广东省猪链球菌2型菌株毒力基因及分子分型分析

广东省猪链球菌2型菌株毒力基因及分子分型分析陈经雕;刘美真;柯碧霞;谭海玲;李柏生;柯昌文【摘要】目的掌握广东地区猪链球菌2型菌株毒力因子及分子分型情况,为诊断、治疗和制定防控措施提供科学依据.方法选取荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、胞外因子(ef)等5个猪链球菌2型主要毒力基因,分别设计引物对分离自病人、病猪的22株猪链球菌2型菌株进行PCR检测,并对菌株进行MLST分型分析.结果 22株菌分为5种毒力基因型,其中cps2J+/mrp+/sly+/gdh+/ef+型别为病人及病猪菌株所共有,cps2J+/mrp+/sly-/gdh-/ef+ 、cps2J+/mrp+/sly-/gdh +/ef+为病人菌株所特有,cps2J+/mrp-/sly+/gdh+/e f+、cps2J+/mrp-/sly-/gdh+/ef为病猪菌株所特有；MLST分型结果显示,22株分为ST1 、ST7和ST28三个型别,其中ST1 、ST7型为病人和病猪菌株所共有,均同属于ST1克隆复合物,ST28型为病猪所特有.结论广东地区病人、病猪的猪链球菌2型菌株毒力基因型及MLST分子分型均呈现多样化,且部分型别为两者所共有,为阐明猪传染给人提供了直接的证据.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2013(029)010【总页数】5页(P986-990)【关键词】猪链球菌2型;毒力基因;PCR;分子分型【作者】陈经雕;刘美真;柯碧霞;谭海玲;李柏生;柯昌文【作者单位】广东省疾病预防控制中心,广州 511430;广东省疾病预防控制中心,广州 511430;广东省疾病预防控制中心,广州 511430;广东省疾病预防控制中心,广州511430;广东省疾病预防控制中心,广州 511430;广东省疾病预防控制中心,广州511430【正文语种】中文【中图分类】R378.1猪链球菌（Streptococcus suis）是一种能在猪群中正常携带，偶尔导致猪、人发病的人兽共患的动物源性微生物。

根据其荚膜多糖抗原的异同划分为35个血清型，其中猪链球菌2型为优势致病血清型，而不同猪链球菌2型菌株间的致病力又存在明显的差异，这种差异可能与各菌株所携带的毒力因子有很大关系［1］。

目前认为猪链球菌2型的毒力因子主要包括荚膜多糖（cps2J）、溶菌酶释放蛋白（mrp）、溶血素（sly）、谷氨酸脱氢酶（gdh）、胞外因子（ef）、纤连蛋白／血纤蛋白原结合蛋白（FBPS）和毒力相关序列ORF2等［2］。

为了解广东地区猪链球菌2型菌株毒力基因分布及分子分型情况，本研究选取了其中5个毒力基因对我省分离自病人和病猪的猪链球菌2型菌株进行PCR检测分析，并对菌株进行MLST分子分型，为诊断、治疗和制定猪链球菌疫情防控措施提供科学依据。

1 材料与方法1．1 实验菌株 2005－2008年共22株，其中17株来自病人（其中2005年5株分别来自潮州、阳江、深圳、韶关和佛山，2006年5株分别来自江门、广州、佛山、中山和惠州，2007年7株分别来自佛山、江门、深圳各2株和广州1株），5株来自病猪（均为2008年分别来自肇庆2株、河源、茂名、惠州各1株），阳性对照的猪链球菌2型标准株SS2（来自德国）核酸由江苏省疾控中心惠赠。

1．2 试剂来源诊断血清购自丹麦（STATENS SERUM INSTITUT）公司，API20Strep生化鉴定试验条购自法国梅里埃公司，分子生物学试剂购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司，引物由上海生工公司合成，均在有效期内使用。

测序反应用PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（v3．1，ABI）试剂盒，操作按试剂盒说明书进行。

1．3 实验方法1．3．1 菌株鉴定［3］从菌落形态、血清学实验及API 20Strep生化鉴定分别对菌株进行种、型鉴定。

1．3．2 毒力因子检测［3］1．3．2．1 菌株DNA提取用煮沸法或细菌基因组DNA试剂盒提取所有菌株的基因组DNA，试剂盒提取可参考说明书操作。

1．3．2．2 引物见表1。

表1 5个毒力基因的引物序列及产物大小Tab．1 Five virulence genes’primer sequences and product sizesTarget genes Primer sequences Annealing temperature Size of product cps2J p1：5′－gttgagtccttatacacctgtt－3′p2：5′－cagaaaattcatattgtccacc－3′ 60℃ 450bp mrp p1：5′－ggtataccttgctggtaccgttc－3′p2：5′－agtctctacagctgtagctgg－3′ 60℃ 532bp sly p1：5′－agttcgcacttgattttaag－3′p2：5′－aatacattgccagattactc－3′ 51℃ 1 500bp gdh p1：5′－ggcgccgaattcgtcgacattatttagcaatttttgcg－3′p2：5′－cgccgcggatccgtagttaaagttggtattaac－3′ 45℃ 1 100bp ef p1：5′－acaaaggcgtaggttcaatc－3′p2：5′－cggcatcaagaatgtctttg－3′ 56℃ 269bp 1．3．2．3 PCR反应体系反应体系为25μL，10×PCR Premix缓冲液12．5μL，上、下游引物（10 mmol／L）各1μL，模板2μL，用去离子水调整终体积至25μL。

反应结束后各取5μL于1% 琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照。

1．4．1 多位点序列分析（MLST）1．4．1．1 提取细菌基因组DNA 按照细菌DNA提取试剂盒说明书严格操作，提取的基因组－20℃保存待用。

1．4．1．2 PCR 扩增、测序、数据分析参照文献［4－5］分别用 PCR 扩增aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA和thrA7个管家基因DNA片段，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后测序。

各管家基因序列经DNA star SeqMan软件处理后与数据库http：／／ssuis．mlst．net／进行比对，获得各位点的等位基因数值，并形成相应的菌株等位基因谱，提交MLST 网站，确定序列分型（Sequence Type，ST）。

2 结果2．1 菌株鉴定对22株菌株进行菌落形态、血清学实验及API 20Strep生化鉴定，全部菌株均为猪链球菌2型。

2．2 毒力基因检测 22株菌分为5种毒力基因型，其中病人及病猪菌株均有cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋型别（病人7株、病猪3株），cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh－／ef＋（6 株）、cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh＋／ef ＋（4株）为病人分离株所特有，cps2J＋／mrp－／sly＋／gdh＋／ef＋（1株）、cps2J＋／mrp－／sly－／gdh＋／ef－（1株）为病猪分离株所特有，图1为部分菌株的cps2J基因片段结果。

结果见图1、表2。

2．3 MLST分型对所有菌株的7个管家基因片段进行扩增，经测序、比对分析显示，均能够在数据库找到对应的基因型，共有3个基因型，分别为ST1型（病人9株、病猪2株）、ST7型（病人8株、病猪2株）和ST28（病猪1株）型，其中ST1、ST7型菌株亲缘关系极近，均同属于ST1克隆复合物。

结果见图2。

表2 广东地区猪链球菌2型的毒力基因类型Tab．2 Detection of virulence genes in Ss2in GuangdongNote：＋is positive for PCR；－is negative for PCRTypes Virulence genes Strains cps2J mrp sly gdh ef Patients Sick pigs Total 1＋＋＋＋＋7 3 10 2＋＋－－＋6 0 6 3＋＋－＋＋4 0 4 4＋－－＋－0 1 1 5＋－＋＋－0 1 1 Total／／／／／17 5 22图1 部分菌株夹膜多糖基因片段（cps2J）结果－450bpFig．1 Strains capsular polysaccharide gene fragment（cps2J）－450bpThe 1－7are part of strains from patients；8－10 are part of isolates from sick pigs图2 广东地区猪链球菌2型菌株MLST分型聚类图Fig．2 MLST type cluster map of Streptococcus suis type 2in Guangdong Province3 讨论猪链球菌2型菌株曾引起我国1998年江苏省和2005年四川省的部分地区的人感染猪链球菌病疫情的暴发流行。

广东省猪链球菌在猪间的流行早有报告，但从病原学上证实人感染猪链球菌2型尚属首次［6］，且与江苏、四川人感染猪链球菌病疫情暴发不同，广东地区的猪链球菌2型菌株均来源于散发的病例和病猪。

研究发现并不是所有的猪链球菌2型菌株都具有致病性，其致病力取决于它的毒力因子，根据菌株毒力因子的差异，将其分为强毒力株、弱毒力株和无毒力株，其致病机理目前还不很清楚，但普遍认为其致病力的差异与该菌株的毒力因子分布有着密切的关系［7］。

Cps2J是猪链球菌2型菌株抵抗巨噬细胞吞噬的重要物质，在猪链球菌致病过程中有重要作用，也是猪链球菌进行分型的标志。

Smith等［8］研究发现通过插入突变得到的无荚膜的等位基因突变株在体外很容易被猪肺泡巨噬细胞摄入，更重要的是，通过鼻腔接种无菌仔猪的突变株对其完全无致病性，由此可见，荚膜多糖与菌株的致病力有关。

mrp与ef也是猪链球菌2型菌株重要的毒力因子，曾巧英等［9］研究证明mrp可单独作为猪链球菌2型菌株的毒力因子。

猪链球菌血清型众多，ef与血清型有相关性，ef是一种粘附素，能黏附上皮细胞并诱导上皮细胞融合和凋亡［10］。

Henk J等［11］研究欧洲的猪链球菌菌株结果显示：猪链球菌血清1型、2型、1／2型和14型菌株表达ef蛋白的百分率很高，菌株的毒力可能与ef相关。

本研究中除了1株来自病猪的菌株为ef阴性外，其余菌株均为ef阳性。

由于mrp和ef在强毒力菌株中检出率很高，在无毒力菌株中检出率很低，因而携带mrp和ef 常被认为是猪链球菌2型高致病性的标志［12］。