADPH + H+
NADP+
草酸 甲酸 + CO2
瓦式呼吸计测定生成的CO2的量
(2)
酶偶联法
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分， 将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到 检测目的的方法称酶促偶联法。 A
A B C
Ea Ei
最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
BOD
胆绿素+ H2O
胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在 450nm处测定吸光度下降
2. 产物增加量的测定 在被测物作为底物的酶促反应中，如果底物 基本上都能转变成为产物，而产物又具有可 专一性进行定量测定的物质，那么，根据产 物的增加量就能检测底物的量。
草酸的测定
转换反应 循环反应 指示反应
产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
甘油浓度测定
ATP 甘油
GK
ADP
NAD+
G-3-PDH GPO
NADH+H+ 磷酸二羟丙酮 H2O2
甘油-3-磷酸 O2
通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复
循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环 不断递增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计 的量决定于t 和每min循环次数。
脱氢酶指示系统
氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ氢酶指示系统
以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶 Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型
NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被
系统。
(2)
速率法基本理论
速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测
定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的
消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
(2)
速率法基本理论
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用
产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质
的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定 于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两 种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的 Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。
接近完全地转化为产物(当有99％转化成产物 时，则认为反应完全)，而且底物又具有某种 特征性质(如具有特殊的吸收光谱)时，就有 可能直接测定底物的减少量而定量待测物。
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定 尿酸 + O2 + H2O
UAO
尿囊素 + CO2 + H2O2
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定 胆红素 + O2
另外，平衡法的试剂酶活性下降对测定影响远没有速率 法明显，仅使达到平衡所需时间延长，检测范围变窄。但对 速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。 由于以上种种原因，代谢物酶法分析大多选择平衡法。
返回章目录
(3)
酶循环法
利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促
反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应
底物循环－脱氢酶－辅酶系统
血淸胆汁酸测定
Thio-NAD+
3α -HSD
Thio-NADH(黄色) 循环
3α -HSD
胆汁酸 NAD+
3-酮类固醇 NADH
胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代
还原型辅酶Ⅰ（黄色），控制好条件，反应速度与代测 物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。
G 6 PD
指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定 340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比
脱氢酶指示系统
血清尿素测定 尿素 + H2O
尿素酶
2NH3 + CO2
NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+
谷氨酸 + H2O + NAD+
2
酶法分析的方法
酶法分析主要优点
酶作用的特异性高
试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品 对环境的污染；
酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。
酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范 围等方面都优于传统的化学法
1
酶法分析的理论基础
终点法 酶法分析 反应速率法
可以看出整个反应过程，可以大致分为二个时期。一开始为 动态期，化学反应按一定速度进行，反应物浓度随时间而变化， 且变化程度不断变小，到一定时间，化学反应或者达到平衡，或 者反应达到终点，此时反应速度为零，反应物浓度不变。按所用 方法所测定的反应是在达到平衡前还是平衡后。分别命名为动态 法或平衡法/终点法。
测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正
比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定
脱氢酶指示系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。
体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁
酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及
氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示