蛋白质芯片技术及其应用
蛋白质芯片
蛋白质芯片
蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。
蛋白质芯片的原理蛋白芯片技术的研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列。
体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持。
目前蛋白芯片主要有三类：蛋白质微阵列；微孔板蛋白质芯片，适合蛋白质的大规模、多种类的筛选；
蛋白质芯片的应用
用于基因表达的筛选
特异蛋白质的筛选及研究
性抗原抗体的检测
生化反应的检测
药物筛选
疾病诊断
它具有以下优点：
1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析
2. 同时快速发现多个生物标记物
3. 小量样品(as few as 2000 cells for LCM samples)
4. 高通量的验证能力（with 1000s of samples a month）
5. 发现低丰度蛋白质
6. 测定疏水蛋白质: 与“双相电泳加飞行质谱”相比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白质
7. 在同一系统中集发现和检测为一体特异性高利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。
蛋白质芯片的原理及应用
蛋白质芯片的原理及应用蛋白质芯片（Protein microarray）是一种基于高通量技术的生物芯片，用于检测和研究蛋白质在生物样本中的相互作用和功能。
这种芯片可以同时测试上千种蛋白质的相互作用，具有高灵敏度、高效率和高通量的特点，成为生物医学和生物化学领域的重要工具。
蛋白质芯片的基本原理是将蛋白质分子定向固定在芯片表面，利用特定的探针与这些固定的蛋白质相互作用，通过检测这些相互作用来研究蛋白质的功能和相互关系。
下面将从芯片制备、实验步骤以及应用领域三个方面详细介绍蛋白质芯片的原理和应用。
1.芯片制备：蛋白质芯片的制备需要首先选择目标蛋白质，并克隆、表达和纯化这些目标蛋白质；然后将纯化得到的蛋白质标记上非放射性示踪剂，如荧光染料或酶；接下来，将标记后的蛋白质溶液滴在玻璃片或硅片上，并干燥形成固相阵列；最后，在固相阵列的表面上进行一系列的化学修饰，形成蛋白质芯片。
2.实验步骤：使用蛋白质芯片进行实验一般包括以下几个步骤：首先，先将芯片表面进行预处理，以去除非特异性的背景信号；然后，将待测样品或探针标记的配体加入芯片孔中，与芯片上的固相蛋白质进行反应；接下来，将芯片进行洗涤，去除无特异性结合的物质；最后，使用合适的检测方法，如荧光、酶反应等进行信号检测和定量分析。
3.应用领域：蛋白质芯片广泛应用于生物医学和生物化学领域，以下是几个典型的应用领域：(1)蛋白质相互作用研究：蛋白质芯片可以快速、平行地测定蛋白质与其他蛋白质、核酸或化合物之间的相互作用，有助于揭示蛋白质在细胞信号传导、代谢途径和疾病发生中的作用机制。
(2)药物筛选和靶点识别：蛋白质芯片可以用于大规模的药物筛选，通过检测药物与蛋白质间的相互作用来筛选潜在的药物靶点和药物候选化合物。
这在新药研发中具有重要意义。
(3)诊断和预后标志物鉴定：蛋白质芯片可用于发现和鉴定疾病相关的生物标志物，通过检测患者血清中某些蛋白质的表达水平变化，可以进行疾病的早期诊断、治疗预后评估等。
《蛋白质芯片技术》课件
蛋白质芯片技术将蛋白质的检测和分析提升到了一个全新的水平。本课件将 介绍蛋白质芯片技术的定义、背景和应用领域。
蛋白质芯片技术的原理和工作原理
1
蛋白质捕捉
使用特定的探针将目标蛋白质捕捉在
蛋白质检测
2
芯片表面。
通过不同的检测方法（如质谱法和光
学传感器），定量和鉴定捕获的蛋白
质。
3
数据分析
蛋白质芯片技术的未来发展方向
1
高通量筛选
加速药物筛选过程，发现更多具有潜力的药物靶点。
2
疾病标志物发现
通过广泛的蛋白质组学分析，发现新的疾病标志物，促进早期诊断和治疗。
3
个性化医疗
结合基因组学和蛋白质组学，实现个体化的医疗方案。
总结和展望
蛋白质芯片技术的发展为蛋白质研究和生物医学领域带来了巨大的机遇和挑 战。我们期待在未来看到更多创新和突破。
高通量、高灵敏度、精准定量、并行分析多种蛋白质。
2 挑战
技术复杂性、芯片设计和制备的困难、数据分析的挑战。
蛋白质芯片技术的最新研究进展
单细胞蛋白质芯片
实现对单个细胞中蛋白质 的高通量检测。
多组学整合
将蛋白质芯片技术与基因 组学、转录组学等多个组 学领域进行整合。
微流控芯片
通过微型流体控制，在芯 片上实现更复杂的蛋白质 反应和分析。
对蛋白质芯片产生的海量数据进行分 析和解读，从中发现关键的生物学信 息。
蛋白质芯片技术的应用领域
癌症研究
药物研发
通过分析肿瘤标记物等蛋白质， 提供个体化的治疗方案。
加速药物靶点的鉴定和药效评 估，提高药物研发效率。
Байду номын сангаас
蛋白质芯片技术
蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术（Protein Microarray Technology）是一种高通量蛋白质分析技术，它使用了类似于DNA芯片的方法，将大量的蛋白质样品固定在玻璃板或硅片上，并通过检测分析蛋白质与其他分子的相互作用，实现对蛋白质功能和相互作用网络的研究。
蛋白质芯片技术的原理是将蛋白质样品以阵列的形式固定在芯片上，然后通过添加不同的检测试剂，可以对蛋白质样品进行鉴定和分析。
常用的固定方法有基于化学反应或机械固定等。
蛋白质芯片技术主要有两种类型，一种是功能蛋白芯片，另一种是相互作用蛋白芯片。
功能蛋白芯片是将蛋白质样品固定在芯片上，然后通过添加特定的底物和检测试剂，可以对蛋白质的功能进行分析。
例如，可以通过测量底物与蛋白质的结合以及反应产物的生成来确定蛋白质的酶活性。
这种芯片技术可以广泛应用于蛋白质酶活性、底物特异性和抑制物筛选等领域的研究。
相互作用蛋白芯片则是将蛋白质样品固定在芯片上，并与其他分子（如抗体、小分子化合物等）进行相互作用实验。
例如，可以将抗体或其他相互作用分子固定在芯片上，然后通过检测蛋白质样品与抗体的结合来确定抗体的特异性和亲和力。
这种芯片技术可以广泛应用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-抗体、蛋白质-药物相互作用等领域的研究。
蛋白质芯片技术具有以下几个优点：首先，它可以同时分析大量的蛋白质样品，具有高通量性能。
这对于研究复杂的蛋白质功能和相互作用网络非常有用。
其次，蛋白质芯片技术对样品的需求量较小，可以节省宝贵的蛋白质样品，并可以使用多种不同的检测试剂进行分析。
此外，蛋白质芯片技术的操作相对简便，可以快速进行实验，并可以大大提高实验效率。
蛋白质芯片技术在生物医药研究和临床诊断中具有广泛的应用前景。
例如，在药物研发中，可以利用蛋白芯片技术进行靶点筛选、药物靶点鉴定和药物相互作用研究。
在生物标志物鉴定和诊断中，可以通过蛋白质芯片技术对体液中的蛋白质进行快速高通量的分析，从而实现对疾病的早期诊断和预防。
蛋白质芯片技术研究及应用
蛋白质芯片技术研究及应用近年来，蛋白质芯片技术在生命科学领域研究中扮演越来越重要的角色。
蛋白质是组成细胞的重要基础，存在于细胞的各个组分中，包括核糖体、线粒体、内质网等。
蛋白质芯片技术能够对蛋白质进行高通量分析和筛选，能够为研究蛋白质结构和功能提供重要的支持和帮助。
本文将介绍蛋白质芯片技术的基本原理、发展历程、应用领域以及未来的发展趋势。
一、蛋白质芯片技术的基本原理蛋白质芯片技术基于DNA芯片技术的基础上，采用微阵列技术制备出数千到数百万种蛋白质的阵列芯片，通过特异性结合的方法检测样品中的蛋白质分子。
其基本原理类似于ELISA法，但在ELISA法中，检测蛋白质需要用到特异性的抗体，而蛋白质芯片技术则是利用特异性的配体（如抗体、酶、选择性结合因子等）对蛋白质进行特异性识别和检测。
二、蛋白质芯片技术的发展历程蛋白质芯片技术起源于上世纪90年代，最早由美国的Affymax公司和Genentech公司研发而来。
最初只是在微阵列技术基础上对蛋白质进行筛选，后来随着科技的发展，蛋白质芯片技术发展成为一种高通量、能够同时检测多种蛋白质的技术。
目前，蛋白质芯片技术已经成为快速筛查疾病诊断、病原体检测和药物筛选等领域中的重要手段。
三、蛋白质芯片技术的应用领域3.1 疾病诊断蛋白质芯片技术在医学领域中的应用越来越广泛。
对于一些蛋白质变化与疾病相关的情况下，利用蛋白质芯片技术进行快速定量检测、疾病诊断和疾病预测，具有极高的灵敏度和特异性。
3.2 药物筛选蛋白质芯片技术可以应用在药物筛选和新药研发中。
在药物筛选中，比较不同药物分子的相互作用性能，选取作用效果最好、最适合治疗特定疾病的药物。
同时，蛋白质芯片技术也能够对药物通量、结合常数以及与靶标的特异性等进行快速检测。
3.3 生命科学在生命科学领域中，蛋白质芯片技术也被广泛应用。
例如，在分离和鉴定蛋白质互作关系、研究蛋白质结构与功能、为体外抗体生产提供高通量筛选手段等方面发挥着重要作用。
蛋白质芯片的定义与应用
蛋白质芯片的定义与应用
蛋白质芯片是一种高通量的蛋白质分析工具，它采用微阵列技术，基于对大量蛋白质的识别和相互作用，可以快速、准确地检测和鉴定
蛋白质，从而应用于生物医学、生物化学、食品安全等领域。
在生物医学领域，蛋白质芯片的应用十分广泛。
例如，研究人员
可以利用蛋白质芯片快速筛选大量候选药物，以找到最有效的药物，
从而缩短开发周期和成本；另外，蛋白质芯片也可以帮助医生对某些
疾病进行早期诊断和预测，如肿瘤、心血管疾病等。
在食品安全检测
方面，蛋白质芯片也可以检测食品中的有害物质，如病毒、细菌、重
金属等，保障人们的健康。
蛋白质芯片的应用还包括基因表达分析、蛋白质互作分析、免疫
诊断等方面。
它具有灵敏度高、精度高、可重复性好、自动化程度高
等优点，可以大幅提高蛋白质研究的效率和准确性。
另外，蛋白质芯片的设计和制造涉及了多种技术，如光刻、微流控、化学修饰等，需要进行交叉学科的合作，使得该领域的发展也具
有广泛的科学研究价值。
在设计和制造蛋白质芯片时，需要充分考虑实际应用需求和样品
特性，选择适合的探针、制备技术和数据处理方法等，使得芯片具有
可操作性和可重复性等基本特征。
总之，蛋白质芯片的应用十分广泛，是当前蛋白质研究领域的热点和前沿技术之一。
未来，蛋白质芯片将继续发挥重要作用，并不断迎接新挑战。
蛋白质芯片技术在前列腺癌诊断中的应用
蛋白质芯片技术在前列腺癌诊断中的应用引言：前列腺癌是男性高发的一种恶性肿瘤，及早发现和诊断对于治疗和预后至关重要。
然而，目前传统的前列腺癌诊断方法存在一些局限性，如低灵敏度和特异性。
近年来，蛋白质芯片技术的发展为前列腺癌的早期诊断提供了新的希望。
本文将介绍蛋白质芯片技术在前列腺癌诊断中的应用，并探讨其优势和挑战。
一、蛋白质芯片技术的原理和优势蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质分析方法，可以同时检测和鉴定数百种蛋白质。
其原理是将不同的蛋白质固定在芯片上的特定位置，并通过特异性抗体结合来检测样本中的蛋白质。
蛋白质芯片技术具有以下优势：1. 高灵敏度：蛋白质芯片技术可以检测到低浓度的蛋白质，对于前列腺癌早期标志物的检测具有很大的优势。
2. 高特异性：蛋白质芯片技术可以通过特异性抗体的选择来检测特定的蛋白质，从而提高诊断的准确性和特异性。
3. 高通量：蛋白质芯片技术可以同时检测多个蛋白质，大大提高了诊断效率和成本效益。
二、蛋白质芯片技术在前列腺癌诊断中的应用1. 前列腺癌标志物的筛选：蛋白质芯片技术可以通过筛选大量的前列腺癌标志物来寻找新的生物标记物，从而提高前列腺癌的早期诊断率。
2. 前列腺癌亚型的鉴定：蛋白质芯片技术可以通过检测不同亚型的蛋白质表达水平来鉴定前列腺癌的亚型，从而为个体化治疗提供依据。
3. 评估治疗效果：蛋白质芯片技术可以通过检测治疗前后患者血清中蛋白质表达的差异来评估治疗的效果，为治疗方案的调整提供依据。
三、蛋白质芯片技术在前列腺癌诊断中的挑战尽管蛋白质芯片技术在前列腺癌诊断中具有很大的潜力，但也面临一些挑战：1. 样本的获取和处理：蛋白质芯片技术需要大量的样本进行测试，而前列腺癌患者的样本获取和处理存在一定的困难。
2. 数据分析和解读：蛋白质芯片技术产生的数据量大且复杂，需要借助生物信息学和统计学等方法进行数据分析和解读。
3. 标准化和验证：蛋白质芯片技术的标准化和验证是一个复杂的过程，需要建立统一的标准和验证方法，以确保结果的准确性和可靠性。
蛋白质芯片在临床中的应用
一蛋白质芯片技术的原理蛋白质芯片定义蛋白质芯片又可以称为蛋白质微阵列，是指高密度的蛋白质阵列，是蛋白质阵列的发展，通常在几平方厘米的面积上可以包含几万个不同的蛋白质质点，用于蛋白质特定分析。
蛋白质芯片的原理蛋白质芯片是根据实验的目的选择特定的蛋白质按照有序的顺序固定在玻片、凝胶、微孔板等各种载体上形成的密集蛋白质阵列，就好比现在军人按照某种战斗序列列成的方阵。
然后利用芯片上蛋白质与特定蛋白质抗体或其他成分相互作用，经过漂洗等一系列处理得到所需的结果，然后利用荧光分析或激光聚焦扫描等手段对结果进行分析，得到所需要的数据。
蛋白质芯片的发展历史当人们对生物分子的研究进入基因水平阶段后，人们迫切的需要知道基因的特定排列及此种排列会长生何种作用结果、生命活性，很多新的技术应运而生，生物芯片技术就是其一，其起步阶段有很大不方便及缺点，但是随着进入后基因组时代后，生物芯片技术不断完善，已经被运用到生命科学的各个领域，然而对基因的研究不能很好的实现对细胞功能的了解，众所周知，细胞的生命活动的主要体现着及执行者是各种功能结构蛋白，因此对蛋白质序列功能的分析变成了最重要的研究方向。
人们根据对基因芯片的发展提出了蛋白质芯片的概念及尝试，进而出现的蛋白质芯片技术。
蛋白质芯片的分类根据用途的不同蛋白质芯片可以分为蛋白质功能芯片，进行蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA，蛋白质-酶等功能的研究；蛋白质检测芯片，识别检测样品中目标多肽、蛋白质、抗原。
根据芯片表面化学成分不同可以分为化学表面芯片：疏水芯片、亲水芯片、弱阳离子交换芯片、强阴离子交换芯片等；生物表面芯片：抗体-抗原芯片、受体-配体芯片、DNA-蛋白质芯片等。
根据载体不同可以分为玻璃载体芯片、多孔凝胶覆盖芯片、微孔芯片。
蛋白质芯片的特点可以直接用于粗生物样品进行分析，不需要像基因芯片那样进行序列分析；可以发现多个生物标记，因为蛋白质微阵列排列紧密，可以同时进行多个目的的测定；特异性高，具有较强的针对性等。
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蛋白质芯片技术及其应用
发表时间：2016-05-24T14:14:25.390Z 来源：《医师在线》2016年1月第2期作者：布威海丽且姆·阿巴拜科日奥布力喀斯木·图尔荪[导读] 新疆维吾尔医学专科学校蛋白质芯片技术是研究蛋白质组的新技术，是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。
(新疆维吾尔医学专科学校新疆维吾尔 848000)
摘要：蛋白质芯片技术是研究蛋白质组的新技术，是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。
该技术在对基因表达、抗原抗体检测、药物开发、疾病诊断等研究方面显示出快速、高效、高通量处理信息的能力。
它不仅是蛋白质组学研究中强有力的工具，也是临床应用中疾病早期诊断、预后和治疗效果评测的新手段，其研究成果拓展了与人类健康更加贴近的应用领域。
本文主要讲述了蛋白质芯片技术的原理和分类、制作、蛋白质芯片检测、及其在研究中的应用及前景进行了阐述。
关键词：蛋白质芯片、疾病诊断、应用。
1 蛋白质芯片技术
蛋白质芯片又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，它是将大量的蛋白质、蛋白质检测试剂或检测探针作为配基以预先设计的方式固定在玻片、硅片或纤维膜等固定载体上组成密集的阵列，能够高通量地测定蛋白质的生物活性、蛋白质与大分子和小分子的相互作用，或者用于高通量定性和定量检测蛋白质。
2 蛋白质芯片的分类及检测方法
蛋白质芯片是一种高通量、微型化、自动化的蛋白质分析技术，根据其结合被测蛋白的介质不同，可以大致分为两大类:化学型蛋白质芯片和生物化学型蛋白质芯片[1]。
2.1 化学型蛋白质芯片该类芯片的构想来源于经典色谱的介质，芯片上所铺的介质可通过疏水力、静电力、共价键等结合被测样品中的蛋白质，然后用特定的洗脱液去除杂质蛋白而保留感兴趣者。
其缺点是特异性较差，但目前仍占已商品化并得到广泛应用的蛋白质芯片中的大部分。
这一方法具有样品用量小、操作简便、灵敏度高、高通量等优点。
2.2 生物化学型蛋白质芯片该类芯片的基本原理是将已知的生物活性分子(如抗体、受体、配体、核酸等) 结合到芯片表面，来俘获样品中的靶蛋白。
由于生物活性分子的多样性和高度特异性，所以其应用范围和前景都明显优于化学型蛋白质芯片。
但由于蛋白质比DNA 难合成，更难于在固相支持物表面合成，且定位于固相载体表面的蛋白质容易因空间构象的改变而失活，造成了该类芯片的开发应用与商品化落后于化学型芯片。
2.3 蛋白质芯片的检测方法
目前在蛋白质芯片检测中应用最广的是荧光染料标记，原理较为简单、使用安全、敏感性高，且有很好的分辨率[2]。
用荧光染料Cy3或Cy5直接标记待检测的蛋白质，或用荧光染料标记该蛋白质的二抗，和芯片上的蛋白质结合后，用激光扫描和CCD照相技术对激发的荧光信号检测，用计算机和相应的软件系统进行分析。
对于低丰度的蛋白质样品来说，荧光和化学发光的检测方法的灵敏度低，近年来出现的滚环扩增方法对捕获的蛋白质的检测达到了飞摩尔的量级，有望改善荧光检测的灵敏度。
蛋白质芯片联合表面加强激光解吸/电离-飞行质谱检测法。
表面加强激光解吸/电离-飞行质谱仪具有分析速度快、简便易行、样品用量少和高通量等特点，可直接检测各种体液如尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗脱液、细胞裂解液和各种分泌物等。
3.蛋白质芯片的应用
近来在蛋白质的固定、反应和检测等方面的研究进展为蛋白质芯片的走向成熟铺平了道路，许多研究者已经采用蛋白质芯片作为他们研究的工具。
目前，蛋白质芯片被研究人员应用到生命研究的各个领域，如利用蛋白芯片发现新的蛋白并且阐明其功能；寻找与疾病有关或直接引发疾病的新蛋白；发现新的药物靶标和肿瘤标记物。
3.1 蛋白质芯片与疾病的诊断
微阵列的ELISAs在疾病的诊断中有广泛的应用前景，可以同时检测生物样本中的多个指标，敏感度高且需要的样本量少，试剂的消耗量少。
在聚苯乙烯的96孔板上固定细胞因子抗体，在5∼50ul样本中可一次检测9种细胞因子，检测的灵敏度达到1∼10pg/ml，目前已有类似的细胞因子抗体芯片出现，一次可以检测50种细胞因子的表达，可以用于观测用药后病人对治疗药物的反应。
抗原和抗体的相互作用可以用来发现食物中的变应原，将已知的多种变应原制成芯片，然后用病人的血清和芯片反应，可以及时找到变应原。
通过和正常人血清反应芯片的比较，还可以更进一步研究过敏反应的机理，以及为什么不同个体对同种变应原有不同的反应。
3.2 肿瘤标志物的筛选与检测
近几年来，肿瘤的诊断与治疗虽然已经取得了巨大的进步，但是与人们的期望仍有距离，利用蛋白质芯片的高通量优点，可以使肿瘤标记物的发现和确认速度大大加快。
Roboz等采用SELDI-TOSMS技术，分析了大肠癌患者与正常对照之间的血清蛋白图谱之间的差异，其中大肠癌患者高表达8.9kD蛋白，而9.3kD的蛋白呈低表达，正常对照组上述两个蛋白的表达情况与患者组正好相反。
实验过程中用胰岛素作为内标参照。
根据质谱检测结果患者组8.9kD表达量为正常对照组的3倍。
实验结果表明8.9kD和9.3kD蛋白可作为检测大肠癌的肿瘤标记物。
Rosty等通过对胰腺分泌液的分析发现，67%(10/15)的胰腺癌患者和17%(1/7)的其它胰腺病患者出现16.57kD蛋白的高表达，免疫分析证实为肝癌-肠-胰腺/胰腺炎联合蛋白。
该蛋白≥20mg/ml时，患者患胰腺癌的可能性增大。
4 存在的问题和发展前景
蛋白质芯片将为生物化学和分子生物学提供强有力的工具，相对于DNA芯片研究的进展速度，蛋白质芯片的研究进展显得相对滞后，主要有以下问题待解决:(1)寻找材料表面的修饰方法；(2)简化样品制备和标记操作；(3)增加信号检测的灵敏度，如低拷贝蛋白质的检测和难溶蛋白质的检测；(4)高度集成化样品的制备及检测仪器的研制和开发。
这些问题不仅为蛋白质芯片技术增加了难度，同时也是蛋白质芯片能否从实验室推向临床应用的关键所在。
随着研究的不断深人和技术的更加完善，如表面化学修饰技术的进步，可以做到在载体上固定多种活性蛋白质；蛋白质工程可获得大量重组高特异性蛋白质用于芯片制作；纳米技术标记的引人可提高芯片检测的灵敏度。
蛋白质芯片技术可以对成千上万的蛋白质的活性、功能、相互作用进行分析，并且使检测系统小型化，大大节约了样本和试剂的用量，缩短了检测时间，提高了敏感性，使成本效益比大大降低。
蛋白质芯片技术作为一项有着广泛前途的新型技术，一旦投入实际应用，将在21世纪医学中的临床诊断、药物研究、环境检测、食
品工业等方面显示出巨大的应用前景和潜在的市场，随着其产业化和规模化的进程，蛋白质芯片技术将在生命科学及医学等领域显示出特有的优势。
参考文献
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