不同源沙门氏菌对小鼠致病力的比较与毒力基因检测
不同源5株沙门菌在小鼠与雏鸡体内传代的毒力比较
动 物 的死 亡率 ， 评 估 脏 器病 变程 度 ， 应用 Ｐ ｃＲ鉴 定回收 细 菌 。结果表 明 ， 猪 源沙 门菌在 小 鼠和雏 鸡体 内传代 后毒 力均 呈增 强趋 势 ； 鸡 源 沙 门茵在 小 鼠体 内传 代 后 的 毒 力 无 明 显 变化 ， 在 雏 鸡体 内传 代 后 毒 力 则 呈 现 增
１ ． １ ． ４ 引物 检 测 沙 门 菌 特 异 性 Ｐ Ｃ Ｒ 引 物 为 Ｐｌ ：
鉴定 。 旨在为有 效 防控沙 门菌食 源性 感 染提 供 科 学
依据 ， 为 深入 探 索 不 同源 沙 门菌 的致 病 机 制 奠 定 基
础。
收稿 日期 ： ２ Ｏｌ ３ 一 Ｏ ５ — ２ ７
生 学 均十分 重要 ｜ ＿ ＿ 。 。 根据 沙 门菌对 宿主 的嗜性 不 同 。 可 分 为 ３群 ， 即
１ 材 料 与方 法 １ ． Nhomakorabea 材 料
１ ． １ ． １ 受 试 菌 株 ５株 不 同 源 沙 门 菌 由 安 徽 农 业
大学 动物 传染 病实 验室 分离 、 鉴定 与保 存 （ 表 １ ） 。
致病 力 的 差 异 ， 本研 究选择猪 源、 鸡源 和人源 沙 门 １ ． １ ． ２ 质 控 菌 株 沙 门 菌 （ Ｃ ＭＣ Ｃ ５ ０ ０ ９ ４ ） 、 大 肠 埃
希菌（ ＡＴ Ｃ Ｃ ２ ５ ９ ２ ２ ） 均 由安 徽 农 业 大 学 动 物 传 染 病 实验 室保存 。
（ 安徽农 业大学动物科技学 院， 安徽 合 肥 ２ ３ ０ ０ ３ ６ ）
摘 要 ： 为 了解 不 同源沙 门茵在 不 同宿 主体 内传代 后 的毒 力 变化 ， 选择 猪 源 、 鸡 源、 人 源 受 试 沙 门茵 ， 采
一株食源性伤寒沙门氏菌的多重耐药性分析与小鼠致病性研究
一株食源性伤寒沙门氏菌的多重耐药性分析与小鼠致病性研究赵翔;刘东;潘金金;袁飞【摘要】为研究从山东省某肉鸭屠宰场分离到的一株伤寒沙门氏菌的耐药性和对小鼠的致病性,从而了解其对食品安全和人类健康的危害,使用纸片扩散法测定该分离株的药敏性;设计22对耐药基因和Ⅰ类整合子保守区的引物,对其耐药基因和Ⅰ类整合子进行检测和分析;利用Balb/c小鼠,腹腔注射该分离株菌液,研究其对小鼠的致病性.结果显示:该伤寒沙门氏菌分离株对9大类20种抗菌药中的16种都产生了较强的耐药性,PCR扩增测序结果与抗生素敏感性表型一致;该菌可引起试验小鼠剧烈腹泻,直至死亡.结果表明,该分离株耐药严重,且对小鼠具有很强的致病性,存在影响食品安全和人类健康的潜在威胁.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2018(035)011【总页数】5页(P87-91)【关键词】伤寒沙门氏菌;食源性;耐药性;小鼠致病性【作者】赵翔;刘东;潘金金;袁飞【作者单位】青岛市市北区疾病预防控制中心,山东青岛266000;青岛易邦生物工程有限公司,山东青岛 266000;青岛易邦生物工程有限公司,山东青岛 266000;青岛易邦生物工程有限公司,山东青岛 266000【正文语种】中文【中图分类】S852.61沙门氏菌是最常见的引发食源性疾病的病原菌。
人感染沙门氏菌后通常会导致腹泻，此时可能需要借助药物治疗。
目前临床上用于治疗的药物通常为氟喹诺酮类和头孢类。
但随着人类临床治疗和畜牧业生产中抗生素的广泛使用和滥用，包括沙门氏菌在内的很多病原菌都对其产生了多重耐药。
相关研究表明，沙门氏菌属多重耐药率在过去的20年内从20%增加到了70%[1]。
由于耐药性可以通过食物链等形式在人畜间传递[2-3]，因此强化动物用药监管迫在眉睫。
本研究从山东省某肉鸭屠宰场中分离到一株伤寒沙门氏菌，并对该菌株的耐药性和对小鼠的致病性进行了检测分析。
1 材料与方法1.1 主要试剂亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋琼脂（BS）、麦康凯琼脂和生化发酵管：均购自杭州微生物试剂有限公司；沙门氏菌诊断血清：购自成都生物制品研究所；Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp DNA Marker和PCR产物回收试剂盒：购自TransGene公司。
鸽源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及耐药与毒力基因检测
鸽源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及耐药与毒力基因检测陆凡;王鹏;刘林敏;黄振兴;张明霞;杜文珍;吴颖臻;韦平;韦天超
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2024(45)1
【摘要】旨在鉴定广西某鸽场分两批送检的疑似鸽副伤寒病例的病原并对病原菌的耐药性和毒力基因进行检测分析;对从病鸽肝脏组织分离的病原菌进行培养特性观察、生化鉴定、血清型鉴定及16S rRNA测序分析,并通过药敏试验、耐药基因和毒力基因检测对分离菌株进行耐药性和毒力分析。
分离到2株革兰氏阴性短杆菌,结合生化鉴定、血清型鉴定和16S rRNA分析结果,表明2株分离菌株均为鼠伤寒沙门氏菌。
药敏试验结果表明,2株鼠伤寒沙门氏菌均对萘啶酸、链霉素和四环素耐药,并呈现多重耐药表型,耐药基因检测结果与耐药表型相符。
2株鼠伤寒沙门氏菌中invA等12种毒力基因检测呈阳性。
结果表明,成功分离鉴定2株具有多重耐药性并携带大量毒力基因的鸽源鼠伤寒沙门氏菌,可为鸽源鼠伤寒沙门氏菌的防治和研究提供参考。
【总页数】8页(P36-43)
【作者】陆凡;王鹏;刘林敏;黄振兴;张明霞;杜文珍;吴颖臻;韦平;韦天超
【作者单位】广西大学动物科学技术学院;广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】S852.612;S858.39
【相关文献】
1.中华竹鼠源致病性大肠杆菌分离鉴定、耐药性及毒力基因检测
2.鸽源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定
3.1株信鸽源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及其耐药性和毒力分析
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Ⅰ型菌毛介导鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的毒力及对抗原递呈细胞侵袭力的研究
Ⅰ型菌毛介导鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的毒力及对抗原递呈细胞侵袭力的研究鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enteria serovar Typhimurium）为肠杆菌科沙门氏菌属成员,是条件性细胞内寄生的革兰氏阴性肠杆菌,具有广泛的宿主感染谱,如小鼠、家禽、猪、羊、牛、马和人,能引起人和动物的沙门氏菌病,具有重要的公共卫生意义。
沙门氏菌菌毛是细菌表面的纤细结构,与细菌粘附上皮细胞及在小肠粘膜定植有关。
Ⅰ型菌毛是静止培养时唯一表达的菌毛,其结构与功能是各种菌毛中研究最为清楚的一种。
前期体外研究证明,沙门氏菌Ⅰ型菌毛与细菌粘附与侵袭宿主细胞有关。
本研究在此基础上,以小鼠为模型,进行体内研究,通过LD<sub>50</sub>与侵袭试验,证实鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛对细菌毒力和侵袭的影响。
本研究针对沙门氏菌Ⅰ型菌毛,主要进行以下几个方面的研究:1.以鼠伤寒沙门氏菌SR-11衍生株AJB3为参考菌株,三重突变的重组鼠伤寒沙门氏菌AJB3fim<sup>-</sup>lpfinvA<sup>-</sup>（标记为117#）和稳定表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ44-h及不表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ33-h为对照菌株进行粘附细胞能力的研究。
结果表明:三重突变的重组沙门氏菌AJB3fim<sup>-</sup>lpfinvA<sup>-</sup>粘附HEp-2细胞和体外培养的骨髓源DC的能力显著下降,说明突变株构建成功;稳定表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ44-h比不表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ33-h粘附HEp-2细胞和体外培养的骨髓源DC的能力显著升高,而且比野生性菌株的粘附能力略有增加,说明Ⅰ型菌毛特异性介导鼠伤寒沙门氏菌粘附上皮细胞和骨髓源树突状细胞。
鼠伤寒沙门菌stn基因突变株的构建与毒力检测
鼠伤寒沙门菌stn基因突变株的构建与毒力检测黄建华;徐心晶【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2001(026)003【摘要】作者构建了鼠伤寒沙门菌肠毒素（stn）基因插入失活型与缺失型突变的重组自杀载体质粒，通过重组自杀质粒中的突变stn基因与鼠伤寒沙门菌株2000染色体上野生型stn基因发生同源交换，筛选获得stn基因突变的同源突变菌株。
在小鼠体内检测菌株stn基因产物生物活性的结果表明，突变菌株诱发小鼠肠液分泌的能力较野生菌株明显减弱，而小鼠口服突变菌株的半致死剂量较野生株明显增高，提示stn基因是鼠伤寒沙门菌致病机制中一个较为重要的毒力因子。
%The plasmids of recombinant suicide vector containing the truncated stn gene and the deleted stn gene were constructed. The Salmonella stn-deficient mutant was prepared by homologous recombination between the mutant stn gene in the recombinant suicide vector and the wild-type gene in the chromosome of S. Typhimurium 2000. The detection of biological activity of stn gene production in those mutants indicated that Salmonella stn-deficient mutants evoked significantly less fluid secretion in mouse intestinal loops compared to that seen with wild-type Salmonella. Upon oral challenge of mice, the fifty percent lethal dose of the Salmonella stn-deficient mutants was greater than that for the wild-type bacteria. Those studies showed that the stn gene is very important factor in the pathogenesis of salmonellosis.【总页数】3页(P219-221)【作者】黄建华;徐心晶【作者单位】解放军总医院;解放军总医院【正文语种】中文【中图分类】R516.3【相关文献】1.鼠伤寒沙门菌spvB基因缺陷突变株的构建 [J], 邱桥成;叶颖;储元元;廖莉;吴淑燕;黄瑞2.鼠伤寒沙门菌rpoN基因缺失株构建及生物学特性研究 [J], 苏洋洋;黄骏;吴白;印云聪;刘珍;陈素娟;彭大新;刘秀梵3.无痕基因敲除技术构建鼠伤寒沙门菌luxS基因突变株 [J], 陈伟4.sRNA STnc440分子特征及对鼠伤寒沙门菌毒力的影响 [J], 李静;宁程程;李娜;季春晖;张星星;才学鹏;乔军;孟庆玲;夏咸柱5.携带NDV HN基因的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统构建及其生物学特性分析[J], 宋敏杰;周小双;石胜丽;朱文文;田文静;程相朝;郁川因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一株鼠伤寒沙门氏菌噬菌体的分离鉴定及对小鼠的防制效果研究
一株鼠伤寒沙门氏菌噬菌体的分离鉴定及对小鼠的防制效果研究赵影;刘秀侠;李金敏;徐海燕;谷魏【摘要】本研究旨在通过双层平板法从鸡粪中分离鼠伤寒沙门氏菌烈性噬菌体,并通过电镜观察、热稳定性、pH稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线和在小鼠上的防制效果试验对噬菌体进行评估.结果显示,从鸡粪中成功分离出一株鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(ΦBLCC8-0050-3),该噬菌体有一个正多面体立体对称的头部,头径直径约65 nm,无尾部结构,应属于盖噬菌体科(Tectiviridae)烈性噬菌体;噬菌斑成圆形空斑,周围有晕环,直径为2～3 mm;温度耐受范围是30～50℃;pH耐受范围为3～10.当感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.0001时,子代噬菌体滴度最高;按照一步生长曲线结果,潜伏期为20 min左右,爆发时间为180 min左右,爆发量为43 333 PFU/cell;从噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌的防制效果来看,处理14 d后,阳性对照组小鼠存活率为0,噬菌体预防组小鼠存活率为90％,噬菌体治疗组小鼠存活率为70％.说明与阳性对照组相比,预防组和治疗组都对小鼠抵抗沙门氏菌感染有一定的作用.结果表明,ΦBLCC8-0050-3是一株具有良好应用前景的噬菌体,可作为一种生物抑菌剂用于鼠伤寒沙门氏菌的防制.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2018(045)001【总页数】8页(P234-241)【关键词】鼠伤寒沙门氏菌;裂解性噬菌体;生物学特性;防制效果【作者】赵影;刘秀侠;李金敏;徐海燕;谷魏【作者单位】山东宝来利来生物工程股份有限公司,泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,泰安271000【正文语种】中文【中图分类】S852.61鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)作为沙门氏菌的一种,属于沙门氏菌B 群,能适应几乎任何类型的宿主,在自然界中分布广泛[1],可通过污染食物造成人类肠道感染或畜禽腹泻[2],是重要的人畜共患病原菌;每年因鼠伤寒沙门氏菌引起的感染占沙门氏菌感染总量的20%,造成了严重的经济损失[3];因此,研究鼠伤寒沙门氏菌的有效防制手段具有重要的公共卫生意义[4-5]。
禽类中沙门氏菌MLST分型及毒力基因筛查
MLST Typing of Salmonella in Poultry and Screening of Virulence Genes
ZHANG Jie12,CHANGXiao-hui12,LIU Ming3,!! Xiao-lin12,WAN Xiao-nan1,HUAI Shut?,ZHAO Zhuo3** (1. Science and Technology Research Center of China Customs, Beijing 100026, China; 2. Beijing Key Laboartory of Entry-Exit Food Safety Testing , Beijing 100026, China; 3. Technical Center for Safety of Industrial Products of Tianjin Customs District, Tianjin 300308, China)
Abstract: Thirty six Salmonella isolates were used to study the genotypes and virulence gene prevalence in Salmonella from poultry in Beijing. Whole -genome sequencing and multilocus sequence typing (MLST) were performed on Salmonella isolates. STI 1 was the dominant type. Strains from chickens included ST11 ,ST13, ST17,ST96,ST241,ST1941 and ST26. Strains from ducks included ST19,ST34,ST1546 and ST2441. The ana lyzed strains all carried representative genes from virulence islands SPI1-SPI5,66.7% of these strains also con tained the virulence plasmid spvB described in the virulence factors database (VFDB). Representative genes of S.Schwarzengrund (including sopE,sptB,mgtC ,iiwA/iiwF) were all positive,and these strains did not carry spvB,pefA. ,or prot6E. These results suggest that the pathogenicity island of Salmonella is relatively stable,but differences in genotype affect virulence gene expression・ Both cdtB and pitA were positive in S.Schwarzengmnd, and it was speculated that the Salmonella generally carried GDT. Key words: Salmonella^ multilocus sequence typing(MLST); whole genome sequencing;pathogenicity island; virulence gene
鼠伤寒沙门氏菌的毒力因子及其致病机理
37鼠伤寒沙门氏菌的毒力因子及其致病机理刘 源1 刘美含1 王 心1 邢 华1，2*（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009）摘 要：鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica Typhimurium，ST）是一种革兰氏阴性杆菌，可引起人和动物的自限性肠胃炎，并且据报道一些鼠伤寒沙门氏菌株具有侵袭性，可穿过肠壁并进入体循环，严重影响了公共卫生安全和畜牧养殖业的发展。
本文将对鼠伤寒沙门氏菌致病的毒力因子和致病机理进行总结与阐述。
关键词：鼠伤寒沙门氏菌；毒力因子；致病机理1 前言鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica Typhimurium，ST）是可以感染人类和动物的非特异性人畜共患病原菌，也是主要的食源性致病菌，对其深入研究有重要的公共卫生意义。
鼠伤寒沙门氏菌之所以可以在宿主体内生存、繁殖、扩散，是因为该菌拥有很多毒力因子的协助。
本文将分别从沙门氏菌毒力岛、毒力质粒和其他与侵袭性相关的毒力因子进行阐述，以便更好地了解该病原体进入体循环的方式和其对生物体感染性加强的原因，进而为深入研究该细菌致病机制提供理论依据，同时也为预防鼠伤寒沙门氏菌的感染及新兽药、疫苗研发提供思路。
2 III 型分泌系统沙门氏菌拥有一种特殊的分子装置，称为III 型分泌系统（Type III Secretion System，T3SS），这种分子结构在沙门氏菌侵入细胞中起着重要作用。
T3SS 的功能，一方面能使细菌的效应蛋白转运至宿主细胞，并激活相关的信号通路，使宿主细胞产生细胞因子，诱导细胞凋亡；另一方面促使与宿主细胞接触的侵袭小体在细菌表面进行装配。
鼠伤寒沙门氏菌T3SS 主要通过其结构实现其作为毒力因子功能。
Kubori 等人在光学显微镜下观察T3SS 装置的结构后，发现鼠伤寒沙门氏菌 T3SS 装置的超分子结构为针状复合物（NC）。
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不同源沙门氏菌对小鼠致病力的比较与毒力基因检测程琼;庞瑞亮;王若晨;苏方超;刘军军;李郁【摘要】目的探究不同来源沙门氏菌的致病力及毒力基因分布的差异性.方法采用改良寇氏法对7株不同来源的沙门氏菌进行小鼠致病性试验、病理剖检和组织切片观察,应用PCR检测质粒毒力基因和部分毒力岛基因.结果 7株菌株的LD50按表中编号⑥、④、⑤、②、①、③、⑦依次降低,菌株⑦、①、③引致的病理变化最为明显,4株猪源沙门氏菌的致病力均高于3株鸡源菌株.仅菌株⑦菌株检出spvR、spvA、spvB、spvC、spvD质粒毒力基因;毒力岛毒力基因sscA、sseD、sseE 7株菌株全部检出,而sseC基因仅有③、④、⑤和⑦检出.结论不同来源的沙门氏菌对小鼠的致病力具有明显差异,不同沙门氏菌对小鼠的致病力表型与其毒力基因的分布存在相关性.%The aim of this study was to explore the pathogenicity of Salmonella isolates from different sources and the distribution of their virulence genes. We tested the pathogenicity of seven Salmonella isolates from different sources by the modified Karber method. The pathological changes were observed, and the plasmid virulence genes (spv) and some pathogenicity island (SPI) genes were detected by PCR. Results showedthat according to the number of strain in the table the LD50 in the seven isolates were decreased in the order of⑥, ④, ⑤, ②, ①, ③, ⑦. The most obvious pathological changes were caused by ①, ③ and ⑦. The pathogenicity of Salmonella isolates from swine was stronger than others from chicken. The spv genes detected from ⑦ isolate only. The SPI virulence genes sscA, sseD, and sseE were detected in all Salmonella isolates with the present of sseC in ③ , ④ , ⑤ and ⑦. Results suggestedthat there is obvious difference of pathogenicity to mice among Salmonella isolates from different sources, which indicated a correlation between pathogenicity to mice and the carrier condition of virulence genes of Salmonella isolates from different sources.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2013(029)005【总页数】6页(P460-465)【关键词】沙门氏菌;猪源;鸡源;致病力;毒力基因【作者】程琼;庞瑞亮;王若晨;苏方超;刘军军;李郁【作者单位】安徽农业大学动物科技学院,合肥,230036;安徽农业大学动物科技学院,合肥,230036;安徽农业大学动物科技学院,合肥,230036;安徽农业大学动物科技学院,合肥,230036;安徽农业大学动物科技学院,合肥,230036;安徽农业大学动物科技学院,合肥,230036【正文语种】中文【中图分类】R378.2沙门氏菌广泛分布于自然界，极易污染食物、水源、土壤等。
根据血清型分类，目前沙门氏菌已有2 500种以上，其中许多血清型菌株在人和动物之间交叉感染，且大部分具有很强致病性。
人类由于食用患病动物的肉、乳、蛋或被患病动物的排泄物污染的食物，常引起肠热症、胃肠炎和败血症等。
沙门氏菌致病机制较为复杂，其感染宿主通常是先粘附到宿主组织上，进而通过毒力因子侵袭宿主细胞，导致宿主患病及死亡，这些毒力因子由细菌的基因编码[1]，而这些基因主要存在于毒力质粒和染色体上的毒力岛（Salmonella pathogenicity island，SPI）中。
在沙门氏菌的毒力质粒中，spv（Salmonella plasmid virulence genes）与细菌的毒力表型关系最为密切，包括spvR、spvA、spvB、spvC、spvD 基因等[2]，其编码的产物能增强细菌在宿主细胞内生长，与肠系膜淋巴结、脾、肝等肠道外组织感染有关。
而沙门氏菌致病性的两个标志：侵入非吞噬细胞及其在细胞内存活的能力和在宿主的吞噬细胞中复制的能力，均与SPI密切相关[3]。
本研究通过寇氏法测定半数致死量（LD50）、组织切片观察病理变化，以及PCR 检测毒力基因，比较不同来源沙门氏菌的致病力及毒力基因分布的差异性，从而为深入研究沙门氏菌的致病机制，有效防控沙门氏菌病奠定基础。
1 材料与方法1.1 受试菌株 7株不同来源的沙门氏菌由安徽农业大学动物传染病实验室分离、鉴定并保存，见表1。
1.2 参考菌株 invA、spvR、spvA、spvB、spvC、spvD、sscA、sseC、sseD、sseE 等基因阳性菌株均由安徽农业大学动物传染病实验室保存。
表1 7株不同来源沙门氏菌背景Tab.1 Background of seven Salmonellaisolates from different sources菌株编号No.Salmonella isolate来源Source血清型Serotyp e①aul② Surface sample pig carcassS.senftenberg③Anal swab of pig S.arechavaleta④ Surface sample of chicken carcass S.muenster⑤Anal swab of chicken S.saintpaul⑥Chicken （clinical case）S.senftenberg⑦Pig（clinical case） S.Meat sample of pig carcass S.saintp mkamba1.3 主要试剂木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂（XLD）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、琼脂粉、蛋白胨均购自绍兴天恒生物科技有限公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP、Taq Reaction Buffer、DNA Maker－DL2000、DNA MakerⅠ、普通质粒小提试剂盒（离心柱型）均购自天根生化科技（北京）有限公司。
引物均由上海生物工程技术有限公司合成，见表2。
表2 PCR扩增引物序列及扩增条件Tab.2 PCR amplification primer and conditions基因Target引物序列（5′－3′）Sequence of Primer（5′－3′）扩增条件PCR amplification condition片段大小Base pairs／bp invA Upstream：GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA Downstream：TCATCGCACCGTCAAAGGAACC spvR Upstream：AGGAAATCGGACCTACGG Downstream：TAACATCGCCAGCCCTTG spvA Upstream：GCTAACTGTCGGGCAAAG Downstream：GGACAATGGCACGAACCT spvB Upstream：CCTGATGTTCCACCACTTTC Downstream：ATGCCTTATCTGGCGATGT spvC Upstream：AAGGTCGTTCAACAAGCC Downstream：CATTTCACCACCATCACG spvD Upstream：CCCCTGATGATGAGAAGT Downstream：ACAGTGGGATTAGACAGC sscA Upstream：ATGAAAAAAGACCCGACCTA Downstream：TTAGCTCCTGTCAGAAAGTT sseC Upstream：ATGAATCGAATTCACAGTAA Downstream：TTAAGCGCGATAGCCAGCTA sseD Upstream：ATGGAAGCGAGTAACGTAGC Downstream：TTACCTCGTTAATGCCCGGA sseE Upstream：ATGGTGCAAGAAATAGAGCA Downstream：TTAAAAACGTCGCTGGATAA 94。
C5min；94。
C30s，60。
C30s，72。
C30s，35cycles；72。
Cextension for 10min 284 94。
C5min；94。
C30s，57。
C30s，72。
C45s，35cycles；72。
Cextension for 10min 473 94。
C5min；94。
C30s，57。
C30s，72。
C45s，35cycles；72。
Cextension for10min 432 94。
C5min；94。
C30s，57。
C30s，72。
C45s，35cycles；72。
Cextension for 10min 590 94。
C5min；94。
C30s，55。
C30s，72。
C45s，35cycles；72。
Cextension for 10min 252 94。
C5min；94。
C30s，55。
C30s，72。
C45s，35cycles；72。
Cextension for 10min 316 94。
C5min；94。
C30s，43。
C30s，72。
C45s，35cycles；72。
Cextension for 10min 474 94。
C5min；94。
C30s，43。
C30s，72。