蛋白质芯片技术的研究与发展

生物与环境工程学院课程论文蛋白质芯片技术的研究与发展学生姓名：学号：课程名称：指导教师：浙江树人大学生物与环境工程学院2011年5月蛋白质芯片技术的研究与发展XXX（浙江树人大学生物与环境工程学院081班浙江杭州310015）摘要：蛋白质芯片是一种研究蛋白质组学的新技术，是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术，目前这一技术已经被广泛应用到生命科学研究的多个领域，如蛋白质组学研究，新药的开发以及疾病的临床诊断等，具体为用于构建蛋白质表达谱，进行受体一配体检测，靶目标和靶向药物筛选，蛋白质相互作用研究，肿瘤诊断等。

本文从蛋白质芯片的概念、基本原理、制备及检测方法、蛋白质芯片的应用及展望方面对其进行综述。

关键词：蛋白质芯片；制备；应用；发展前景生物芯片技术是20世纪80年代末才发展起来的，是一项融电子学、生命科学、物理学于一体的崭新技术，可分为DNA芯片、蛋白质芯片以及芯片实验室三类。

伴随着人类基因组计划(HGP)的顺利实施，业已产生的大量DNA序列数据刺激人们去发掘湮没于其间的“珍宝”——功能基因组数据。

因此，以生命活动的执行者和体现者——蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越显得重要。

蛋白质芯片的发展将会为蛋白质组学研究提供强有力的工具，从而推动疾病诊断、药物筛选、个性化药物的的生产和应用等发生重大革新。

因此，利用蛋白质芯片分析蛋白质功能就必然是一种趋势。

蛋白质芯片具有传统蛋白质检测技术所欠缺的优势，为蛋白质检测及蛋白质组学研究等方面开创了新的方式，对蛋白质检测及蛋白质组学研究等的发展期了推动作用。

虽然蛋白质芯片技术为人们的研究提供可很大的便利，但其本身还有一些不足的地方，所以对其本身的研究还有很大的发展空间，是继基因芯片后的又一种用于生命科学研究的技术平台。

1 蛋白质芯片的概况1.1 蛋白质芯片的概念现在的蛋白质芯片[1]是指在固相支持物(载体)表面固定大量蛋白探针(可以是抗原、抗体，受体、配体、酶、底物等)，形成高密度排列的蛋白质点阵。

利用这种芯片和含有未知蛋白质的液体(体液、细胞和组织提取物)进行孵育反应，反应后用相应的检测系统进行检测，最后应用计算机分析和比较相应蛋白质的表达情况。

1.2 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片主要分两种[2]：一种类似于基因芯片，即在固相支持物表面高密度地排列探针蛋白点阵，可特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。

虽然基因芯片技术已很完善，在生物医学研究领域获得了广泛的应用[3,4]，但这种以核酸为基础的芯片检测只能提供间接的信息。

而我们要了解遗传变异、药物或环境的变化对蛋白质水平和活性的影响，就必须直接对蛋白质进行研究。

所以他们虽有相似但蛋白质芯片有着自己的优势。

另一种就是微型化的凝胶电泳板，在电场作用下，样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来，经喷雾直接进入质谱仪进行检测，以确定样品中蛋白质的分子量及种类。

1.3 蛋白质芯片的特点蛋白差别表达和蛋白亲和性研究的传统方法，是将免疫亲和作用、液相色谱或电泳分离技术与放射性检测、光度法、质谱相结合。

蛋白质芯片相较于传统用于蛋白质分析的方法，具有以下优点，具体见表1[5]。

表1 蛋白质分析方式比较方式比较项目传统方式蛋白质芯片分析速度慢快灵敏度不太灵敏十分灵敏灵活性不太灵活灵活、方便样品用量不多极少通量低；只能看到丰度最高的蛋白质,而其他含量低的组分在分离和检测之前就已丢失高；可以实现成千上万个蛋白质样品的高通量平行分析,一次实验可提供大量数据信噪比一般高与产物联系程度一般高；直接联系2 蛋白质芯片的制备2.1 蛋白质芯片的基本原理[6,7]蛋白质芯片是一种新型的生物芯片，是将各种蛋白质有序地固定（微列阵法）于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，用未经标记或标记[8]（荧光物质、酶或化学发光物质等标记）的生物分子与芯片上的探针进行反应，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光物质将指示对应的蛋白质及其表达的数量，然后通过特定的扫描装置进行检测,结果由计算机分析处理。

2.2 蛋白质芯片的构建2.2.1 载体的选择蛋白质芯片的载体可沿用基因芯片的载体，主要有：滤膜类、凝胶类以及玻璃片类。

其中滤膜类和凝胶类与蛋白质或核酸结合的能力较强，无需特殊处理即可使用，具有蛋白质固定量大、蛋白质活性高及能够为蛋白质固定提供三维空间等优点，但这些载体往往蛋白质机械点样强度不高，同时由于膜具有渗透性和扩散性，点在上面的样品易发生扩散导致不同样品之间相互干扰。

与滤膜类和凝胶类载体相比较，玻璃片具有表面光滑、成本低、性能稳定等优点，为了使蛋白质能牢固地固定在玻片表面，玻璃片在制备芯片之前可经特殊处理（即对玻片的表面进行修饰[9]），使其疏水化但亲蛋白。

侯建伟等[10]的研究采用硅烷化[6]疏水性盖玻片作为实验材料取得了不错的实验结果，样点的点十分微小，构建的蛋白芯片，间距约为0.44μm，这也说明了片基的疏水化是实现芯片高密度化的前提。

2.2.2 探针蛋白的制备及点样通常用来制备芯片的蛋白质最好具有较高的纯度和完好的生物活性，所以点样前必须选择合适的缓冲液将蛋白质溶解。

崔振玲等[11]的研究中是采用含40%甘氨酸的PBS缓冲液，这可以防止溶液蒸发，使蛋白质在芯片的整个制作过程中保持水合状态，防止蛋白质变性。

蛋白质溶好后即可加入样品槽中进行点印。

点印时将载体固定到点样仪平台上，点样用的针头要用乙醇洗净风干后使用。

若用一个针头逐一点样，必须洗净风干后方可再用，以防止交叉污染。

为了防止芯片表面水分蒸发，造成点印不均匀或使蛋白质变性，点样应处于密闭且保持一定湿度的空间进行，封闭效果的好坏直接影响到蛋白芯片的检测效果或灵敏度[10,11]。

2.2.3 蛋白质的固定及芯片封阻[11]以膜为载体的芯片固定时放入湿盒中，37℃恒温 1 h即可，以乙醛基或BSA-NHS修饰的载玻片为载体的芯片，使载玻片表面的醛基与蛋白质的氨基反应,形成西佛碱,从而将蛋白质固定,这种方法适合固定较大的蛋白质分子。

而以聚丙烯酰胺凝胶修饰的载玻片为载体的芯片，可用戊二醛将凝胶激活从而与蛋白质形成连接。

对于糖蛋白，则可用酰肼代替酰胺将凝胶激活后与蛋白质上的多糖基团结合达到固定蛋白质的目的。

蛋白质固定后要将载体上其他无蛋白质样品区域封阻，以防止待测样品中的蛋白质与之结合，形成假阳性。

封阻所用的试剂主要有BSA和Gly两种。

封阻后,用PBST(含0.1% Tween 20的PBS)反复洗涤芯片,将多余的封阻剂洗去。

2.3 蛋白质芯片的检测目前，对于蛋白质芯片反应结果的检测有两类不同的检测方式：第一类是直接检测法，即直接对捕捉到的目的蛋白进行检测，这一类方法包括[5]表面加强纳米簇共振技术、表面等离子体共振法(SPR)、固相激光激发时间分辨荧光光谱法、表面加强激光解吸离子化-飞行时间质谱法(SELDI-TOF-MS)等。

其中以表面加强激光解吸离子化-飞行时间质谱法(SELDI-TOF-MS)[12]应用最为广泛，其原理是用激光解吸电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来，具体过程为：芯片经室温干燥后，加能量吸收分子，使其与蛋白质结成混合晶体，以促进蛋白质在飞行时间质谱检测中的解吸附和离子化，利用激光脉冲辐射使芯池中的分析物解吸形成荷电离子，根据不同质荷比这些离子在仪器场中飞行的时间长短不一，通过飞行时间质谱精确地测定出蛋白质的质量，并由此绘制出一张质谱图来，整个测定过程一般在几分钟内完成。

第二类是间接检测法，多数是将蛋白芯片与电喷雾离子化(ESI)、基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)质谱联用,直接质谱检测法(例如SELDI)蛋白质的检测限可达1fmol, SPR可达相近的灵敏度,而FPWG可达1ng/L。

3 蛋白质芯片的应用3.1 疾病的检测用蛋白质芯片可以绘制正常人和疾病患者体内的蛋白质图谱，通过对两者的比较找到在疾病中特异表达的蛋白质，然后将这些疾病中特异表达的蛋白质制成芯片，为癌症和其它传染性疾病等的诊断提供一种方法。

姜曼等人[13]利用SELDI-TOF-MS技术平台，检测血清中蛋白的质谱表达，结合人工神经网络对采集的数据进行生物学分析，建立了胃癌血清蛋白质质谱，并进行临床试验检测其效率。

实验结果表明，诊断模型检测胃癌的特异性为100%，敏感性为92.0%，准确率为95.8%，且该诊断模型对各期胃癌患者的预测能力无明显差异，检测效率均在85%以上，对I型胃癌甚至高达100%。

逄键涛[14]等人将蛋白质芯片用于检测HIV抗体，结果表明该法检测阳性、阴性血清的正确率高达100%，且灵敏度相当，具有快速、成本低、信号稳定、操作简便等特点。

3.2 生物活性的分析组织、细胞中的生物组分及含量不同，且同一组织或细胞在不同时期的生物组分也均不相同，为了能更好地利用相关技术来解决许多难治愈疾病对患者造成的痛苦，并达到治愈疾病的目的，好的生物组分及活性的分析方法是十分重要的。

唐悦等人[15]应用蛋白质芯片技术对脐浆血的生物活性进行分析，并与成人静脉血的生物活性进行对比，发现脐浆血的生物活性远远高于静脉血，这在帕金森症、运动神经元疾病和脊髓及周边损伤的等的疾病治疗中有很大的潜力。

3.3 新药的研制开发在许多新药的开发[16]过程中，往往到了临床检验阶段才发现其具有很大的副作用而无法成为新药，这对前期的研究工作造成很大浪费。

利用蛋白质芯片在药物研制初期就可检验该药物是否只与某一蛋白质结合而不与其它蛋白质结合，从而确定该药是否有副作用。

这便于早发现问题，有利于开发无副作用的新药。

4 蛋白质芯片的发展前景作为一种新兴的蛋白质组学研究手段，蛋白质芯片技术具有传统的蛋白质研究方法无法比拟的高通量、快速、平行、自动化等优点，这一方法的建立和应用可为基因组学、蛋白质组学等基础研究提供强大的技术支持，从而将极大地推动人类揭示疾病发生发展的分子机制及寻找更合理有效治疗的进程；同时，基因组学和蛋白质组学研究的不断深入也将为蛋白质芯片技术提供更为丰富的研究资源。

但是由于蛋白质本身的变化太多，且空间构象在很大程度上决定其活性与功能,，对于目前基因芯片研究的进展速度而言，蛋白质芯片的研究显得相对滞后。

目前亟待解决的问题主要有[17]：①片基的制备：寻找更好的固相载体表面修饰方法，尽可能保持结合蛋白质的生物学活性；②样品的制备：目前的蛋白质芯片检测水平对样品蛋白的纯度有较高的要求，这就对蛋白质芯片从实验室走向临床带来了困难。

临床的检测物质，如尿液、唾液、血液、腹水等，成分复杂，直接与芯片反应,难免会发生信号干扰,信号强度也较弱。

③提高检测灵敏度，解决低拷贝蛋白质和难溶蛋白质的检测问题；④降低检测成本，并实现检测、分析完全自动化。