蜡样芽胞杆菌在不同标本中的毒力基因分布特征
生鲜食品中蜡样芽孢杆菌毒力基因及耐药性研究
生鲜食品中蜡样芽孢杆菌毒力基因及耐药性研究田万帆;张荣;龙虎;柳琳;贺苏皖;杜玄;蒋敏;赵悦;唐俊妮【摘要】目的:研究生鲜食品中蜡样芽孢杆菌的毒力基因及耐药性.方法:在成都市周边农贸市场和路边小摊采集各种生鲜食品共100份,采用MYP选择性培养基初步分离蜡样芽孢杆菌菌株,采用16S rRNA序列比对分析鉴定得到蜡样芽孢杆菌分离菌株,采用PCR检测分离鉴定菌株中蜡样芽孢杆菌13个毒力基因的携带情况,进一步采用纸片扩散法检测菌株对18种抗生素的耐药性.结果:从100份生鲜食品样本中,检出蜡样芽孢杆菌24株,检出率为24％,其中,路边小摊的检出率(70％)高于农贸市场(18.9％).呕吐型基因ces和cer的检出率较低,仅在1株中发现;腹泻型基因nheC有24株检出;cytK有13株检出;bceT有12株检出;hblA有11株检出;nheB有10株检出;hblC、hblD、nheA各有9株检出;hly-Ⅱ有7株检出;hblB、entFM检出率为0;蜡样芽孢杆菌的4个看家基因rpoB、gyrB、groEL、vrrA在24株分离菌株中检出率为100％.同时发现,生鲜食品来源的蜡样芽孢杆菌分离菌株对杆菌肽B、磺胺甲亚唑、苯唑西林、青霉素表现出较高耐药性,耐药率大于96％;而对阿米卡星、氯霉素、庆大霉素、亚胺培南耐药率小于7％.结论:本研究通过分离鉴定生鲜食品源蜡样芽孢杆菌,研究其毒力基因携带及耐药性,为进一步评价生鲜食品中蜡样芽孢杆菌的安全风险提供参考数据.%Objective:To isolate and identify Bacillus cereus in food and further investigate the virulence genes and antimicrobial resistance of Bacillus cereus fresh foodisolates.Methods:100 fresh food products samples were collected from food markets and food stands of Chengdu,respectively.Then,Bacillus cereus strains were identified by MYP selective medium.16S rRNA sequencing analysis was used to further identify Bacillus cereusspecies.Virulence genes of Bacillus cereus were detected by PCR method.The susceptibility of Bacillus cereus to 18 antibiotics was detected by disk diffusion method.Results:24 strains of Bacillus cereus fresh food isolates were detected from 100 fresh food samples,the isolation rate was 24％.The detection rates of Bacillus cereus from food stands samples were 70％,much higher than that from food markets samples(18.9％).Among all the 13 virulence genes,both ces and cer were only found to be occurred in one isolate,with a very low detection rate,nheC occurred in 24 isolates,cytK occurred in 13 isolates,bceT occurred in 12 isolates,hblA occurred in 11 isolates,nheB occurred in 10 isolates,hblC,nheA and hblD occurred in 9 isolates,hly-Ⅱ occurred in 7 isolates,hblB and entFM were not found,the detection rates for 4 housekeeping genes(rpoB,gyrB,groEL andvrrA)werel00％.Bacillus cereus fresh food isolates showed high resistance to bacitracin B,sulfamethoxazole,oxacillin and penicillin,and the resistant rate was more than 96％.For amikacin,chloramphenicol,gentamicin,and amphenol,the resistance rates were less than 7％.Conclusion:The results would lay a foundation for further assessing the risk of Bacillus cereus in fresh food.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)006【总页数】6页(P135-139,151)【关键词】生鲜食品;蜡样芽孢杆菌;分离鉴定;毒力基因;耐药性【作者】田万帆;张荣;龙虎;柳琳;贺苏皖;杜玄;蒋敏;赵悦;唐俊妮【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】TS201.6蜡样芽孢杆菌在我国细菌性食物中毒中居前三位,是一种需氧、有芽孢、无荚膜、能运动的革兰氏阳性杆菌。
我国市售婴儿配方乳粉中蜡样芽胞杆菌污染及其毒力基因调查
基 因的 分 布研 究 。结 果 １ ３ ５份 婴 儿 配 方乳 粉 中有 ５ ７份 检 出蜡 样 芽 胞杆 菌 ， 检 出率 为 ４ ２ ． ２ ２ ％ 。平 均 污 染 水 平 为
ｆ ｏ ｒ ｍｕ ｌ ａ ｉ ｎ Ｃｈ ｉ ｎａ ． Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄｓ Ｉ ｎ ｆ ａ ｎ ｔ ｆ ｏ ｒ ｍｕｌ ａ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｑｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ Ｂ． ｃ ｅ ｒ ｅ ｕ ｓ ｕ ｓ ｉ ｎｇ Ｍ ＰＮ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ． Ｖｉ ｒ ｕ ｌ ｅ ｎ ｃ ｅ
芽胞 杆 菌的 限量 标 准 提 供 依 据 。
关键词 ： 蜡样 芽胞杆茵 ； 婴儿配方乳粉 ； 毒 力基 因；定量检 测 ； 食源性致病菌 ； 食 品安全
中 图分 类号 ： Ｒ １ ５ ５ ； ￥ ８ ５ ２ ． ６ １ ６
文献标 志码 ： Ａ
文章编 号 ： １ ０ ０ ４ — ８ ４ ５ ６ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ３ － ０ ２ ８ ６ — ０ ６
（ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ａ ｆ ｅ ｔ ｙ Ｒ ｉ ｓ ｋ Ａ ｓ ｓ ｅ ｓ ｓ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｍ ｉ ｎ ｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｈ ｅ ａ ｌ ｔ ｈ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ｅ ｆ ｏ ｒ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ａ ｆ ｅ ｔ ｙ Ｒ ｉ ｓ ｋ Ａ ｓ ｓ ｅ ｓ ｓ ｍ ｅ ｎ ｔ ，Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ １ ０ ０ ０ ２ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
蜡样芽胞杆菌所致的食物中毒
蜡样芽胞杆菌食物中毒1潜伏期呕吐型：30min-5h；腹泻型8h-12h。
2症状呕吐型：以恶心、呕吐为主；腹泻型：以腹痛、腹泻为主。
3可疑食品剩米饭、面条、米粉、酱卤肉、牛(羊)奶等。
尤其是未冷藏，食用前未加热。
4采集标本粪便、肛拭子、呕吐物。
5判定标准符合主要临床表现，生物标本中检出蜡样芽胞杆菌(≥1×10⁵CFU/g或mL),可判定为蜡样芽胞杆菌病。
一、概述蜡样芽胞杆菌食物中毒特点是以毒素中毒为主，同时也可具有感染的机理。
病原体蜡样芽胞杆菌主要于灰尘、蟑螂等昆虫虫体、不洁食具上广泛存在。
食品被污染后，如室温较高，即于食品中大量繁殖，并可引起食物中毒。
中毒多发生在夏秋季节，剩饭、剩菜、凉拌菜等引起者在我国较为常见。
二、病原体蜡样芽胞杆菌是需氧性、有运动力、可产生芽胞的革兰阳性杆菌。
生长6小时后即可形成芽胞。
繁殖体不耐热，生长繁殖的温度范围为28-35℃,10℃以下不能繁殖（低温保存的重要性），在100℃时经20分钟可被杀死，在pH为5以下时对繁殖体的生长繁殖有明显的抑制作用。
1950年，挪威Hauge研究了一次食入甜食后引起的食物中毒，即明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。
本菌在肉汤中生长混浊，不透明，边缘不齐呈扩散状，迎光检视如白蜡膜状。
在血琼脂平板上菌落灰色，如毛玻璃状，有溶血作用; 本菌可水解淀粉和发酵葡萄糖，不发酵甘露醇和鼠李糖，卵磷脂酶阳性，靛基质和硫化氢阴性，可迅速液化明胶。
对氯霉素、红霉素和庆大霉素敏感，青霉素、磺胺嘧啶对本菌无抑制作用。
蜡样芽胞杆菌在发芽的末期可产生引起人类食物中毒的肠毒素，包括腹泻毒素和呕吐毒素。
腹泻毒素系不耐热肠毒素，毒性作用类似大肠埃希氏菌和霍乱弧菌产生的毒素。
腹泻毒素对胰蛋白酶敏感，45℃加热30分钟或56℃加热5分钟均可失去活性，几乎所有的蜡样芽胞杆菌均可在多种食品中产生不耐热肠毒素。
呕吐毒素系低分子耐热肠毒素，126℃加热90分钟也不失活，且对酸、碱、胃蛋白酶、胰蛋白酶均不敏感。
蜡样芽孢杆菌GW-01全基因组测序及生物学特性分析
刘珊，蒋杨丹，颜佶沙，等. 蜡样芽孢杆菌GW-01全基因组测序及生物学特性分析[J]. 食品工业科技，2024，45（7）：167−176. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060031LIU Shan, JIANG Yangdan, YAN Jisha, et al. Whole Genome Sequencing and Biological Characterization of Bacillus cereus GW-01[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(7): 167−176. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023060031· 生物工程 ·蜡样芽孢杆菌GW-01全基因组测序及生物学特性分析刘 珊1,2，蒋杨丹1,2，颜佶沙1,2，谢宇宣1,2，赵思佳1,2，何启田3，赵甲元1,2,*（1.西南土地资源评价与监测教育部重点实验室（四川师范大学），四川成都 610101；2.四川师范大学生命科学学院，四川成都 610101；3.浙江大学生物系统工程与食品工程学院，浙江杭州 310000）摘 要：目的：通过全基因组测序和生物信息学，研究前期筛选可降解高效氯氰菊酯（β-CY ）蜡样芽孢杆菌GW-01的基因组序列信息和生物学特性，为其安全性评估提供参考。
方法：利用HPLC 验证了GW-01降解β-CY 的能力。
GW-01的整个基因组基于二代Illumina NovaSeq 与三代PacBio Sequel 测序平台相结合的测序技术，对菌株GW-01进行全基因组测序，并对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、碳水化合物活性酶预测、毒力因子和抗生素抗性分析，此外，还基于gyrA 基因序列对菌株GW-01构建系统发育树。
临床标本腊样芽孢杆菌的分离及耐药性分析
临床标本腊样芽孢杆菌的分离及耐药性分析关键词腊样芽孢杆菌感染耐药性资料与方法2006～2008年采集从临床各标本中分离的35株腊样芽孢杆菌,其中血液标本8株,胸腹水标本1株,腹泻粪便或呕吐物12株,伤口拭子3株,眼拭子9株,痰标本2株。
每株腊样芽孢杆菌均来自临床不同患者的标本,对同一患者多种标本来源不重复统计。
药敏纸片和培养基:氧氟沙星、红霉素、庆大霉素、青霉素、头孢西丁、呋喃妥因、阿米卡星、利福平、氨苄西林、复方新诺明、头孢唑林、氯霉素、氨苄西林/舒巴坦、药敏纸片(有效期内)。
质控菌株:药敏试验标准菌株为腊样芽孢杆菌ATCC633001,购自中国药品生物制品鉴定所。
菌株鉴定与药敏测试:严格按《全国临床检验操作规程》对送检标本进行分离培养。
先取得在血琼脂培养基上生长良好的可疑菌落采用API-50CH试纸条进行鉴定。
药敏试验以K-B法测定所有菌株对相应抗菌药物的耐药性,观察时间和结果评价依据NCCIS 2002年版本的标准。
结果培养特性:普通肉汤中呈混浊生长,有菌膜。
在血琼脂培养基(温度36℃,pH7.4)上生长良好,培养24小时,菌落融合成一片,不透明,灰白色,表面粗糙,边缘不整齐似毛玻璃状、白腊状、呈β溶血。
形态及染色:革兰阳性大杆菌,芽孢呈卵圆形,不突出菌体,菌体两端较平整,多数呈链状排列。
生化反应:触酶、动力、麦芽糖、N-乙酰葡萄糖胺、核糖、七叶灵、淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖、硝酸盐还原、枸橼酸盐、海藻糖、明胶液化、V-P试验均为阳性,靛基质、H2S、甘露醇、甲基红、尿素酶、肌醇、阿拉伯糖、乳糖、木糖、菊粉、鼠李糖、山梨醇、卫茅醇、测金盏花醇试验均为阴性,符合腊样芽孢杆菌生物学特性。
抗菌药物体外敏感试验:35株腊样芽孢杆菌对13种常见抗菌药物耐药率为:氧氟沙星13.6%、庆大霉素13.6%、阿米卡星11.4%,耐药率均<15%,抗菌活性较好且价格适中,可以考虑为经验用药的首选;青霉素类、头孢菌素类抗菌药物,如头孢西丁(86.3%)、青霉素(81.8%)、氨苄西林(79.5%) 、头孢唑林(79.5%)、呋喃妥因(77.3%)耐药率均达75%以上,不应作为经验用药的选择。
乳粉中蜡样芽胞杆菌检验能力评价结果分析
乳粉中蜡样芽胞杆菌检验能力评价结果分析李沅镁，苏妙仪，严家俊，黄宝莹广东产品质量监督检验研究院，广东佛山 528300摘 要：[目的]本实验室参加2022年国家市场监督管理总局食品安全抽检监测司组织的“奶粉中蜡样芽胞杆菌检验能力评价”，对检测结果进行评价分析。
[方法]对样品编号为NFLY-13、NFLY-17两个乳粉样定量检测。
按照作业指导书、《GB 4789.14—2014 食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》（第一法）对样品检验，用蜡样芽胞杆菌显色培养基、VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对试验数据进行比对。
[结果]检测与比对结果基本一致。
[结论]两个考核样品检测结果获满意评价。
关键词：能力评价；蜡样芽胞杆菌；方法比对；质量控制文章编号：1671-4393（2023）05-0055-05 DOI:10.12377/1671-4393.23.05.120 引言蜡样芽胞杆菌是一种革兰氏阳性产芽孢的杆菌，是引起食源性疾病暴发的主要致病菌之一，而食源性致病菌引起的食品安全问题一直是全球头号食品安全问题[1]。
蜡样芽胞杆菌在婴幼儿配方乳粉、辅食及生产加工多环节均有不同程度检出[2]。
在婴幼儿配方乳粉监督抽检任务中，蜡样芽胞杆菌是非常重要的一项风险监测项目，政府已加强对婴幼儿配方食品的重点监督[3]。
在《GB 4789.14—2014食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》中，蜡样芽胞杆菌检验用的是MYP平板[4]，由于利用卵磷脂酶分解培养基中的卵黄产生较大的沉淀环，导致菌落间蔓延连接而难以计数。
有研究发现，蜡样芽胞杆菌显色培养基与传统平板（MYP）可达相同检测限和灵敏度，具较高特异性[5]，因此用显色培养基平板比对试验。
国内外对蜡样芽孢杆菌检测，主要有传统检测方法、免疫学检测方法、实时荧光PCR方法等[6]。
蜡样芽孢杆菌毒力因子及防治措施
doi：10.19369/ki2095—9737.2020.04049蜡样芽苞杆菌毒力因子及防治措施王洪华】，王荣芳】，毛景东2'（1.内蒙古通辽市开鲁县种畜场动物防疫监督管理站，内蒙古通辽0284002.内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽028042）摘要：蜡样芽胞杆菌是一种重要的食源性条件致病菌，可引起肠道感染，亦可造成局部组织和全身性感染$近年来，国内外出现多例临床报道由蜡样芽胞杆菌引起的类似炭疽样感染，值得5起养殖业的研究重视。
总结了蜡样芽胞杆菌主要的毒力因子，为科研人员的研究提供一定理论基础，同时对蜡样芽胞杆菌的防治提出了建议，以期为广大畜牧从业者提供参考。
关键词：蜡样芽胞杆菌；毒力因子；防治措施中图分类号：S852.61+6文献标识码：B文章编号：2095—9737（2020）04—0082—021蜡样芽抱杆菌基本特征蜡样芽抱杆菌属于芽抱杆菌属，与炭疽芽抱杆菌、苏云金芽抱杆菌等密切相关的物种共同组成了蜡样芽抱杆菌群1。
其中，炭疽芽抱杆菌因其对人和家畜的强致病性而被广泛关注；苏云金芽抱杆菌因其对昆虫的致病性，已广泛商业化用作害虫防治的生物农药$蜡样芽抱杆菌最初分离自牛舍中，且发现该细菌可以快速传播，常以单细胞形式出现,偶尔可呈线状$在二十世纪后期，蜡样芽抱杆菌被认定为引发食物中毒的常见污染源。
近年来，蜡样芽抱杆菌引发人和动物的局部及全身性感染也出现了多次报道$蜡样芽抱杆菌为革兰氏阳性，无荚膜，产芽抱，菌落较大，表面粗糙呈不规则状，基因组大小在5.2〜5.5Mb之间。
2蜡样芽抱杆菌毒力因子2.1外毒素蜡样芽抱杆菌的各种外毒素都与致病性相关，但这些外毒素在胃肠道疾病及其它组织器官感染中发挥的具体作用还未完全阐释清楚$目前，已证实有4种蜡样芽抱杆菌的外毒素与感染相关，其中包括3种穿孔性肠毒素：Nhe,—种非溶血性肠毒素，最早鉴定于挪威的一次食源性感染病例；Hbl,溶血性肠毒素，其毒性已在感染家兔的实验中得到证实；CytK,单一蛋白细胞毒素，最初从导致出血性腹泻的蜡样芽抱杆菌中鉴定得到$虽然这3种毒素可在动物或人食入经蜡样芽抱杆菌抱子污染的食物后引起肠道感染，但它们可能与其他毒力因子共同发挥作用，因此很难预测特定菌株的肠毒素潜在毒力$在体外研究中，Nhe、Hbl和CytK对Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）、Ca- co2细胞（人克隆结肠癌细胞）等多种细胞均显示出一定的细胞毒性，且各细胞系对不同毒素表现出了敏感性差异，这也证明了各毒素间不同的作用方式$第四种毒素即呕吐毒素（cereulide）,ceu eulide是一种二肽毒素，由交替的a—氨基酸和a —径基酸组成。
食品中蜡样芽孢杆菌的研究进展
食品中蜡样芽孢杆菌的研究进展
张伟伟;鲁绯;张金兰;汪建明;高丽华
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2010(000)005
【摘要】蜡样芽孢杆菌是常见食品污染菌,其产生的毒素可引起食物中毒.文中概述了蜡样芽孢杆菌的生物学特性、致病性、安全性、检测方法、食品中的限量标准及其控制方法.有效地控制该菌在食品中的污染,保护公众健康.
【总页数】4页(P1-4)
【作者】张伟伟;鲁绯;张金兰;汪建明;高丽华
【作者单位】天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457;北京市食品酿造研究所,北京,100050;北京市食品酿造研究所,北京,100050;天津科技大学,食品工程与生物技术学院,天津,300457;北京市食品酿造研究所,北京,100050
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
【相关文献】
1.生鲜食品中蜡样芽孢杆菌毒力基因及耐药性研究 [J], 田万帆;张荣;龙虎;柳琳;贺苏皖;杜玄;蒋敏;赵悦;唐俊妮
2.乳制品及婴幼儿配方食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测 [J], 刘新梅;程逸宇;张弛;方昕;高翔;朱荣;杨军
3.食品中蜡样芽孢杆菌平板计数的不确定度评定 [J], 吴卫玲;胡同静;钟君杰;徐振东
4.食品中蜡样芽孢杆菌芽孢EMA-qPCR检测 [J], 刘新梅;程逸宇;吴海晶;任敏;冯秋实;杨军
5.餐饮食品中蜡样芽孢杆菌的实时荧光PCR检测方法研究 [J], 柯振华
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蜡样芽胞杆菌在不同标本中的毒力基因分布特征张慧娟; 张恩民; 贺金荣; 李伟; 魏建春【期刊名称】《《中国人兽共患病学报》》【年(卷),期】2019(035)008【总页数】5页(P683-687)【关键词】蜡样芽胞杆菌; 毒力基因; 疾病相关标本; 分布特征【作者】张慧娟; 张恩民; 贺金荣; 李伟; 魏建春【作者单位】传染病预防控制国家重点实验室中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京 102206【正文语种】中文【中图分类】R378.8蜡样芽胞杆菌(简称蜡样杆菌)在自然界广泛分布，常存在于土壤、灰尘和昆虫中，植物和许多生熟食品中也常见，临床上该菌被认为是一种机会致病菌常引起食源性疾病，也被认为是一种污染菌引发外伤性眼内炎、骨科创面感染以及在肿瘤等免疫低下人群中引起院内感染等肠道外感染疾病[1]。
研究表明，无论是肠道内还是肠道外感染，发病均与该菌分泌的毒素导致组织破坏或胞外酶活性产物有关，编码这些毒素的毒力基因主要包括溶血性BL基因(hblC、hblD、hblA、hblB)、非溶血性基因(nheA、nheB、nheC)、肠毒素FM基因和T 基因(entFM、bceT)、细胞毒素K基因(cytK)和呕吐毒素相关基因(ces)[2]。
但并不是所有蜡样杆菌都含有全部毒力基因，而是存在菌株间的差异，不同的毒力基因分布与疾病的严重程度呈相关性[3]。
我国部分地区已在食品的常规监测中开展了蜡样杆菌的污染与毒力基因的检测工作，本研究中采集了我国12个省的不同分离来源的标本进行了毒力基因的检测，以期深入了解临床相关蜡样杆菌的遗传分布特征，为相关疾病的诊断处置提供科学的参考依据。
1 材料与方法1.1 菌株菌株包括分离自中国河北、海南、云南、内蒙、四川、陕西、福建等12个省的蜡样杆菌330株和购买的模式菌株3株(ATCC10876、ATCC13061和CMCC63301)，分离来源分为环境监测标本(常规食品微生物监测及土壤)和疾病相关标本(食物中毒食品及肠道外感染)2大类，具体包括米粉(96株)、奶粉(125株)、土壤(92株)、米饭(8株)、凉皮(5株)、眼内炎(2株)或肿瘤患者(2株)等6种标本，所有菌株均由本室保存。
1.2 毒力基因检测1.2.1 合成引物针对上述的11个蜡样杆菌可能含有的毒力基因，参考文献检索引物序列[4-5]，每对引物经NCBI Blast比对验证，确为相应毒力基因片段，引物合成由北京天一辉远生物科技有限公司完成，引物序列及扩增片段长度见表1。
1.2.2 PCR扩增常规煮沸法制备菌株DNA模板，普通酶链聚合反应(PCR)方法扩增所有毒力基因片段，同时设立阳性和阴性对照。
PCR反应体系为25 μL，包括2×EasyTaqTM PCR SuperMix(购自北京全式金生物技术有限公司)12.5 μL，上下游引物各1 μL(浓度10 μM)，DNA模板1 μL(浓度为100 ng/μL左右), 加无菌超纯水补足至25 μL。
PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min, 55 ℃退火1 min, 72℃延伸1 min,共30循环；72 ℃最后延伸5 min，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
表1 本研究检测毒力基因所用引物Tab.1 Primers for virulence genes ofB.cereus基因引物引物序列(5′-3′)长度/bphblAHA-FTTACCTGGTAGAATCGTA-CAAGATC164HA-RCCTGTATTAATCGCTTCTACCAT-TGhblBHB-FAAGCAATGGAATACAATGGG2 685HB-RAATATGTCCCAGTACACCCGhblCHC-FCCTATCAATACTCTCGCAA695HC-RTTTCCTTTGTTATACGCTGChblDHD-FACCGGTAACACTATTCATGC830HD-RGAGTCCATATGCTTAGATGCnheANA-FGTTAGGATCACAATCACCGC756NA-RACGAATGTAATTTGAGTCGCnheBNB-FGTGCAGCAGCTGTAGGCGGT328NB-RATGTTTTTCCAGCTATCTTTCG-CAATnheCNC-FTGGATTCCAAGATGTAATG684NC-RATTACGACTTCTGCTTGTGCcesNrps-FGACAAGAGAAATTTCTACGAG-CAAGTACAAT635Nrps-RGCAGCCTTCCAATTACTCCTTCT-GCCACAGTbceTBceT-FGACTACATTCACGATTACG-CAGAA304BceT-RCTATGCTGACGAGCTACATCCATAentFMentFM-FGTTCGTTCAGGTGCTGGTAC486entFM-RAGCTGGGCCTGTACGTACTTcytKcytK-FCGACGTCACAAGTTGTAACA565cytK-RCGTGTGTAAATACCCAGTT1.3 结果分析采用SPSS21.0软件，检验水准为α=0.05统计菌株检测阳性毒力基因的数量，单因素方差分析不同标本毒力基因数的差异；计算菌株不同毒力基因的携带率，行×列资料卡方检验分析不同标本毒力基因携带率的统计学差异。
2 结果2.1 菌株毒力基因携带情况 333株蜡样杆菌11种毒力基因的检测结果显示，菌株所含毒力基因数量最少0个(30株，占9.01%)，最多10个(41株，占12.31%)，含4个毒力基因的菌株数量最多，占19.22%，其次是5个(16.82%)和9个(16.22%)，菌株平均携带毒力基因数5.97个。
90.99%(303/333)的菌株检出至少含有1个毒力基因，毒力基因在3个以上的菌株占到88.29%(225/333)，含有5个毒力基因以上的菌株占67.57%(294/333)，除呕吐毒素基因外，全部10个毒力基因均检出的菌株占12.31%(41/333)(图1)。
图1 菌株携带毒力基因个数Fig.1 Distribution of gene numbers of studied strains2.2 不同类型标本毒力基因数量比较常规食品监测的米粉和奶粉中毒力基因个数分别为5.78和5.71个，而在病例相关采集标本的米饭、凉皮和患者中基因个数分别达到了7.13，8.2和8.75个，均高于平均值，方差分析显示，6种样品的毒力基因携带数量之间无统计学显著差异(F=1.917，P>0.05)，但两两比较显示，患者与奶粉的基因个数统计学差异有显著性(F=5.482，P<0.05)，凉皮与奶粉间有统计学差异显著性(F=4.479，P<0.05)，其他类型样品两两间无统计学差异(表2)。
2.3 不同类型标本毒力基因携带率比较毒力基因中非溶血性基因携带率最高，同时含有3种非溶血性基因(nheA、nheB、nheC)的菌株占61.86%，至少含有一种此基因的菌株则达89.19%；其余基因携带率从高到低依次为entFM基因(79.88%)、bceT基因(49.85%)、溶血性BL基因(48.35%)、ctyK基因(47.75%)和ces基因(1.50%)。
其中，溶血性基因中hblB携带率较低(38.14%)，其他3种(hblA、hblC和hblD)携带率较高。
表2 不同样本类型蜡样杆菌毒力基因携带情况Tab.2 Distribution of virulence gene numbers of B.cereus in different specimens样品类型样品数毒力基因平均数米粉965.78奶粉1255.71土壤926.22米饭87.13凉皮58.2患者48.75合计3305.97不同类型标本毒力基因的携带率之间有差异，将样本数较低(凉皮、眼内炎和肿瘤患者)的标本除外，其余标本的各基因携带率比较显示，米饭、米粉、奶粉和土壤的溶血性基因携带率有统计学差异显著性(χ2=15.071，P<0.01)，米粉和奶粉的携带率较低，土壤携带较高；而非溶血性基因则在土壤中携带较低，其它标本中较高(χ2=9.603，P<0.05)；entFM基因也在土壤中较低，其它标本中较高(χ2=21.634，P<0.01)；cytK、bceT和ces基因在不同标本中的携带率均无统计学差异显著性(表3)。
将样本数较少的标本合并，比较疾病相关与环境监测两类标本的毒力基因携带情况，表4显示溶血性基因在疾病标本中携带较高，有统计学差异(χ2=8.23，P<0.01)，其余基因在两类标本中的携带率无统计学差异。
3 讨论蜡样杆菌作为一种重要的食源性疾病病原菌，在食品中的污染状况和毒力基因分布近年来被广泛关注。
研究数据显示，食品中的蜡样检出率多在10%以上，婴幼儿食品和奶粉中在10%～30%，熟制米面制品中在20%～30%左右，在快餐盒饭、铁路食品及市场摊点中污染更重，有的可达50%[6-10]，腐乳类食品和大米中的蜡样检出率可高达80%[11-12]。
同时，医院内感染中，在开放性创伤的患者伴免疫力低下人群中蜡样杆菌的分离率较高，眼内炎也较多见，外伤所致的细菌性眼内炎中蜡样芽胞杆菌感染率仅次于金黄色葡萄球菌，位居第2，并且进展迅速，急骤恶化，可造成视网膜毁灭性损害[13]，是医院感染中不可忽视的一种重要病原菌。
表3 各毒力基因在不同类型标本中的分布Tab.3 Distribution of virulence genes of B.cereus in different specimens基因总携带率(n=333)不同类型标本的基因携带率(%)凉皮(n=5)米饭(n=8)米粉(n=96)奶粉(n=125)土壤(n=92)眼内炎(n=2)肿瘤患者(n=2)其他(n=3)hblC48.35(161)80(4)62.5(5)38.54(37)38.4(48)67.39(62)100(2)100(2)33. 33(1)hblD46.85(156)80(4)75(6)38.54(37)38.4(48)60.87(56)100(2)100(2)33.33(1)hblA45.65(152)80(4)62.5(5)38.54(37)36(45)60.87(56)100(2)100(2)33.33(1) hblB38.14(127)80(4)37.5(3)32.29(31)31.2(39)50(46)100(2)50(1)33.33(1)同时含4个hbl37.24(124)80(4)37.5(3)32.29(31)29.6(37)48.91(45)100(2)50(1)33.33(1)含任一hbl48.35(161)80(4)75(6)38.54(37)36.8(46)68.48(63)100(2)100(2)33.33(1)nhe A84.38(281)100(5)100(8)83.33(80)87.2(109)80.43(74)50(1)100(2)66.67(2)nh eB72.37(241)80(4)87.5(7)78.13(75)81.6(102)52.17(48)100(2)100(2)33.33(1)n heC82.28(274)100(5)100(8)86.46(83)86.4(108)69.57(64)100(2)100(2)66.67(2)同时含3个nhe61.86(206)80(4)87.5(7)67.71(65)68(85)44.57(41)50(1)100(2)33.33(1)含任一nhe89.19(297)100(5)100(8)90.62(87)93.6(117)80.43(74)100(2)100(2)66.67(2) ctyK47.75(159)60(3)50(4)48.96(47)36.8(46)60.87(56)50(1)50(1)33.33(1)ces1. 50(5)00(0)1.04(1)3.2(4)0(0)0(0)0(0)0.00entFM79.88(266)100(5)87.5(7)87.5(84)87.2(109)59.78(55)100(2)100(2)66.67( 2)bceT49.85(166)60(3)50(4)44.79(43)44.8(56)59.78(55)50(1)100(2)66.67(2) 注：n表示样本总数，括号内数字表示相应基因扩增阳性数。