酶循环法及其在酶法分析中的应
浅析现代化生物工程中酶技术的研究与应用
浅析现代化生物工程中酶技术的研究与应用人类生命物体的基本特征之一就是不断地进行新陈代谢，新陈代谢是由许多有机化学反应组成的，如动植物的消化反应和各种物质的合成与分解等。
这些反应在体内进行地很快，原因是有生命的动植物体内存在着的一种生物催化剂一酶的作用。
酶制剂是在1833年由法国化学家佩思和珀索发现的，他们从麦芽提取液的酒精沉淀物中得到一种对热不稳定，而且能加速淀粉转变成糖的物质，称之为淀粉酶制剂。
1926年隆姆首次从刀豆中提纯得到脲酶结晶。
生物化工行业经过70多年的发展，对酶的分子结构，酶作用的机理及酶系统的自我调节已形成了一个完整的工业体系。
整个行业也出现了一些新的发展态势，在阐明生命活动的规律，探索工业、农业、畜牧业、医药及对疾病的诊断、治疗均有重要的意义。
新陈代谢包含了一些重要的有机化学，对于生命周期的循环起着重要的保障作用。
作为常见的生物催化剂，酶的存在有利于加快新陈代谢速度，从根本上保证了相关化学反应的持续进行。
最初的淀粉酶主要是从麦芽提取液中得到的。
此后随着现代生物工程技术的不断发展，研究工作者对于各种生物酶的结构和特性有了更加深入的了解，为这些酶应用范围的扩大奠定了坚实的基础。
1.1生物酶的主要特点生物酶本质上是一种蛋白质，主要产生于某些机体活细胞，在实际的应用中具有良好的催化效果。
常见的酶促反应主要是指生物酶参与的反应，对相关物质代谢速度的加快带来了一定的保障作用。
生物酶的主要特点包括:(1)高效的催化效率。
相对而言，酶的催化效率远远高于一般的催化剂，最大为1013倍;(2)稳定性差。
作为机体活细胞的蛋白质，生物酶很容易受到各种存在因素的影响，导致蛋白质现象的出现，从而使酶失去了活性。
这些内容客观地反映了生物酶稳定性差的特性;(3)专一性非常强。
一般的催化剂在实际的应用中可能会有多种选择。
而生物酶只针对一种化合物发挥自身的催化作用，具有高度的专一性;(4)酶活力可以随时调节。
蛋白酶在存在的过程中有着良好的特性，不同类型蛋白酶通过一定的机制实现彼此间的有效结合，才能具有更好的催化活力。
同型半胱氨酸检测试剂盒(酶循环法)简化说明书
R1+S+R2 孵育时间 150sec
比色杯光径
1.0cm
R1+S+R2 反应时间 1-3min
操作步骤：
标本
10
试剂 1（R1）
180
混匀，置 37℃孵育 3-5 分钟
试剂 2（R1）
50
混匀，置 37℃孵育 150 秒，在测定波长下检测 1-3 分钟吸光度变化，计算△A/min
全自动生化分析仪自身自带的程序参数输入法，上述的基本参数需要结合全自动分析仪自有的程
同型半胱氨酸-甲基转移酶催化下与 S-腺苷同型半胱氨酸（SAM）反应生成甲硫氨酸和 S-腺苷同 型半胱氨酸（SAH）。SAH 被 SHA-水解酶水解形成腺苷和 Hcy。生成的 Hcy 进入 Hcy-甲基转移 酶催化的催化反应，形成循环反应。这个循环反应导致了检测信号的明显放大。形成的腺苷立即 脱氢转化为次黄苷和氨，氨进一步在谷氨酸脱氢酶催化下和 NADH 反应，将 NADH 转化变为 NAD。在 340.nm 处检测 NADH 减少造成的吸光度下降量与样品同中性半胱氨酸的浓度成比例。
高蛋白饮食，可导致 HCY 升高。血清样本检测结果常比抗凝血浆检测结果高 5-10%。
检测方法：
1、试剂配制：本试剂为液体，可直接使用。
2、测定条件：
主波长
340nm
标本
10 uL
副波长
405nm
R1
180 uL
反应温度
37℃
R2
50 uL
反应方向
向下
R1+S 孵育时间
3-5min
反应方法
两点速率法
检测意义： 本试剂通过测定人血清同型半胱氨酸的浓度，辅助相关疾病的诊断。同型半胱氨酸主要作为
电化学分析在生物科学中的应用
电化学分析在生物科学中的应用电化学分析是指应用电化学原理和技术对各种物质进行定性、定量分析的方法。
在生物科学领域，电化学分析已经成为了不可或缺的分析手段之一。
在此，我们将探讨电化学分析在生物科学中的应用。
一、电位滴定法电位滴定法是电化学分析中最常用的一种方法。
该方法利用电极电位变化来测量被测物质的浓度和化学特性。
在生物科学中，电位滴定法常常用于测定血液pH值及肌酸酐和肌酸含量等。
此外，该方法也可以用于分析脂质代谢物的含量，并且精度较高，操作简单方便。
二、循环伏安法循环伏安法是一种测定电极反应动力学和溶液中电极过程的电化学分析方法。
此方法在生化学领域中广泛应用，例如在酶学研究中，循环伏安法可以用于确定电极反应机理、测定酶催化反应中的电化学参数以及测定酶活性等。
此外，在蛋白质电化学研究中，也可以利用循环伏安法测定蛋白质的电化学性质和氧化还原峰等。
三、电导法电导法是通过导电介质中电流的流动情况来对其进行分析的方法。
在生物科学领域，电导法广泛应用于红细胞、血浆、组织液和细胞液中电解质的分析。
此外，电导法还可以用于测定酸碱平衡和生物体内的水分含量等。
四、计时安培法计时安培法是测定电解液中溶质或痕量元素含量的一种电化学分析方法。
该方法需使用特殊电极，在恒定电流下进行测量，可以精准测定多种元素的含量，包括金属元素、溶解态无机阴离子等。
在生物科学研究中，计时安培法可以用于检测生物体内的微量元素的含量及其代谢过程中的变化，从而对疾病诊断和治疗提供重要参考。
五、微量元素测试法微量元素测试法是指对生物体内微量元素进行定量测定的方法。
微量元素在生物体内的含量虽然很少，但对生命活动具有重要作用。
在生物科学研究中，微量元素测试法可以用于研究不同生物体内微量元素含量的差异，探索微量元素参与生命活动的作用机理，以及为生命科学研究提供更深入的数据支持。
总之，电化学分析在生物科学中具有广泛的应用前景，可以用于测定生命体内的各种生物活性物质及其化学组成、化学性质，为生命科学研究提供有力的支持和帮助。
循环酶法检测血清同型半胱氨酸方法学评价及其在肿瘤诊断中的应用
Ｘ Ｐ检 测 系统 比 较 ， Ｈｃ ｙ 检 测 结 果 相 关 性 良好 （ ｒ 一０ ． ９ ７ ０ ８ ， 一 ４ ０ ） ， 两 种 检 测 方 法 检 测 结 果 均 值 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 ＜ Ｐ ＞ ０ ． ０ ５ ） ； 平均回收率为 ９ ５ ． ２ ～１ ０ ３ ． １ ； 肿 瘤 患 者 血 清 Ｈｃ ｙ水 平 较 健 康 对 照 组 明 显 升 高 ， 差异有统计学意义（ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） 。
ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｖ ａ ｌ ｕ ｅ ｏ ｆ Ｈｃ ｙ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔｈ ｅ ｐ ｒ ｅ ｃ ｉ ｓ ｉ ｏ ｎ， ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｉ ｓ ｏ ｎ ｔ ｅ ｓ ｔ ， ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｙ
应 用 美 国， ６床 实验 室标 准 化 协 会 的标 准化 评 价 方 案 评 价 循 环 酶 法 测 定 血 清 Ｈｃ １ ｙ的 精 密 度 、 比对试验 、 回收试 验、 线性 范 围
等 。 同 时检 测 ８ ０ ６例 肿 瘤 患者 ， ６ ７例 健 康 体 检 者 （ 健 康对照组） 血 清 Ｈｅ ｙ水 平 。墩 据 分 析 采 用 方 差 分 析 、 两独 立 样 本 检 验 、 相 关 性 分 析 等 。 结 果 精 密 度 ： 循 环 酶 法 测 定 血 清 Ｈｃ ｙ低 、 高 水 平 的 批 内 变 异 系数 （ Ｃ Ｖ ） 分别为 ２ ． ６ ９ 、 ３ ． ３ ５ ， 日 间 ＣＶ ， 分 别 为
同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环法)的检测评价
同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环法)的检测评价郭芳; 应英; 李梅; 于丽丽【期刊名称】《《中国医疗器械信息》》【年(卷),期】2019(025)017【总页数】3页(P13-14,23)【关键词】同型半胱氨酸; 试剂盒; 酶循环法; 检测【作者】郭芳; 应英; 李梅; 于丽丽【作者单位】辽宁省医疗器械检验检测院辽宁沈阳 110179【正文语种】中文【中图分类】TH776同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是蛋氨酸的中间代谢产物，其依附于血管内壁[1]。
近些年的研究发现，Hcy与动脉粥样硬化和心血管疾病的危险性成正相关，被认为是动脉粥样硬化导致的心血管疾病最显著的独立危险因素，同时，Hcy 水平升高将刺激血管壁并可能引起动脉血管损伤，导致形成炎症和管壁斑块[2]。
目前国内外普遍将Hcy作为常规检测项目，用于判断动脉粥样硬化和心脑血管疾病的危险性[3]。
Hcy的检测方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等。
近年来，由于具有快速、简便、灵敏度高、自动化程度高等特点，酶循环法发展迅速，已逐渐成为各级各类实验室常用的检测方法[4]。
本文按照YY/T 1258-2015《同型半胱氨酸测定试剂（盒）（酶循环法）》和企业产品技术要求，对同型半胱氨酸测定试剂盒（酶循环法）进行检测评价，对检测过程中遇到的问题进行分析讨论。
1.材料与方法1.1 仪器与材料日立7100全自动生化分析仪；同型半胱氨酸测定试剂盒（酶循环法）（国内某生物科技公司）；质控品：心肌多项标志物检测用质控品（RANDOX，货号：CQ3100，批号：453728）。
1.2 方法生化分析仪基本参数设置见表1。
校准程序：使用两个水平校准品，进行2点校准，采用线性校准模式。
表1. 生化分析仪基本参数设置测定模式反应方向测定温度波长反应时间样本量试剂R1 试剂R2速率法负反应37°C 340nm 10min 13μL 240μL 60μL表2. Hcy测定试剂盒的线性范围检测结果理论值(μmol/L) 在效期批过期批实测均值(μmol/L) 绝对偏差(μmol/L) 相对偏差(%) 实测均值(μmol/L) 绝对偏差μmol/L 相对偏差(%)4.2 3.9 -0.2 - 4.5 -0.1 -12.1 12.1 - 0.4 12.3 - -1.020.0 20.1 - 0.7 20.2 - -0.627.8 28.0 - 0.5 28.8 - 2.035.7 35.8 - 0.2 36.3 - 0.443.6 43.4 - -0.5 43.7 - -0.9表3. Hcy测定试剂盒的测量精密度检测结果批间差均值(μmol/L) 标准差(μmol/L) 变异系数(CV) 均值(μmol/L) 批间相对极差在效期批水平1 9.5 0.21 2.2% 9.5 2.8%水平2 18.9 0.43 2.3% - -过期批水平1 9.7 0.28 2.8% - -水平2 19.5 0.16 0.8% - -批次样本重复性表4. Hcy测定试剂盒的准确度检测结果批次样本浓度(μmol/L) 样本体积(μL) 纯品浓度(μmol/L) 纯品体积(μL) 实测均值(μmol/L) 回收率在效期批 7.4 0.8 140.08 7.9 92.1%7.4 0.8 28 0.08 9.2 98.5%过期批 7.4 0.8 14 0.08 8.4 100.2%7.40.8 28 0.08 9.9 109.0%2.结果2.1 外观试剂R1为无色澄清液体，R2为浅黄色澄清液体，无沉淀及絮状悬浮物。
10生物技术蛋白质与酶工程复习题与答案
一. 名词解释1．生物酶工程又称高级酶工程它是酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。
2．蛋白质工程蛋白质工程就是运用蛋白质结构功能和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质。
3.多核糖体把细胞放在极其温和的条件下处理，就能得到几个到几十个核糖体在一条mRNA上结合起来的形态4.固定化酶水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。
在催化反应中以固相状态作用于底物5.酶反应器以酶或固定化酶为催化剂进行酶促反应的装置。
6．酶工程又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术7.生物传感器对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。
8. motif (模体)指的是蛋白质分子结构中介于二级结构与三级结构之间的一个结构层次，又称超二级结构9. domain功能域生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域,特别指蛋白质中这样的区域10.PDB蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）是一个生物大分子，11. DNA shuffling体外同源重组技术。
通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。
12.生物催化剂是指生物反指应过程中起催化作用的游离或固定化细胞各游离或固定化酶的总称13.必需基团有的基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，所以常将活性部位的功能基团统称为必需基团(essential group)14.活性中心。
酶的活性中心是酶与底物结合并发挥其催化作用的部位。
15.有性PCR dna改组16.DNA改组通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。
17.免疫传感器偶联抗原/抗体分子的生物敏感膜与信号转换器组成的，基于抗原抗体特异性免疫反应的一种生物传感器。
18.易错PCR是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。
酶法
2014-7-16
第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
酶循环法
体液中某些微量物质的准确测定 利用酶的底物特异性来放大靶物质来 测定 传统的酶反应只能按靶物质的量生成 相应的产物量 酶循环法则可在一定的反应时间内通 过靶物质的重复反应来增加产物的量 而提高灵敏度
2014-7-16 第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
测定方法
取样测定法
在酶反应开始后不同时间，从 反应系统中取出一定量的反应液 基于底物和产物在物 并停止其反应，再根据产物和底 理化学性质上的不同， 物的性质差别，选用适当的检测 在反应过程中对反应系 方法进行定量分析，求得单位时 统进行直接连续检测 间内酶促反应的变化量 准确性和测定效率都 添加酶变性剂 ：5％的三氯醋 较好 酸、 3％的高氯酸或其它酸、碱、 醇类
⑤不需要考虑反 应是否进行完全
2014-7-16
第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
动力学分析法
注意问题---被测物是底物：[S]＜Km ，v=k＊[S] 被测物是辅酶：另一底物浓度足够高 被测物是活化剂：要求低浓度 被测物是抑制剂
不可逆：线性关系，由绝对量决定 可逆：低浓度
2014-7-16 第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
酶法测定血清磷脂
三联酶终点法 利用磷脂酶、胆碱氧化酶、过氧化物 酶，水解，测定产物吸光度 测定
2014-7-16
第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
酶传感器
将酶法分析与固定化酶以及自动化测 定技术结合在一起，构建成酶传感器 酶传感器一般由固定化酶和电化学装 置（电极）组合构建而成，又称为酶 电极 葡萄糖酶传感器最为成熟
第四章 酶法分析
优点：
不需要特殊复杂的设备和仪器 灵敏度高 重复性好 对健康无害
应用前景
食品卫生 环境污染生化 指标 临床医学
“瘦肉精”快速检测新技术 ——竞争酶标免疫法
“瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的 作用于β —肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气 肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的5—10倍时， 可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦 肉精”。
应用时应考虑两个问题，即工具酶的用 量与反应的平衡点。
终点法要操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反 应于1级反应水平。因为这样可以使反应迅速 达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反 应；减少工具酶的用员。 (2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物 反应的另一底物应具有足够高的浓度。 (3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到 终点。
底物？ pH？ 温度？ 样品？
二、测定中应注意的问题 1.初速度
底物浓度对酶速的影响
浓度选择： a） [s]>=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。
作用于待测酶产物的其它酶；
（如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。
三、酶标免疫分析法
Enzyme Immunoassay (EIA)
在70年代初，从放射免疫分析发展起 来的一种称为“酶标免疫”的分析方法， 它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能 力有机地结合在一起，建立的一种高度特 异、灵敏的分析方法。
放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是用放射 性同位素标记抗原Ag*，该抗原与未标记抗原Ag竞 争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应 生成的Ag*-Ab复合物与Ag的量呈负相关。Ag*-Ab的 生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知 浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度， 这种分析方法称为放射免疫分析。
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酶循环法及其在酶法分析中的应用
杨昌国，许叶（宁波市医学科学研究所，浙江宁波315010）
关键词：酶法分析；酶循环法
中图分类号：R461.1 文献标识码：A
由于酶法测定的特异性好，检测简便，反应温和，无污染，且灵敏度较高(10～100umol/L)，已能满足体液中大部分物质的测定，因此在临床化学测定中已广为应用。
随着临床化学的发展，体液中某些微量物质的准确测定逐渐显得重要。
酶循环法是利用酶的底物特异性来放大靶物质（被测物）的测定方法。
此法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或队靶物质的提取，而且该法不需要专门的设备，是一种前景广阔的测定技术。
日本旭化成（Asahi Chemical ）公司发展了这一技术，笔者参考旭化成公司的有关资料，将这一技术介绍给国内的同行。
1 酶循环法的原理
物质A 在酶a 和底物a(Sa)的存在下转化为物质B ，同时生成产物a(Pa)；这物质B 又在酶b(Eb)和底物b(Sb)的存在下转化为物质A ，同时生成产物b(Pb)。
上述反应每循环一次，将消耗与物质A 等量的Sa 和Sb ，同时生成等当量的Pa 和Pb 。
因此在一定时间内，循环反应的次数亦就是Sa 和Sb 消耗或Pa 和Pb 生成相当于物质A(或物质B)的倍数，通过检测Sa 或Sb 的减少或Pa 或Pb 的生成就可以提供检测物质A(或物质
B)的n 倍灵敏度。
见图1。
底物a(Sa) 产物a(Pa)
酶a(Ea)
物质A 物质B
酶b(Eb)
产物b(Pb) 底物b(Sb)
图1 酶循环法原理
1.1 条件
1.1.1 物质A 和B 的浓度与酶a 和酶b 对底物Sa 和Sb 的Km 值相比较，应相当小，即[A]或[B]《K m Sa (或
K m Sa )。
1.1.2 酶a 和酶b 对底物Sa 和Sb 的Km 值应相当小，对底物应有高亲和力。
1.2 原理 米氏方程 v ＝V •[S]/( [S]+Km)，v ＝K •[S]，(K ＝V /Km )。
当t ＝0、[A]=[A 0]、[B]=0时，[A]＋[B A 0]；当t ≥0并假设反应已达到平衡状态，那么，Ea 的速度是Vb ＝Kb[A]。
Eb 的速度是Vb ＝Kb[B]。
在平衡状态时，va ＝vb 因此，[A]:[B]=Kb:Ka 。
循环反应速度vc ＝va ＝vb(固定的)，假设vc ＝Kc[A 0](Kc=循环速率常数)，那么从Kc ＝Ka •Kb/(Ka+Kb)推导，如果Ka+Kb ＝常数，当Ka ＝Kb 时，Kc 是最大的。
1.3 测定灵敏度 [][][]000
t A Kc Vcdt Pb Pa t ===⎰。
2
酶循环反应的灵敏度 可通过产物的循环常数(Kc)和反应时间(t)来确定；Kc 又可通过两种酶的量来确定；酶量又取决于酶的特异活性和Km 值，循环反应是在相同的条件(如温度、离子强度等)下进行，两种酶的反应常数亦相同(由于Va/Kma=Vb/Kmb ，因此Kc ＝Ka ＝Kb)。
既然循环反应的灵敏度可通过Kc ×t(min)来确定，故可用调整加入酶量或反应时间来随意控制。
选择Km 小的酶，用较小的酶就能得到较高的灵敏度。
3 循环反应的类型
Ka
循环 Kb
按反应中使用的酶可分四种类型：
3.1 方法A 底物循环，氧化酶和脱氢酶系统。
氧化酶对靶物质氧化，脱氢酶又把氧化态的靶物质转化成
还原态。
靶物质和它的氧化产物作为底物被循环，速率可达50～300次/分。
举例：溶血卵磷脂(lysolrcithin)(又称溶血磷脂酰胆碱，lysophosphatidyl choline)，是磷脂的一种，它随氧化型LDL 和β－VLDL 水平增高而增高，后两者已确认与动脉粥样硬化的发生和发展有关。
测定原理见图2。
预处理反应：
＋甘油醛甘油＋222O O H GO −−→−
测定反应：
(1)
脂肪酸溶血卵磷脂+−−→−GPC LYPL (2) 胆碱+−−→−+P G O H GPC GPCP 32
(3) O2 H2O2 醌亚胺
GPO
G3P DHAP
G3PDH
NAD NADH
12α-HSD
胆碱 酮类胆酸
GO ：甘油氧化酶 LYPL ：溶血磷脂酶
GPC ：甘油磷脂酰胆碱 GPCP ：磷酸二酯酶
G3P ：3－磷酸甘油 GPO ：甘油磷酸氧化酶
DHAP ：磷酸二羟丙酮 G3PDH ：3－磷酸甘油脱氢酶
12α-HSD ：12α-羟类固醇脱氢酶 DAOS ：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧苯胺 图2 溶血卵磷脂酶循环法原理
3.2 方法B 底物循环，脱氢酶和辅酶系统。
靶物质和它的氧化产物作为底物被循环，仅用一种酶和两种辅
酶(巯基NAD 和NADH)。
在410nm 测定巯基NADH 的增高速率，循环速率约100次/分。
举例：胆汁酸测定，原理见图3。
巯基-NAD 巯基-NADH(415nm 测定)
3α-HSD
胆汁酸 酮类胆汁酸
3α-HSD
循环 DAOS
4-AAP
DAOS （比色测定）
循环
NAD NADH
3α-HSD ：3α-羟类固醇脱氢酶
图3 胆汁酸酶循环法测定原理
3.3 方法C 辅酶循环，双脱氢酶系统。
靶物质被转化为辅酶(NAD)，使用两种脱氢酶使NAD-NADH 间循
环。
本系统灵敏度很高，循环速率至少可达1000次/分。
举例：NH3测定，原理见图4。
NH3
三磷酸腺苷＋脱氨-NAD
单磷酸腺苷＋PPi
D-葡萄糖 NAD 甲月簪染料(比色测定)
葡萄糖
脱氢酶 循环 黄递酶
D-葡萄糖酸-δ-内酯 NADH 四唑盐
图4 NH3 酶循环法测定原理
利用这一反应原理，增加前反应亦可测定尿素和肌酐。
尿素前反应：
2322CO NH O H Urea Urease +−−→−＋
肌酐前反应：
32N NH O H 甲基乙丙酰脲＋肌酐＋肌酐脱氨基酶-−−−−→−
3.4 方法D 氨循环，NAD 合成酶-脱氢酶系统。
靶物质NH3被转化成NAD ，再通过亮氨酸脱氢酶使L-亮
氨酸转变成氧化异己酸和NH 4+，NH 4+又重复反应，原理见图5。
ATP AMP+PPi
NAD 合成酶
NH 4++脱氨-NAD NAD +
Mg 2+
亮氨酸
亮氨酸脱氢酶
NH 4+＋氧化异乙酸 NADH
4 酶循环法的特征和应用前景
传统的酶反应只能按靶物质的量生成相应的产物量，而酶循环法则可在一定的反应时间内通过靶物质的重复反应来增加产物的量。
因此，可通过延长反应时间和/或增加酶的用量来加速循环以增加循环次数(循环速率)来提高灵敏度。
选择用高循环速率的酶和合适的循环方法可使循环速率达到50～1000次/分。
另外通过使用酶的特殊底物(如巯基-NAD)可简化反应体系，亦可偶联呈色反应(如四氮唑染料或Trinder 反应)使其成为可见光谱测定。
本法还可与荧光和发光分析结合使灵敏度更高。
由于本法是一个比色测定，它可能被用作EIA 检测方法，消除测定污染的存在。
5 酶循环法推广应用尚需克服的难题
由于酶循环法具有诸多优越性，是一种有前途的测定方法，但目前要推广使用尚有一些问题需要解
决：①因此法工具酶的用量是普通酶法的10到数10倍，费用较高。
②酶的特殊底物硫代-NAD的价格亦很高。
③体液某些微量物质的测定尚缺乏工具酶。
因此酶循环法的推广应用还有待工具酶和有关原材料的大幅度降价，以及新工具酶的开发。
尽管如此，这一技术已为临床化学分析开辟了新天地，为体液中微量物质的准确测定提出了美好的前景。