染色体制备实验
染色体 实验报告
染色体标本的制备及组型实验生命科学学院张瀛【实验目的】1．掌握染色体标本的制作方法。
2．认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组型图。
【实验用品】小白鼠，秋水仙素，生理盐水，0.3%KCl液，固定液，铜网，酒精灯，离心机，注射器，剪刀，镊子，载玻片，滴管，显微镜等。
【实验原理】染色体标本制作的原理细胞分裂中期染色体形状较为清楚，故使用中期细胞，并以每条染色体相对独立存在为染色体标本制作的四大要点1）PHA：促细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变为淋巴母细胞。
2）秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停止在分裂中期。
（相同作用：秋水仙胺、长春碱、鬼臼素）3）低渗作用：水进入细胞内，使细胞内容空间变大，染色体间的距离拉大，易于染色体分散开。
4）空气干燥：使细胞和染色体展开。
5）固定：用camoy`s solution（甲醇：冰醋酸=3:1）作用使蛋白质变性，对染色体内的组蛋白来说，变形后硬度增加，保持了染色体的“即时形态”，对细胞膜蛋白来说，变形使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。
染色体标本制作的意义根据染色体的特征（数目、形态、大小等）制作染色体组型图。
染色体标本制作的应用1） 生物学方面：根据染色体特征鉴别生物及种类。
染色体数目：兔-44条，猫-38条，狗-78条，马-64条，人-46条，小鼠-40条（18对端着丝粒染色体，第17、18对为亚端着丝粒染色体），大鼠-42条，鸡-78条。
2） 临床医学方面：主要用于遗传性疾病的诊断及研究。
因此，染色体组型实验广泛应用于胎儿遗传性疾病早期诊断中（抽取羊水）。
染色体组型把真核生物的一个体细胞中的各个染色体按其长度、形状和着丝粒的位置排列成一定顺序的过程，即为染色体组型。
染色体核型染色体组型是染色体核型的模式表达。
染色体组型及分群依据主要根据染色体的相对长度，着丝粒的位置，其次是臂的长短，以及次级缢痕或随体的有无等方面。
人类外周血染色体标本制备
14、染色（ Giemsa staining） Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。 15、镜检（microscopic examination）
四、试剂和药品 1、 培养液的配制 RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80％
小牛血清(56℃水浴灭活30分钟)
植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质) 青霉素终浓度 链霉素终浓度
10、再固定： 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰3），固定 20分钟。
11、再离心
1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。
12、再固定 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰1）打匀，固定 20分钟。
13、制片
固定后， 1000rpm离心10分钟，留下 0.2ml 沉淀物，吸取细胞 悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯 焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（dir drying）。
5、 甲醇 （ methanol ）
6、 冰醋酸 （acetic glacid）
二者以不同比例配合使用
新鲜配制
７、吉姆沙染液（Giemsa）
吉姆沙由天青、伊红和甲基蓝组成 先将0.5克吉姆沙粉未干研磨，加33毫升60℃预热的纯甘油，在研钵 中研磨，在60℃水浴中保温90分钟。冷却后，再加入33毫升甲醇，滤纸 过滤，收集在棕色瓶中保存。原液要提前半年配制。原液中按比例加入 磷酸缓冲液即可染染色体标本。
1份Giemsa原液＋ 9份磷酸缓冲液
８、磷酸缓冲液(pH 6.8)
溶液A：磷酸二氢钾 (KH2PO4.2H2O) 9.078克溶于1000毫升蒸馏水中。 溶液B：磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O) 11.876克溶于1000毫升蒸馏水中。 100毫升缓冲液：需溶液Ａ50.8毫升，溶液Ｂ49.2毫升。
骨髓染色体r显带制备实验流程
骨髓染色体r显带制备实验流程
一、实验目的
通过骨髓细胞染色体G显带的制备,观察染色体形态,掌握骨髓细胞染色体G显带制备的基本方法。
二、主要仪器和试剂
1.细胞培养箱、倒置显微镜、低温高速离心机、水浴、恒温培养箱、微量吸液器等仪器设备。
2.RPMI 1640培养基、胎牛血清、秋水仙素、KCl、固定液、 Giemsa 染色液等。
三、实验步骤
1.取患者骨髓液,加入RPMI 1640培养基,接种细胞,孵育72小时。
2.加入秋水仙素进行细胞周期同步,继续培养4-5小时。
3.收集细胞,低速离心,弃上清。
加入0.075M KCl hypotonic solution,37°C水浴20分钟。
4.1000r/min离心5分钟,弃上清,加入新配制固定液,混匀。
5.4°C固定过夜。
6.将固定后的细胞涂片,自然风干。
7.苏木精-伊红染色液染色,显微镜下观察染色体形态。
四、实验结果
成功制备出骨髓细胞染色体G显带,在显微镜下可清晰观察到染色体形态。
染色体制备的实验原理
染色体制备的实验原理
染色体制备是一种从细胞中提取染色体的方法，通常用于研究染色体的结构和功能。
以下是染色体制备的基本原理：
1. 细胞收集：选择需要研究的细胞类型并进行培养，使其增殖到足够数量。
2. 处理细胞：细胞在特定条件下被处理，以使染色体膨胀并保持其形态和结构。
3. 染色：染色体被染色以提高其可视性。
不同的染料和处理方法可用于不同类型的研究。
4. 制备幻灯片：染色体被放置在玻璃幻灯片上，并用显微镜观察。
通过染色体制备，可以观察染色体的形态、大小、数量、分布等特征，并进一步研究其在遗传学和细胞生物学中的作用。
染色体的制备方法
染色体的制备方法
染色体的制备方法主要有以下几种：
1. 细胞培养法：通过细胞培养的方法，从活体或死体组织中获得细胞，然后使用染色体解链剂和有机溶剂处理细胞，使其逐渐膨胀、变形和破裂，最终释放出染色体。
2. 细胞分离法：通过细胞分离的方法，从组织或器官中获得单个细胞，然后使用低渗透压溶液处理细胞，使其逐渐肿胀、破裂，最终释放出染色体。
3. 放射线照射法：通过将细胞暴露在放射线（通常是X射线或γ射线）下，使染色体发生断裂和破裂，然后使用染色体解链剂溶解细胞核膜和蛋白质，最终得到染色体。
4. 高压法：通过将细胞置于高压环境中，如用注射器将细胞悬浮液喷射到高压室中，或使用高压装置将细胞悬浮液注入对高压有抵抗能力的微孔滤纸上，然后用染色体解链剂处理细胞，最终释放出染色体。
5. 集落法：将细菌或酵母等微生物的细胞培养在富含染色体的培养基上，然后使用染色体解链剂处理细胞，最终从细胞中释放出染色体。
这些方法各有优点和局限性，选择合适的染色体制备方法要根据研究目的和样本
的特点来确定。
实验一 植物染色体制备和观察
实验一植物染色体制备和观察
一、实验目的
1．学习植物染色体制片技术；
2．通过观察染色体在有丝分裂过程中，了解染色体的动态变化；
二、实验准备
（按每实验小组2人准备）
1．仪器
显微镜1台、水浴锅（大组合用一）、冰箱1、培养箱1、干燥箱1
2．器械（均放在小磁盘内）
镊子2、解剖针2、剪子2、50ml烧杯1、吸管1、玻片架1
3．药品（4人一套）
醋酸洋红、1mol HCl、二甲苯（通用）[均分装在60ml滴瓶]、蒸馏水10L（通用）4．耗材
载玻片4、盖玻片6、滤纸2、擦镜纸1本（通用）、
5．材料
洋葱或大蒜根尖（预先生根、固定、低温保存）
三、实验原理
温盐酸处理根尖的作用：
1．可破坏植物细胞间的连接物质，使细胞分散；
2．可破坏细胞壁，使根尖细胞软化，有利于压片；
3．使DNA潜在的醛基得以暴露，能被碱性染料染色，使整条染色体能均匀着色。
四、实验步骤
大蒜生根1cm→9:00固定→第二天9:00保存于75%酒精4℃→取根尖→水洗→1mol HCl 60℃处理8min→水洗→取一根尖置于干净载玻片上→取分生区→夹碎→滴染液1d染色→8min（搅拌至碎）→盖盖玻片→轻敲分散→覆盖滤纸→带液速压→吸去多余染液→观察→高倍镜下绘图
五、作业
1．温盐酸处理根尖的作用是什么？
2．绘图：间期、前期、中期、后期、末期实景图。
实验九小鼠骨髓细胞染色体标本制备
四、实验步骤
1、预处理：实验 。作用：
2、处死动物：断颈处死小白鼠， 解剖小鼠内生殖器官，鉴别雌雄性别
3、取股骨：剥取股骨，剔去肌肉 组织，剪去两端的股骨头。
11、滴片：用吸管吸取细胞悬液， 滴在预冷的载玻片上，在酒精灯火焰 上微微加热，室温晾干。预冷载玻片 的作用：
12、染色：10% Giemsa染液染色30分 钟。
13、镜检：低倍———高倍 。
五、作业
1、选择染色体清晰，分散好的 中期分裂相，计数染色体，显微摄影、 并打印出照片。
2、分析成功或失败的原因。
4、取骨髓：注射器吸取0.6ml生 理盐水, 针头插入股骨一端,反复冲 洗骨髓到10ml的离心管中。
5、低渗：加入4.4ml的 0.075MKCl溶液,在37oC水浴中低渗40 分钟，中间（约20分钟时）用吸轻轻 管吹打，使细胞充分低渗。低渗作用
6、离心：离心之前加1ml固定液 并用吸管轻轻吹匀，进行预固定；
同时秋水仙素作用能使染色体缩短、 变粗。
三、实验材料、器具和药品：
1、材料： 小白鼠 2、器具：
注射器（1ml,5ml）、5号针头、 解剖盘、解剖剪、镊子、玻璃吸管、 10ml刻度的离心管、离心机、载玻片 盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、棉 花、量筒、天平、恒温水浴锅等。
3、药品： 0.01%秋水仙素、0.075MKCl、
一、实验目的
1、掌握哺乳动物（小白鼠）骨 髓细胞染色体制片技术。
2、并对动物染色体进行观察。
二、实验原理
1、小鼠四肢骨内骨髓细胞中的造 血干细胞是生成各种血细胞的原始 细胞，具有高度的分裂增殖能力。
实验五 人类染色体标本制备
实验五人类染色体标本制备【目的要求】1．熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。
2．初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。
3．了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。
【实验原理】人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。
在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集，表现为短而粗的典型结构。
人外周血的有形成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞(主要是小淋巴细胞)具有潜在的细胞分裂能力。
培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素(PHA)可使处于G0期、具有潜在分裂能力的淋巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，并进入旺盛的有丝分裂周期；加入纺锤体抑制剂秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂0.075mol/L KCl对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等过程，最终可获得便于观察分析的染色体标本。
制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色，在显微镜下观察识别，并进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。
【实验用品】(一) 材料：人外周静脉血。
(二) 器材：吸管、刻度离心管、量筒、5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、冷藏载玻片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒精棉球、显微镜、废液缸。
(三)试剂1. RPMI1640培养液(1) RPMI1640：RPMI1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，抽滤除菌。
(2) RPMI1640培养液：每100 ml RPMI1640培养液中含RPMI 1640 80 ml、灭活的小牛血清20 ml、PHA 50 mg、青霉素(终浓度100 U/ml)、链霉素10000 μg (终浓度100 μg /ml)，15磅、20min高压灭菌的NaHCO3调pH至7.2～7.4，分装20小瓶，每瓶5 ml。
(3) 配制方法配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡2 d，取出后用自来水冲洗15次，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗1次，烤干后包装，15磅20 min高压灭菌。
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——染色体制备
覃钦博 博士 湖南师范大学生命科学学院 鱼类ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ育生物学实验室
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1.刺激淋巴细胞的有丝分裂 刺激淋巴细胞的有丝分裂
对实验鱼注射PHA 3次，每次剂量为 体重， 对实验鱼注射 次 每次剂量为8-10 µg/g体重，每一针 体重 PHA的效应时间分别为 的效应时间分别为12h、4h和2h; 的效应时间分别为 、 和 原理：植物血球凝集素（ 原理：植物血球凝集素（PHA）能刺激 淋巴细胞有丝分裂 ）能刺激B淋巴细胞有丝分裂 ，但是过量使用PHA能导致血液凝聚。 但是过量使用 能导致血液凝聚。 能导致血液凝聚
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3.取材 取材
将实验鱼剪鳃放血，从泄殖腔沿腹部剖开实验鱼， 将实验鱼剪鳃放血，从泄殖腔沿腹部剖开实验鱼，从相应 部位取出肾脏组织（包括前肾和中肾脏）；放入盛有0.8%的生 部位取出肾脏组织（包括前肾和中肾脏）；放入盛有 前肾和中肾脏）；放入盛有 的生 成糊状） 理盐水的培养皿中清洗，用剪刀充分剪碎（ 理盐水的培养皿中清洗，用剪刀充分剪碎（约3min成糊状）材 充分剪碎 成糊状 料后移于离心管中，充分吹打（ 料后移于离心管中，充分吹打（3min)；将离心管中的生理盐水 ； 加至10ml后，静置5-8min。 加至 后 静置 。
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4.低渗 4.低渗
将样品1000 rpm离心 离心5min，弃上清液；收集的细胞沉淀 将样品 离心 ，弃上清液； 在低渗液（ ），充分吹打使沉淀均匀分散 在低渗液（0.075 M Kcl），充分吹打使沉淀均匀分散，加低 ），充分吹打使沉淀均匀分散， 渗液至10ml，低渗30-40 min；低渗过程中每隔 分钟轻轻吹 ，低渗 分钟轻轻吹 渗液至 ；低渗过程中每隔5分钟 打溶液，使其充分低渗。 打溶液，使其充分低渗。
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此时细胞体积膨大，处于一个极其容易破裂的状态。 此时细胞体积膨大，处于一个极其容易破裂的状态。 破裂的状态
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5.固定 固定
低渗后将样品1000 rpm离心 离心5min，收集沉淀；加入甲醇和 低渗后将样品 离心 ，收集沉淀； 冰醋酸(3:1)混合液，轻轻吹打样品沉淀，使其充分散开； 冰醋酸(3:1)混合液，轻轻吹打样品沉淀，使其充分散开；加 (3:1)混合液 样品沉淀 充分散开 入固定液至5ml，并静置15分钟 ，使其充分固定；样品再离心、 使其充分固定；样品再离心、 入固定液至5ml，并静置15分钟 5ml 15 再固定，重复1次后，样品可长期保存（4℃）。 再固定，重复1次后，样品可长期保存（4℃）。 可长期保存
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2.抑制淋巴细胞有丝分裂 2.抑制淋巴细胞有丝分裂
注射秋水仙素， 体重。 在解剖取材前的2h注射秋水仙素 剂量为2-4 µg/g体重。 体重 在解剖取材前的 注射秋水仙素，剂量为
原理：秋水仙碱能破坏纺锤体，是分裂的细胞处于有丝分裂中期。 原理：秋水仙碱能破坏纺锤体，是分裂的细胞处于有丝分裂中期。 纺锤体 有丝分裂中期