第05章 代谢物酶法分析技术
微生物学第五章微生物的代谢
通过改变细胞膜的通透性，控制代谢底物和产物的进出，从而调 节代谢过程。
微生物代谢的基因调控
01
原核生物的基因调 控
通过操纵子模型实现基因表达的 调控，包括正调控和负调控两种 方式。
02
真核生物的基因调 控
通过转录因子和顺式作用元件的 相互作用，实现基因表达的精确 调控。
03
基因表达的诱导和 阻遏
03 氮的转化代谢
微生物还可以通过氮的转化代谢将一种含氮化合 物转化成另一种含氮化合物，如硝酸盐还原成氨 的过程。
04Βιβλιοθήκη 微生物代谢的调节与控制代谢调节的方式与机制
酶活性的调节
通过改变酶的构象或修饰酶活性中心，从而调节代谢途径中关键 酶的活性。
代谢物浓度的调节
代谢物浓度的变化可以影响酶的活性，从而调节代谢速率。
用、液相色谱-质谱联用等。
核磁共振法
利用核磁共振技术对微生物代 谢产物进行结构和构象分析， 可以获得代谢产物的详细化学
信息。
生物信息学分析
利用生物信息学方法对微生物 代谢组学数据进行处理和分析， 包括代谢途径分析、代谢网络 构建、代谢物鉴定和代谢调控 研究等。
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微生物代谢产物的生物活性与应用
抗生素
由微生物代谢产生的具有抗菌活 性的化合物，用于治疗细菌感染。
酶
微生物代谢产生的生物催化剂，广 泛应用于食品、医药、化工等领域。
激素
某些微生物代谢产物具有激素活性， 可用于调节动植物生长发育。
微生物代谢在环境保护和能源领域的应用
污水处理
利用微生物代谢降解污水中的有机污染物，净化水质。
02
微生物的能量代谢
能量代谢的基本过程
酶学分析技术
线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（ 线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受 相对于时间（min） 的程度 。
前半段△A/min－后半段△A/min］ ［（前半段 A/min＋后半段△A/min）/2］ 100％ 前半段△ 线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％
17
（二）Km的含义与意义 的含义与意义
的含义: 1．Km的含义:
V max =[S]时 可见K 值等于反应速率达到最大反应速率V 当Km=[S]时， v = ，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax 2 一半时的底物浓度。 一半时的底物浓度。
2．Km的意义 Km的意义
Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 是酶的一个特征性常数 ），Km 反映酶对底物亲和力 酶对底物亲和力的大小 反映酶对底物亲和力的大小 最适底物或天然底物 选择酶的最适底物 选择酶的最适底物或天然底物 计算不同底物浓度时的反应程度 计算不同底物浓度时的反应程度 鉴别酶的种类 鉴别酶的种类 判断可逆反应的速率 判断可逆反应的速率 判断酶偶联反应的限速反应 判断酶偶联反应的限速反应 计算工具酶的用量 计算工具酶的用量
细胞内代谢物的检测与分析技术
细胞内代谢物的检测与分析技术细胞内代谢物的检测与分析技术是一项关键性的研究领域，它对于深入理解细胞代谢过程以及相关疾病的发生机制具有重要意义。
在过去的几十年里，科学家们借助于先进的分析技术，不断开发出各种应用于细胞内代谢物检测与分析的方法，包括色谱-质谱联用技术、核磁共振技术、质谱成像技术、光谱学等。
在本文中，我将简要介绍一些常用的细胞内代谢物检测与分析技术及其应用。
一、色谱-质谱联用技术色谱-质谱联用技术是一种常用的细胞内代谢物分析方法。
它结合了色谱技术的分离能力和质谱技术的结构鉴定能力，能够对细胞内代谢物进行高效准确的分析。
常用的色谱-质谱联用技术包括气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）等。
例如，科学家可以利用GC-MS技术对细胞内氨基酸、脂质等进行定性和定量分析，通过对色谱峰的检测和质谱图的解析，确定代谢物的结构和浓度。
另外，LC-MS技术可以更加精确地分析小分子代谢产物，比如核苷酸、脂肪酸等。
色谱-质谱联用技术在生物医学研究、药物开发等方面发挥着重要作用。
二、核磁共振技术核磁共振技术（NMR）是一种基于原子核在磁场中共振吸收和发射辐射的原理，对于测量和分析细胞内代谢物具有独特的优势。
相对于质谱技术来说，NMR技术可以避免样品的毁灭性处理，并能够进行非破坏性的分析，保留了样品的完整性。
NMR技术可以用于测定代谢物的结构、浓度、代谢通路等信息。
科学家们可以通过对代谢物的核磁共振谱进行解析，确定化学环境和相互作用，从而更好地了解细胞内代谢过程。
三、质谱成像技术质谱成像技术（MSI）是一种能够在细胞和组织水平上分析分子信息的方法。
它结合了质谱分析的高灵敏度和成像技术的高空间分辨能力，可以直接将细胞内代谢产物映射到组织切片上。
利用质谱成像技术，科学家可以对代谢物的空间分布进行定量分析，从而研究代谢物在细胞内以及组织之间的传递和转化动态。
这一技术在癌症代谢研究、药物代谢动力学等领域具有广阔的应用前景。
代谢物酶法分析技术
采用统计学、机器学习等方法对处理后的数据进行深入分析，挖 掘代谢物与生物体生理状态之间的关联。
结果可视化
将分析结果以图表、图像等形式进行可视化展示，便于理解和解 释。
03
代谢物酶法分析技
术实验设计
实验材料准备
酶
选择特异性针对目标代谢物的酶，确 保酶的纯度和活性。
底物
准备目标代谢物的标准品和待测样品， 确保样品的纯度和浓度。
酶与底物的结合
酶具有特异性，能够与特定的底物结合形成酶底物复合物，从而引发催化反应。
3
酶催化反应的动力学
酶催化反应遵循米氏方程，反应速率受底物浓度、 酶浓度、温度、pH等因素的影响。
代谢物检测原理
代谢物的提取与纯化
从生物样本中提取代谢物，并通过适当的纯化方法去除干扰物质， 提高检测的准确性和灵敏度。
06
代谢物酶法分析技
术未来发展趋势
技术创新方向
高通量分析技术
随着生物技术的发展，未来代谢物酶法分析技术将更加注 重高通量、高灵敏度和高准确性的分析方法开发，以满足 大规模样本分析的需求。
多组学整合分析
代谢物酶法分析技术将与基因组学、蛋白质组学等多组学 技术进行整合，以全面解析生物体的代谢调控网络。
结果解读
结合实验目的和背景知识，对实验结果进行解读和分析，探讨代谢 物与酶活性之间的关系以及可能的影响因素。
04
代谢物酶法分析技
术应用实例
生物医学领域应用
疾病诊断
通过对体液（如血液、 尿液）中特定代谢物的 酶法分析，可以辅助诊 断某些疾病，如糖尿病、 肝病等。
药物研发
利用代谢物酶法分析技 术，可以研究药物在体 内的代谢途径和代谢产 物，为新药研发提供重 要依据。
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术代谢物酶法分析技术的基本原理是利用目标代谢物与特定酶之间的底物-酶-产物反应，通过测定底物的消耗或产物的生成来间接地推测出代谢物的浓度。
通常来说，该方法需要有一个特异性高、反应速率快且稳定的酶作为标志物，该酶只与特定的代谢物发生催化反应。
1.选择合适的酶和底物：酶的选择应取决于需要分析的代谢物。
确保所选的酶对分析样品中的干扰物不敏感，并且酶底物与其他代谢物之间没有交叉反应。
2.校准测定：为了确定测定所需的最佳反应条件，可以通过在不同酶底物浓度下进行一系列试验来建立标准曲线。
标准曲线可以反映酶催化反应速率与底物浓度之间的关系。
3.准备样品：根据需要，对样品进行前处理，如去除干扰物或质量校正。
4.反应体系：将样品与合适的酶底物混合，在适当的反应条件下孵育一定时间，以使酶反应发生。
这个反应体系可以是液体相或固相。
5.检测和测量：将反应体系中的代谢物与其他物质分离，并使用合适的测量仪器和方法测定其浓度。
常用的测量方法包括：比色法、荧光法、放射性测量法等。
1.高灵敏度：代谢物酶法具有高灵敏度，能够检测到非常低浓度的代谢物。
2.特异性：选择特异性酶和底物可以避免其他代谢物的干扰。
3.快速：酶催化反应速率快，在短时间内可以得到准确的测量结果。
4.稳定性：酶底物具有较高的稳定性，可以长时间保存并重复使用。
代谢物酶法分析技术的应用非常广泛。
在医学领域，代谢物酶法可以用于检测血液中的生化指标，如葡萄糖、胆固醇等，用于疾病的早期诊断和监测。
在食品科学领域，代谢物酶法可以用于检测食品中的营养成分，如脂肪、蛋白质等，用于食品质量的评估和控制。
此外，代谢物酶法还可以用于监测环境污染物和化学物质的代谢产物，用于环境和毒理学研究。
总之，代谢物酶法分析技术是一种快速、灵敏、特异性高的代谢物测定方法，具有广泛的应用前景。
通过选择合适的酶和底物，并采取适当的测量方法，可以有效地分析各种生物体中的代谢物。
代谢物的分析与结构鉴定技术
代谢物的分析与结构鉴定技术随着科学技术的发展，越来越多的代谢物被用于医药、化学等领域。
代谢物是生物体内产生的化合物，可以包括蛋白质、糖类、脂类等多种不同类型的分子。
对于代谢物的分析与结构鉴定技术的发展和应用，具有重要的价值和意义。
代谢物的分析是指对代谢物的多层次分子结构、代谢动力学、代谢通路以及代谢元学进行研究和分析。
研究代谢物可以为医学和药物研发提供重要的信息，例如：发现新药物、评价药物的代谢特征、分析代谢物的副作用等。
同时，代谢物也可以用于检测慢性疾病的发生和发展，利用代谢物水平的变化预测或监测疾病的进程。
代谢物分析技术的发展可以追溯到20世纪50年代。
最初的代谢物分析技术主要依靠柱层析法和纸层析法来分离物质并进行定量分析。
但是，这些方法具有操作复杂、样品量较大的缺点。
因此，各种新的代谢物分析技术相继出现，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法等。
其中，质谱法是最为常用的代谢物分析技术之一，其基本原理是根据待检测物质的质量与电荷之比进行分析。
质谱法具有快速、高灵敏度、定量准确、具有流动性等特点，能够对代谢物的结构进行识别和鉴定。
除了分析技术的发展，代谢物的结构鉴定技术也在不断地进化和完善。
代谢物结构鉴定技术旨在确定代谢物的结构、功能以及代谢过程中的化学反应。
对代谢物结构的鉴定可以帮助确定代谢物的生物学特性以及生物体系中的代谢信息。
现在常用的代谢物的结构鉴定方法包括核磁共振（NMR）光谱分析、质谱（MS）分析、X射线和电子晶体学、红外光谱和过渡态结构分析等。
NMR技术是指通过核磁共振仪器对样品中含有核磁共振活性原子（如1H、13C等）的分子进行分析，根据原子（或核）的磁场产生的信息对分子的电子结构、单键和多键、杂环化合物、终末基团，一个分子内的空间构象等进行研究。
NMR技术的优点在于不需要分离和提纯样品，而且可以分析样品中不同种类原子的数量和种类。
但是，这种技术需要对分子进行较为准确的结构模型预测，同时还需要较大的核磁共振实验仪器。
《酶法分析》课件
酶的分类和特性
酶的分类
酶的种类：包括氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂合酶、异 构酶等
酶的活性：受温度、pH值、离 子强度等因素影响
酶的来源：包括动物、植物、 微生物等
酶的稳定性：受温度、pH值、 离子强度等因素影响
酶的特性
酶是一种生物催化剂，可以加速化 学反应的速度
酶的活性受温度、pH值、离子强 度等因素的影响
法
酶法分析的应 用领域广泛， 包括食品、医 药、环境等领
域
酶法分析的发 展趋势是向着 自动化、微型 化、高通量方
向发展
酶法分析的未 来前景广阔， 有望在更多领
域得到应用
对未来发展的展望
酶法分析技术在生物医学领域的应用前景 酶法分析技术在环境监测领域的应用前景 酶法分析技术在食品检测领域的应用前景 酶法分析技术在工业生产领域的应用前景
酶法分析在生物体内的应用实例：例如，酶法分析可以用于检测血液中的葡萄糖、血脂、胆固醇等 物质，也可以用于检测尿液中的蛋白质、尿素、肌酐等物质。
酶法分析在生物体内的发展趋势：随着生物技术的不断发展，酶法分析在生物体内的应用将会越来 越广泛，越来越深入，为疾病的诊断和治疗提供更加准确、快速的信息。
食品分析中的酶法分析
《酶法分析》PPT课件
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目录
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01
酶法分析的实验技术 和方法
04
酶法分析概述
02
酶的分类和特性
03
酶法分析的应用实例
05
酶法分析的优缺点和 未来发展前景
06
添加章节标题
酶法分析概述
酶法分析的定义和原理
酶法分析：利用酶的生物催化作用，对样品进行定性、定量分析的方法
代谢物检测与分析技术研究
代谢物检测与分析技术研究代谢物是由生物体内代谢过程中产生的化合物，它们可以作为多种疾病的标志物。
因此，代谢物检测和分析技术在临床医学、生物医药和食品安全等领域中具有广泛的应用价值。
本文将从介绍代谢物检测的原理、常用的代谢物检测技术以及当前的发展趋势等方面进行探讨。
一、代谢物检测的原理代谢物检测的主要原理是利用代谢物与生物体内变化的关系。
在生物进程过程中，代谢物的数量和种类会随着生物状态而产生变化。
因此，通过测量代谢物的含量和种类，可以推测生物状态和生物反应的活性程度，以此作为疾病的标志物。
二、常用的代谢物检测技术1. 质谱技术质谱技术是一种非常重要的代谢物检测技术。
根据质谱技术的不同类型，可以对分子的质量和组成进行精确的测量和分析。
常见的质谱技术有质谱荧光分析（MS/FD-LTQ-Orbitrap）、气相色谱质谱（GC-MS）和液相色谱质谱（LC-MS）等。
其中，荧光质谱技术具有灵敏度高、特异性好、信噪比高等优点，因此广泛应用于临床医学、环境保护和食品安全等领域。
2. 核磁共振技术核磁共振技术（NMR）是一种对代谢物进行分析的非损伤性技术。
该技术利用对自旋运动的观察来获得有关分子的结构、动力学和化学环境的信息，可应用于代谢物组学研究、生物成像和蛋白质折叠研究等方面。
3. 光谱技术光谱技术是一种利用代表性波长的电磁波，通过模拟生物样品产生的反应而得出代谢物的检测方式。
由于光谱技术具有非常高的灵敏度、分辨率和特异性，是代谢物检测和分析的重要方法。
常见的光谱技术有紫外光谱、荧光光谱、近红外光谱等。
三、当前的发展趋势1. 多样化的生物标记物检测技术目前，代谢物检测和分析已经成为临床医学、生命科学和食品安全等领域的重要技术。
随着技术的不断进步，生物标记物检测技术的种类也越来越多样化，如蛋白质、核酸和细胞等，代谢物分析技术的研究也将更加深入和广泛。
2. 代谢物和疾病的关联性研究代谢物检测技术在临床医学中可以有效地帮助诊断和治疗各种疾病。
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S 0 S 0 S t Km t 2 . 303 lg 积分得： V max S t V max
式中[S0]为待测物，[St]为待测物至反应t时间后的浓度。
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第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
第五章
代谢物酶法分析技术
江苏大学 郑铁生
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第五章
代谢物酶法分析技术
教学目标与要求
掌握：代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法、
酶促偶联法等方法的设计原理，脱氢酶和过氧化物酶指示 系统的应用原理，以及平衡法和速率法的设计要求。
熟悉：代谢物酶法分析技术的理论基础，酶循环法、酶
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
血清尿素测定 尿素 + H2O
尿素酶
2NH3 + CO2
NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+
谷氨酸 + H2O + NAD+
测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正
比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测
定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的
消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
速度用△ A/min来表示。上式改写为：
标准管 / min Cs 测定管 / min Cu
速率法测定代谢物浓度的原理
前提条件是测定初速度。越偏离初速度，测定误差则越大。
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用
标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固
定时间法(fixed assay)。
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第五章
代谢物酶法分析技术
平衡法与速率法的相互联系
平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反 应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会 达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平
LD
丙酮酸 + NADH + H+
在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法 丙酮酸测定 丙酮酸 + NADH + H+
LD
乳酸 + NAD+
在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法
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第五章
代谢物酶法分析技术
小结与展望
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第五章
代谢物酶法分析技术
1
代谢物酶法分析的理论基础
平衡法（终点法） 代谢物酶法分析 速率法（动力学法）
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5
第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax、[S0]有关， Km越小、Vmax越大（加入酶量越多）、[S0]越小（待 测物越少）则达到平衡所需的时间越短。
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第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
d S ( Km S ) dt V maxS
第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
此式是平衡法测定代谢物的基本原理
Cs As Cu Au
标准管S 0 标准管S t 标准管S 0 S t 此公式成立是前提条件 测定管S 0 测定管S t 测定管S 0 S t
当 [S0]－[St] ≈ [S0]，即反应基本达到平衡，Au和As基 本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质效应， 两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。
若 [S0] <<Km
可简化为：
d S Km dt V maxS
S 0 Km t 2 . 303 lg 积分得： V max S t
若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标
准管与测定管反应时间（t）一致，则有：
lg 标准管S 0 测定管S 0 lg 标准管S t 测定管S t
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。
体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁
酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及
氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示
系统。
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v V max S K S Km
符合一级酶促反应
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
标准管v 标准管[ S ] 测定管v 测定管[ S ]
若同时带标准管，则有：
标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu，
NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被
测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型 NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处 吸光度的下降来计算被测物的浓度。
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
标准管S 0 测定管S 0 标准管S t 测定管S t
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第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
标准管S 0 标准管S t 标准管S 0 S t 测定管S 0 测定管S t 测定管S 0 S t
衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使
酶促反应成一级反应。
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第五章
代谢物酶法分析技术
2
代谢物酶法分析的方法
代谢物酶法分析主要优点
酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理 就能测定，简化了实验程序；
试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶 Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型
可简化为：
标准管的 [S0－St] 与待测管的 [S0－St] 分别代表消 耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来 表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示
为Cs和Cu。
Cs As Cu Au
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直接法。
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第五章
代谢物酶法分析技术
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定 尿酸 + O2 + H2O
UAO
尿囊素 + CO2 + H2O2
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定 胆红素 + O2
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
根据米氏方程：
V maxS v Km S
①当[S] <<Km，则[S] + Km ≈ Km ②当酶量固定不变时，酶促反应的 最大速度Vmax也不变 米氏方程改为：
血清葡萄糖己糖激酶法测定
Glu + ATP
G-6-P +
G-6-P+ADP
P-6-GA + NADPH + H+
NADP+
G 6 PD
指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定 340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比
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物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应