蛋白质工程

三、蛋白质工程的进展与前景
• 蛋白质工程目前的现状：成功的例子不 多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要 依赖于正确的空间结构，而科学家目前 对大多数蛋白质的空间结构了解很少。
你知道酶工程吗？绝大多数酶都是蛋白质， 酶工程与蛋白质工程有什么区别？
• 酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借 助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊 断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地 说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组 成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻 工业以及医药工业中。 • 通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而 没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然 后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列 等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的 合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对 已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白 质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中， 使酶工程成为蛋白质工程的一部分。
不存在的蛋白质。
干扰素（半胱氨酸）
体外很难保存
改造
干扰素（丝氨酸）
体外可以保存半年
满足人类 生产和生 活的需要
玉米中赖氨酸含量比较低 天冬氨酸激酶 （352位的苏氨酸） 二氢吡啶二羧酸合成酶 （104位的天冬酰胺）
改造
玉米中赖氨酸含量可提高数倍 天冬氨酸激酶（异亮氨酸）
改造
改造
二 作简单经济
操作复杂， 周期长
修饰过程破 坏酶分子
适应所有酶，稳 定性高，可重复 利用和连续生产 稳定性好，载量 高，催化效率高 简单、经济
适用于特殊反应 体系和酶类
载量较低， 易失活 成本高 工作量大
适合的酶类 还不普遍
交联酶晶 体 微环境改良 稳定剂
反应介质
1）改造酶分子 酶的稳定性从本质上讲是氨基酸组成和各种作 用力综合的结果。 蛋白质工程：用DNA水平上设计酶分子 化学修饰：通过化学试剂特异性修饰酶分子的 某个氨基酸，从而稳定蛋白质的构象，提高耐 热性或其它稳定性。
由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启 动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共 和国、日本和我国科学家共同参与了这一计划。 2000年完成了人类基因组“工作框架图”。2001年 公布了人类基因组图谱及初步分析结果。
它是指对人类基因组进行碱基对的测序。 因为人类体细胞中有22对常染色体，每对染色体中 的两个DNA分子结构基本相同，又由于X和Y这两个性 染色体中DNA分子结构有较大差异，需要各自单独测 序；所以对人类基因组测序实际上是指对人类体细 胞中一套常染色体（22个）和X、Y这两个性染色体 中共24个DNA分子的测序。
2）非共价键：
疏水相互作用（hydrophobic interaction ）:
是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。
氢键（hydrogen bond）：
是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构 的重要力量。
静电相互作用（electrostatic interaction）：
又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作 用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分 子表面上。 范德华力：
2)热稳定性的提高
• 作业: • 蛋白质工程操作程序的基本思路与基 因工程有什么不同? • 蛋白质工程与基因工程相比,合成的蛋白 质有何特点?
酶的稳定性
1.酶稳定的分子原因 1）共价键：
肽键（peptide bond） ——稳定蛋白质和酶主链的核心力量。 二硫键（disulfide bond） ——由两个Cys的侧链-SH氧化而成，是某些蛋白 质维持结构稳定性的主要因素。
想一想
• 要想让一种生物的性状在另一种生物中 表达,在种内可以进行什么办法实现? • 要使有生殖隔离的种间生物实现基因交 流应用什么方法?
一、蛋白质工程崛起的缘由
通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存 在的活性物质，并借助转基因而改变动植物性状， 得以在人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。 然而在广泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现， 这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对它们进 行产业化开发往往不合意，需要加以改造。1983年 Ulmer首先提出蛋白质工程，它是指按照特定的需 要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此以 后，蛋白质工程迅速发展，已成为生物工程的重要 组成部分。
蛋白质工程是在基因工程的基础 上，延伸出来的第二代基因工程。
联系旧知识：
中心法则：
复 制 转录 DNA 逆转录 复 制 RNA 翻译
蛋白质
天然的蛋白质合成过程按照中心法则进行：
基因
表达（转录和翻译） 形成氨基酸序列的多肽链
形成具有高级结构的蛋白质
行使生物功能
2.原理：中心法则的逆推 3.基本途径： 从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）
温故知新 蛋白质的结构及其多样性
蛋白质多样性原因
①氨基酸种类不同，肽链结构不同 ▥-▥-▥-▥-▥-▥-▥-▥-▥-▥ ▧-▧-▧-▧-▧-▧-▧-▧-▧-▧ ▩-▩-▩-▩-▩-▩-▩-▩-▩-▩ ②氨基酸数目成百上千，肽链结构不同 ③氨基酸排列顺序千变万化，肽链结构不同
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蛋白质结构测定
一级结构测定： •直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。 •间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导 蛋白质的氨基酸顺序。
三级结构测定：
•X-射线晶体衍射——研究处在晶体状态下的蛋白质
的空间结构
•核磁共振(NMR)光谱——研究处在溶液状态的蛋白 质的结构。
X-射线衍射技术：
用于蛋白质及核酸三维结构的确定，至今已有数 百种蛋白质的结构被确定。



固定化：通过化学或物理方法，将溶解 性的酶与不溶性的固体支持物结合或用 固体包埋。 交联酶晶体：无载体稳定酶的技术。 稳定性增加的主要原因：酶分子的晶体 结构及共价交联。 制备的两个步骤：酶的分批结晶和晶体 的化学交联。
④肽链空间结构千差万别，蛋白质种类不同
蛋白质的功能
1、构成细胞和生物体结构的重要物质 2、绝大多数酶是蛋白质，催化细胞内的 化学反应 3、有些具有运输载体功能 4、信息传递作用，调节机体的生命活动 5、免疫功能
二、蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律 及其与生物功能的关系作为基础，通过基 因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改 造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对 生产和生活的需求。 前提： 了解蛋白质的结构和功能 原理： 改造基因（基因修饰或基因合成） 目的： 定向改造或制造蛋白质
四、蛋白质工程改造的实际应用
1.枯草杆菌蛋白酶 1）增强抗氧化性
枯草芽胞杆菌蛋白酶已被发展为商用的纺织品洗
涤剂，但实践中发现早期生产的枯草芽胞杆菌蛋白酶
的洗涤剂无法与漂白剂共同使用。 因为漂白剂会使蛋白酶失活。造成这种失活 的分子本质是，枯草芽孢杆菌蛋白酶的第222位的甲硫 氨酸残基（Met－222）发生了氧化作用，它可使该酶
的活性丧失90%。
为解决这一问题，科学家用其它19种氨基
酸置换第222位的甲硫氨酸，得到19种蛋白质工 其活性超过野生型，遗憾的是它同样会被漂白剂
所氧化，若以Ale取代Met-222，虽然其活性仅为 野生型的53%，但其抗氧化性大大增强，可以同 漂白剂联合使用。
程蛋白酶。蛋白酶活性检测显示，以Cys取代Met，
你知道国际人类蛋白质组计划吗？
人类蛋白质组计划是继人类基因组 计划之后，生命科学乃至自然科学领域 中的一项重大的科学命题。2001年，
国际人类蛋白质组组织宣告成立。
之后，该组织正是提出启动两项重大国 际合作行为：一项是有中国科学家牵头 执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另 一项是以美国科学家牵头执行的“人类 血浆蛋白质组计划”。
突变点： 人工合成的引物上 手段： PCR技术
目的： 获得定点突变的基因
基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。
高通量筛选法：从巨大数目的突变体库中
筛选到具有期望功能的突变体。
基因剪接：在酶分子的编码基因上剪去或
接上一段核苷酸。
讨论
• 某多肽链的一段氨基酸序列是:-丙氨酸色氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸－苯丙氨酸－ • 讨论１、怎样得出决定这一段肽链的脱 氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写 出来。 ２、确定目的基因的碱基序列后，怎样才 能合成或改造目的基因（ＤＮＡ）
在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成
的范德华力越大越稳定。
金属离子：
Ca2+、Mg2+和Zn2+等高价阳离子与多肽链不稳定 的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。
2. 稳定酶的方法
途径 方法 优点 不足
酶 核酸水 蛋白质工 平 程 分 子 蛋白质 化学修饰 改 水平 造 剂型 固定化
从根本上提高酶 分子稳定性
蛋白质工程的主要手段
以重组DNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。
位点特异性突变——基于结构生物学、信息生物
基因突变
随机突变——基于高通量筛选法
基因内部的剪接 基因剪接 5‘或3’端的剪接
位点特异性突变：通过特异地改变编码核苷酸；而替 代蛋白质中的某个氨基酸。可高效、准确地得到蛋白 质突变体。但这种方法得到的突变体数量有限，因此 在ＤＮＡ操作技术的带动下，发现了随机突变法。
异想天开
能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因， 导入合适的细菌中，让细菌生产人类所需要的蛋白质食 品呢？ 理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。 一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是 自然界已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出 来而自然不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高 级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构和在生 物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭 新而又具有生命功能作用的蛋白质，而且一个崭新 的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的。