益髓生血颗粒血清UPLC特征图谱研究_孙玉雯

“973 ”计 划 （ 2010CB530406 ） ； 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 （ 81173167） 作者简介： 孙玉雯（ 1979 － ） ，女，执业药师，博士，研究方向： 中药制剂及 药效物质基础研究。 通讯作者： 吴志奎，研究员，主要从事地中s of human ovarian cancer［J］． Proc Natl Acad Sci USA，2007， 104（ 9） ： 3360 － 3365． ［2］ Hirano F，Kaneko K，Tamura H，et al． Blockade of B7 － H1 and PD － 1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity ［J］． Cancer Res，2005，65（ 3） ： 1089 － 1096． ［3］ Xiao H，Huang B，Yuan Y，et al． Soluble PD － 1 facilitates 4 － 1BBL － triggered antitumor immunity against murine H22 hepatocarcinoma in vivo ［J］． Clin Cancer Res，2007，13（ 6） ： 1823 － 1830． ［4］ 吴远文，吴勋，孙红祥． 白藤梨提取物抗肿瘤作用的研究［J］． 医学 信息，2010，11（ 23） ： 157 － 159． ［5］ Xu HS，Wu YW，Xu SF，et al． Antitumor and immunomodulatory activity of polysaccharides from the roots of Actinidiaeriantha ［J］． J Ethnopharmacol，2009，125（ 2） ： 310 － 317． ［6］ 白吉庆，王小平，叶峥嵘． 藤梨根提取物对人胃癌 SGC － 7901 细 胞凋亡及 Bcl － 2 的影响［J］． 陕西中医学院学报，2012，35（ 1） ： 59 － 61． ［7］ 王小平，白吉庆，叶峥嵘． 藤梨根提取物对裸鼠移植人胃癌 SGC － 7901 细胞瘤 p53 基因蛋白的影响［J］． 现代中医药，2012，32（ 1） ： 56 － 57． ［8］ 孙雪飞，裴艳涛，尹秋伟，等． 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌 A549 细胞凋亡的诱导作用［J］． 山东医药，2011，51（ 37） ： 19 － 21． ［9］ Wang S，Chen L． Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7 － H1 / PD － 1 cosignalpathways［J］． Curr Top Microbiol Immunol，2011，344： 245 － 267． ［10］ Topalian SL，Hodi FS，Brahmer JR，et al． Safety，activity，and immune correlates of anti － PD － 1 antibody in cancer［J］． N Engl J Med， 2012，366（ 26） ： 2443 － 2454．
但是其毒 副 作 用 大，大 部 分 的 中 晚 期 患 者 无 法 耐 受。 中药的毒副作用小，能否下调 PD － L1、PD － L2 分子表 达，在肿瘤 免 疫 逃 逸 方 面 发 挥 作 用，目 前 研 究 鲜 有 报 道。本研究 结 果 表 明，白 山 毛 桃 根 提 取 物 可 以 抑 制 M21 增殖，同时可以下调 M21 细胞 PD － L1、PD － L2 mRNA 和蛋白的表达，但是其在体内的疗效还不清楚， 接下来还要构建动物模型继续研究； 除此之外，白山毛 桃根提取物是否可以诱导 M21 细胞凋亡、阻滞 M21 细 胞周期，目前也在研究当中。此外，白山毛桃根提取物 除了对黑色素瘤 M21 细胞有增殖抑制作用以外，对脑 胶质瘤细胞 U251、乳腺癌 MCF － 7 细胞也均有增殖抑 制作用，那么其分子机制又如何呢？ 还不清楚； 是否也 是通过影响 PD － L1、PD － L2 分子表达而起作用，还需 要进一步的研究。
关键词： 益髓生血颗粒; 特征图谱; 化学成分; 血清 中图分类号： R285． 5 文献标志码： B 文章编号： 1000 － 1719（ 2013） 10 － 2104 － 03
UPLC Characteristic Chromatograms of Serum with Yisui Shengxue Granule
SUN Yuwen，ZOU Yang，LIU Li，CHENG Yanling，LI Junli，WU Zhikui （ Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China）
Abstract： Objective： To establish the characteristic chromatograms of serum with Yisui Shengxue Granule，and analyze and identify its chemical compositions absorbed into blood． Methods： SD rats were orally given Yisui Shengxue Granule of various concentrations． The medicinal serum samples were separated and detected with UPLC． The analysis methods of UPLC characteristic chromatograms of Yisui Shengxue Granule and medicinal serum were established． The characteristic chromatograms of the whole formula of Yisui Shengxue Granule and medicinal serum were analyzed，and the chemical compositions，original crude medicinal and metabolites in blood were compared and identified． Results： It showed the drug concentration was increased； the transitional
辽宁中医杂志 2013 年第 40 卷第 10 期
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type of component that could be detected in blood was increased，increasing the content of component． The types of chemical compositions in the blood of rat fed high concentration’s Yisui Shengxue granule were more 13 than the types of chemical compositions of the control group，among them 4 were original compositions and 9 were metabolites． The results of UPLC showed that the original compositions were kaempferol and isopsoralen，which came from Radix Astragali． Conclusion： The chemical compositions and metabolites in blood may be the drug － like compositions with the directactions in vivo，which come from the ingredients of Yisui Shengxue Granule．
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辽宁中医杂志 2013 年第 40 卷第 10 期
益髓生血颗粒血清 UPLC 特征图谱研究
孙玉雯，邹阳，刘莉，程燕玲，李俊丽，吴志奎
（ 中国中医科学院广安门医院，北京 100053）
摘 要： 目的: 建立益髓生血颗粒的血清特征图谱，并分析鉴定其体内吸收入血化学成分。方法: 取 SD 大鼠，灌胃给 予不同浓度的益髓生血颗粒，分离含药血清，UPLC 法测定，建立益髓生血颗粒含药血清的 UPLC 图谱分析方法; 分析益 髓生血颗粒提取物及其含药血清特征图谱; 比对鉴定血中成分及其代谢产物。结果: 随着药物浓度的提高，血中可检出 的移行成分的种类增加，含量提高。高浓度益髓生血颗粒灌胃给药后与空白血清相比，多了 13 个移形成分，其中 4 个为 原型成分，9 个为代谢产物，原型成分有来源于补骨脂的补骨脂素、异补骨脂素。结论: 血中成分及代谢产物可能为益髓 生血颗粒体内直接作用的类药成分，其分别来源于益髓生血颗粒的组成药味。
参考文献 ［1］ Hamanishi J，Mandai M，Lwasaki M，et al． Programmed cell death 1
ligand 1 and tumor-infiltratingn CD8 + T lymphocytes are prognostic
收稿日期： 2013 － 04 － 16 基金项目： 中药新药大平台研发品种（ 2009ZX0931 － 005 － 2 － 7 ） ； 国家
Key words： Yisui shengxue Granule； characteristic chromatogram； chemical composition； serum
“血清药物化学”的概念［1］ 由日本学者田代真一 提出，随后，我国学者王喜军教授［2］进一步完善了中药 血清药物化学的概念，其目的在于研究血清中的化学 成分，阐明中药复方的药效物质基础［1 － 3］。益髓生血 颗粒是中国中医院研究院广安门医院吴志奎教授依据 中医“肾生髓、髓生血”理论，以补肾益髓法组方而成， 该药具有滋阴补肾、益髓生血、补气健脾之功效，主治 肾脾两虚，精血不足证。目前临床上用于各种贫血症 特别是地中海贫血的治疗，在广西地贫高发区用药近 30 年，取得肯定的可重复的临床疗效［4 － 8］。本文采用 血清药物化学的研究方法，通过与对照品及益髓生血 颗粒提取物 UPLC 谱图的比较，探讨益髓生血颗粒的 入血成分，寻找可能的药效物质基础，为该药的作用机 制研究奠定基础。 1材料 1. 1 仪器与试剂 Waters Acquity H － Class UPLC 超 高效液相色谱仪： 四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二 极管阵列检测器以及 Empower 2 工作站（ 美国 Waters 公司） ； 甲醇、磷酸（ 均为分析纯，北京化学试剂公司） ； 乙腈（ 色谱醇，fisher chemical，4 L） ； 屈臣氏蒸馏水。 1. 2 样品 实验用的益髓生血颗粒系中国中医科学 院广安门医院制剂中心生产提供，批号： 20110801，深 褐色颗粒，含 2. 36 g 生药 / g 药粉。 1. 3 对照品 补骨脂素（ 批号： 110739 － 200613） 、异 补骨脂素（ 批号： 110738 － 201012） 均购自中国药品生 物制品检定所。 1. 4 动物 健康雄性 SD 大鼠，体重（ 200 ± 20） g，军 事医学科学院实验动物中心提供，实验动物生产条件 许可证编号为 SYXK － （ 军） 007 － 004，实验动物合格 证号 SCXK － （ 军） 007 － 004。 2 实验方法及结果 2. 1 益髓生血颗粒灌胃样品溶液的制备 取益髓生 血颗粒，加水溶化，调整颗粒加入量，分别配成高、中、 低剂 量 组，各 灌 胃 样 品 组 含 生 药 量 分 别 为： 0. 944 g / mL、0. 708 g / mL、0. 354 g / mL。 2. 2 对 照 品 溶 液 的 制 备 分 别 取 补 骨 脂 素 （ 0. 13 mg / mL） 0. 5 mL、异补骨脂素（ 0. 176 mg / mL） 对照品 0. 5 mL 加甲 醇 定 容 至 10 mL，0. 2 μm 的 微 孔 滤 膜 滤 过，滤液作为混合对照品溶液。 2. 3 血清样品的制备 80 只 SD 大鼠随机分为 4 组。 各给药组分别以 2 mL /200 g 体重量灌胃上述益髓生 血颗粒各 浓 度 灌 胃 药 液，正 常 组 给 予 等 量 生 理 盐 水。 每次间隔 12 h，连续给药 3 d。于最后一次给药 1 h 后， 用乙醚麻醉心脏采血，离心分离血清，分别得益髓生血 颗粒各浓度含药血清和空白血清样品。血清样品置 － 20℃ 冷冻备用。 2. 4 血清供试品的制备 取 1 mL 各浓度血清样品及